הכנת מטריצות תלת ממדיות דה-צלולריות משריר השלד של עכבר העובר לתרבית תאים
Summary
בעבודה זו, פרוטוקול דה-צלולריזציה עבר אופטימיזציה להשגת מטריצות דה-צלולריות של שרירי השלד של עכבר העובר. מיובלסטים C2C12 יכולים ליישב מטריצות אלה, להתרבות ולהבדיל. מודל זה במבחנה יכול לשמש לחקר התנהגות התא בהקשר של מחלות שרירי שלד כגון ניוון שרירים.
Abstract
המטריצה החוץ תאית (ECM) ממלאת תפקיד מכריע במתן תמיכה מבנית לתאים ובהעברת אותות החשובים לתהליכים תאיים שונים. מודלים דו-ממדיים (2D) של תרביות תאים מפשטים יתר על המידה את האינטראקציות המורכבות בין תאים לבין ECM, שכן היעדר תמיכה תלת-ממדית מלאה (3D) יכול לשנות את התנהגות התא, מה שהופך אותם לבלתי מספיקים להבנה של תהליכי in vivo . ליקויים בהרכב ECM ובאינטראקציות בין תאים ל-ECM הם תורמים חשובים למגוון מחלות שונות.
דוגמה אחת היא ניוון שרירים מולד LAMA2 (LAMA2-CMD), שבו היעדר או הפחתה של למינין פונקציונלי 211 ו 221 יכול להוביל היפוטוניות חמורה, לגילוי או מיד לאחר הלידה. עבודה קודמת באמצעות מודל עכבר של המחלה מציעה כי הופעתה מתרחשת במהלך מיוגנזה עוברית. המחקר הנוכחי נועד לפתח מודל תלת ממדי במבחנה שיאפשר לחקור את יחסי הגומלין בין תאי שריר לבין ECM שריר העובר, תוך חיקוי המיקרו-סביבה הטבעית. פרוטוקול זה משתמש בשרירי גב עמוקים שנותחו מעוברי עכבר E18.5, מטופלים בחיץ היפוטוני, חומר ניקוי אניוני ו- DNase. כתוצאה מכך, המטריצות הדה-צלולריות (dECMs) שמרו על כל חלבוני ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV) בהשוואה לרקמה הטבעית.
כאשר מיובלסטים C2C12 נזרעו על גבי dECMs אלה, הם חדרו והתיישבו ב-dECMs, מה שתמך בהתרבות ובהתמיינות שלהם. יתר על כן, תאי C2C12 ייצרו חלבוני ECM, ותרמו לעיצוב מחדש של הנישה שלהם בתוך dECMs. הקמת פלטפורמת מבחנה זו מספקת גישה חדשה ומבטיחה לפענוח התהליכים המעורבים בהופעת LAMA2-CMD, ויש לה פוטנציאל להיות מותאמת למחלות שרירי שלד אחרות שבהן ליקויים בתקשורת בין ECM לתאי שריר השלד תורמים להתקדמות המחלה.
Introduction
המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מרכיב עיקרי של רקמות, המייצג את המרכיב הלא-תאי שלהן. מבנה תלת-ממדי (תלת-ממדי) זה לא רק מספק תמיכה פיזית לתאים, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתהליכים הביוכימיים המעורבים בהתפתחות אורגניזמים1. היווצרות ECM ספציפי לרקמה מתרחשת במהלך ההתפתחות, כתוצאה מהאינטראקציות המורכבות בין התאים לנישות שלהם, המושפעות מגירויים תוך-תאיים וחוץ-תאיים שונים. ECM הוא מבנה דינמי ביותר העובר סידורים כימיים ומכניים באופן זמני-מרחבי ומשפיע ישירות על גורל התא2. אחד המאפיינים הבולטים של ECM הוא המגוון התפקודי שלו, שכן כל ECM רקמה מציג שילוב ייחודי של מולקולות המספקות טופולוגיות ותכונות שונות המותאמות לתאים שהוא מכיל1.
איתות ותמיכה ב-ECM חיוניים להתפתחות ולהומאוסטזיס, וכאשר הם משובשים הם עלולים להוביל למצבים פתולוגיים מרובים 3,4. דוגמה אחת היא ניוון מולד חסר LAMA2 (LAMA2-CMD), שהיא הצורה הנפוצה ביותר של ניוון שרירים מולד. הגן LAMA2 מקודד לשרשרת למינין α2, אשר קיים בלמינין 211 ולמינין 221, וכאשר הוא עובר מוטציה יכול להוביל ל- LAMA2-CMD 5. למינין 211 הוא האיזופורם העיקרי שנמצא בקרום המרתף המקיף את סיבי שרירי השלד. כאשר למינין 211 אינו תקין או נעדר, הקשר בין קרום המרתף לתאי השריר משתבש, מה שמוביל להתפרצות המחלה6. חולים עם LAMA2-CMD מראים פנוטיפ קל עד חמור בהתאם לסוג המוטציה בגן LAMA2.
כאשר תפקודו של חלבון α2 למינין מושפע, חולים יכולים לחוות היפוטוניה חמורה בשרירים בלידה ולפתח דלקת כרונית, פיברוזיס וניוון שרירים, מה שמוביל לקיצור תוחלת החיים. עד היום לא פותחו טיפולים ממוקדים והגישות הטיפוליות מוגבלות להקלה על תסמיני המחלה7. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים המעורבים בהתפרצות מחלה זו חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מתאימות 6,8. עבודה קודמת שהשתמשה בעכבר dy W 9, מודל עבור LAMA2-CMD, מציעה כי הופעת המחלה מתחילה ברחם, במיוחד במהלך מיוגנזה עוברית10. הבנה טובה יותר של האופן שבו מופיע פגם המיוגנזה העוברית תשנה את כללי המשחק ביצירת גישות טיפוליות חדשניות עבור LAMA2-CMD.
מערכות במבחנה מספקות סביבה מבוקרת לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECM תא, אך מודלים של תרביות דו-ממדיות חסרים את המורכבות של רקמות טבעיות. דה-צלולריזציה של רקמות מייצרת פיגומים אצלולריים אצלולריים ספציפיים לרקמות ולשלבי התפתחות, המחקים בצורה מדויקת יותר את המיקרו-סביבה הטבעית של התא בהשוואה למודלים דו-ממדיים ופיגומים מהונדסים / סינתטיים. למטריצות דה-תאיות (dECMs) יש פוטנציאל לשמר את הרמזים המולקולריים והמכניים של הרקמה המארחת, מה שהופך אותן למודלים חלופיים טובים יותר להבנת תהליכים in vivo 11.
ישנן טכניקות, ריאגנטים ותנאים שונים שניתן להשתמש בהם לדצלולריזציה12,13. במחקר זה, פרוטוקול דה-צלולריזציה של לב עכבר העובר, שתואר על ידי Silva et al.14,15, מותאם לשרירי השלד של עכבר העובר ונמצא כי הוא שומר על כל רכיבי ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV). הפרוטוקול כולל שלושה שלבים: ליזה של תאים על ידי הלם אוסמוטי (חיץ היפוטוני), המסת קרום פלזמה ודיסוציאציה של חלבונים (0.05% נתרן דודציל סולפט [SDS]), והרס אנזימטי של DNA (טיפול DNase). למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון שנקבע לפירוק שרירי השלד העוברי של עכבר.
כדי להשתמש במערכת תלת-ממדית זו במבחנה לחקר LAMA2-CMD, חיוני לשמור על שרשרת α2 למינין לאחר דה-צלולריזציה. לכן, יושם פרוטוקול אופטימיזציה שבו נבדקו דטרגנטים שונים (SDS וטריטון X-100) וריכוזים (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% ו-0.5%) (הנתונים לא מוצגים). הבחירה האופטימלית להסרת תאים ושימור של חלבון למינין α2 נמצאה 0.05% SDS. תאי C2C12, קו תאי מיובלסטמבוסס היטב 16,17, שימשו לזרע dECMs. תאים אלה פולשים ל-dECM, מתרבים ומתמיינים בתוך פיגומים אלה, תוך סינתזה של חלבוני ECM חדשים. הייצור המוצלח של מודל תלת-ממדי זה במבחנה מציע גישה חדשה להבנת התהליכים המולקולריים והתאיים המעורבים במיוגנזה עוברית, הופעת LAMA2-CMD, וניתן להרחיב אותו למחלות שרירים אחרות שבהן התקשורת בין ECM לתאי שריר השלד משובשת.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM היא רשת מורכבת של מקרומולקולות הקיימת בכל הרקמות וממלאת תפקיד מכריע בוויסות התנהגות התא ותפקודו2. ה-ECM משמש כפיגום פיזי שאליו תאים יכולים להיצמד ומספק רמזים המווסתים באופן פעיל תהליכים תאיים כגון התפשטות, תנועתיות, התמיינות ואפופטוזיס. לפיכך, היווצרות נכונה ותחזוקה של ECM חי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies (AFM-Téléthon; חוזה מס’ 23049), פרויקט MATRIHEALTH, ויחידת cE3c מימון UIDB/00329/2020. ברצוננו להודות לתורם שלנו הנריקה מיירלס שבחר לתמוך בפרויקט MATRIHEALTH. עבודה זו נהנתה מהתשתיות של מתקן המיקרוסקופיה של הפקולטה למדעים, צומת של הפלטפורמה הפורטוגזית של הדמיה ביולוגית (סימוכין PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), ואנו מודים לואיס מרקס על עזרתו ברכישת ועיבוד תמונה. לבסוף, אנו מודים למרתה פלמה על התמיכה הטכנית ולצוות המחקר שלנו על תרומתם הנדיבה.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
