Herstellung von 3D-dezellularisierten Matrizen aus fetalen Mausskelettmuskeln für die Zellkultur
Summary
In dieser Arbeit wurde ein Dezellularisierungsprotokoll optimiert, um dezellularisierte Matrices des fetalen Mausskelettmuskels zu erhalten. C2C12-Myoblasten können diese Matrices besiedeln, sich vermehren und differenzieren. Mit diesem In-vitro-Modell kann das Zellverhalten im Kontext von Skelettmuskelerkrankungen wie Muskeldystrophien untersucht werden.
Abstract
Die extrazelluläre Matrix (EZM) spielt eine entscheidende Rolle bei der strukturellen Unterstützung von Zellen und der Übertragung von Signalen, die für verschiedene zelluläre Prozesse wichtig sind. Zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle vereinfachen die komplexen Interaktionen zwischen Zellen und der EZM zu sehr, da das Fehlen eines vollständigen dreidimensionalen (3D) Trägers das Zellverhalten verändern kann, so dass sie für das Verständnis von In-vivo-Prozessen nicht ausreichen. Defizite in der EZM-Zusammensetzung und Zell-EZM-Interaktionen tragen wesentlich zu einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen bei.
Ein Beispiel ist die LAMA2-kongenitale Muskeldystrophie (LAMA2-CMD), bei der das Fehlen oder die Verringerung der funktionellen Laminine 211 und 221 zu einer schweren Hypotonie führen kann, die bei oder kurz nach der Geburt nachweisbar ist. Frühere Arbeiten mit einem Mausmodell der Krankheit deuten darauf hin, dass sie während der fetalen Myogenese ausbricht. Ziel der vorliegenden Studie war es, ein 3D-In-vitro-Modell zu entwickeln, das es ermöglicht, die Interaktionen zwischen Muskelzellen und der fetalen Muskel-EZM zu untersuchen und die native Mikroumgebung nachzuahmen. Bei diesem Protokoll werden tiefe Rückenmuskeln verwendet, die von E18.5-Mausföten präpariert und mit einem hypotonen Puffer, einem anionischen Detergens und DNase behandelt wurden. Die resultierenden dezellularisierten Matrices (dECMs) behielten alle getesteten EZM-Proteine (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) im Vergleich zum nativen Gewebe bei.
Wenn C2C12-Myoblasten auf diese dEZMs gesät wurden, drangen sie in die dEZMs ein und besiedelten sie, was ihre Proliferation und Differenzierung unterstützte. Darüber hinaus produzierten die C2C12-Zellen ECM-Proteine, die zum Umbau ihrer Nische innerhalb der dECMs beitrugen. Die Etablierung dieser In-vitro-Plattform bietet einen neuen vielversprechenden Ansatz zur Entschlüsselung der Prozesse, die an der Entstehung von LAMA2-CMD beteiligt sind, und hat das Potenzial, an andere Skelettmuskelerkrankungen angepasst zu werden, bei denen Defizite in der Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen zum Fortschreiten der Krankheit beitragen.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein Hauptbestandteil von Geweben und stellt deren nicht-zelluläre Komponente dar. Diese dreidimensionale (3D) Struktur bietet nicht nur physikalischen Halt für Zellen, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei den biochemischen Prozessen, die an der Entwicklung von Organismen beteiligt sind1. Die Bildung einer gewebespezifischen EZM erfolgt während der Entwicklung durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Nischen, die durch verschiedene intra- und extrazelluläre Reize beeinflusst werden. Die EZM ist eine hochdynamische Struktur, die chemisch und mechanisch zeitlich-räumlich umgelagert wird und sich direkt auf das Zellschicksalauswirkt 2. Eines der bemerkenswertesten Merkmale der EZM ist ihre funktionelle Vielfalt, da jede Gewebe-EZM eine einzigartige Kombination von Molekülen aufweist, die unterschiedliche Topologien und Eigenschaften bieten, die auf die darin enthaltenen Zellen zugeschnitten sind1.
Die Signalübertragung und Unterstützung der EZM ist entscheidend für die Entwicklung und Homöostase und kann, wenn sie gestört ist, zu multiplen pathologischen Zuständen führen 3,4. Ein Beispiel ist die LAMA2-defiziente kongenitale Dystrophie (LAMA2-CMD), die häufigste Form der angeborenen Muskeldystrophie. Das LAMA2-Gen kodiert für die Laminin-α2-Kette, die in Laminin 211 und Laminin 221 vorkommt und bei Mutation zu LAMA2-CMD 5 führen kann. Laminin 211 ist die Hauptisoform, die in der Basalmembran vorkommt, die die Skelettmuskelfasern umgibt. Wenn Laminin 211 abnormal ist oder fehlt, ist die Verbindung zwischen der Basalmembran und den Muskelzellen gestört, was zum Ausbruch der Krankheit führt6. Patienten mit LAMA2-CMD zeigen einen leichten bis schweren Phänotyp, abhängig von der Art der Mutation im LAMA2-Gen.
Wenn die Funktion des Laminin-α2-Proteins beeinträchtigt ist, kann es bei der Geburt zu einer schweren Muskelhypotonie kommen und chronische Entzündungen, Fibrose und Muskelatrophie entwickeln, was zu einer verkürzten Lebenserwartung führt. Bisher wurden keine zielgerichteten Therapien entwickelt und die therapeutischen Ansätze beschränken sich auf die Linderung der Krankheitssymptome7. Daher ist das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die an der Entstehung dieser Krankheit beteiligt sind, von entscheidender Bedeutung, um geeignete therapeutische Strategien zu entwickeln 6,8. Frühere Arbeiten mit der dy-W-Maus9, einem Modell für LAMA2-CMD, deuten darauf hin, dass der Ausbruch der Krankheit in utero beginnt, insbesondere während der fetalen Myogenese10. Ein besseres Verständnis der Entstehung des fetalen Myogenesedefekts wäre ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für LAMA2-CMD.
In-vitro-Systeme bieten eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionen, aber 2D-Kulturmodellen fehlt die Komplexität nativer Gewebe. Die Dezellularisierung von Geweben erzeugt gewebe- und entwicklungsstadienspezifische azelluläre ECM-Gerüste, die im Vergleich zu 2D-Modellen und technischen/synthetischen Gerüsten die natürliche Mikroumgebung der Zellen genauer nachahmen. Dezellularisierte Matrices (dEZMs) haben das Potenzial, die molekularen und mechanischen Signale des Wirtsgewebes zu erhalten, was sie zu besseren alternativen Modellen für das Verständnis von In-vivo-Prozessen macht11.
Es gibt verschiedene Techniken, Reagenzien und Bedingungen, die für die Dezellularisierung verwendet werden können12,13. In dieser Studie wurde ein Dezellularisierungsprotokoll für das fetale Mausherz, das von Silva et al.14,15 beschrieben wurde, an die fetale Mausskelettmuskulatur angepasst und es wurde festgestellt, dass alle getesteten EZM-Komponenten (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) erhalten bleiben. Das Protokoll umfasst drei Schritte: Zelllyse durch osmotischen Schock (hypotoner Puffer), Auflösung der Plasmamembran und Proteindissoziation (0,05 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) und enzymatische Zerstörung der DNA (DNase-Behandlung). Unseres Wissens ist dies das erste etablierte Protokoll zur Dezellularisierung des fetalen Skelettmuskels der Maus.
Um dieses 3D-In-vitro-System für die Untersuchung von LAMA2-CMD zu verwenden, ist es entscheidend, die Laminin-α2-Kette nach der Dezellularisierung beizubehalten. Daher wurde ein Optimierungsprotokoll implementiert, bei dem verschiedene Detergenzien (SDS und Triton X-100) und Konzentrationen (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % und 0,5 %) getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Die optimale Wahl für die Zellentfernung und Konservierung des Laminin-α2-Proteins war 0,05 % SDS. C2C12-Zellen, eine gut etablierte Myoblasten-Zelllinie16,17, wurden verwendet, um die dEZMs zu besiedeln. Diese Zellen dringen in das dEZM ein, vermehren sich und differenzieren sich innerhalb dieser Gerüste, wobei sie neue EZM-Proteine synthetisieren. Die erfolgreiche Herstellung dieses 3D-In-vitro-Modells bietet einen neuen Ansatz zum Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die an der fetalen Myogenese und dem Auftreten von LAMA2-CMD beteiligt sind, und kann auf andere Muskelerkrankungen ausgeweitet werden, bei denen die Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen gestört ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die EZM ist ein komplexes Netzwerk von Makromolekülen, das in allen Geweben vorhanden ist und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens und der Zellfunktion spielt2. Die EZM fungiert als physikalisches Gerüst für Zellen, an das sie sich anheften können, und liefert Hinweise, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Motilität, Differenzierung und Apoptose aktiv modulieren. Daher ist die ordnungsgemäße Bildung und Aufrechterhaltung der EZM sowohl für die Entwicklung a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; Vertrags-Nr. 23049), dem MATRIHEALTH-Projekt und der cE3c-Unit-Finanzierung UIDB/00329/2020 finanziert. Wir möchten uns bei unserem Spender Henrique Meirelles bedanken, der sich entschieden hat, das MATRIHEALTH-Projekt zu unterstützen. Diese Arbeit profitierte von den Infrastrukturen der Mikroskopie-Einrichtung der Fakultät für Naturwissenschaften, einem Knotenpunkt der portugiesischen Plattform für BioBildgebung (Referenz PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), und wir danken Luís Marques für seine Unterstützung bei der Bildaufnahme und -verarbeitung. Abschließend danken wir Marta Palma für die technische Unterstützung und unserem Forschungsteam für die großzügigen Beiträge.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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