Summary

فحص الأدوية القائم على النسخ الفعال من حيث التكلفة

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول سير العمل من مزارع الخلايا خارج الجسم الحي أو في المختبر إلى المعالجة المسبقة للبيانات النسخية لفحص الأدوية القائم على النسخ الفعال من حيث التكلفة.

Abstract

يسمح Transcriptomics بالحصول على رؤى شاملة حول البرامج الخلوية واستجاباتها للاضطرابات. على الرغم من الانخفاض الكبير في تكاليف إنتاج المكتبات وتسلسلها في العقد الماضي ، فإن تطبيق هذه التقنيات على النطاق اللازم لفحص المخدرات لا يزال مكلفا للغاية ، مما يعيق الإمكانات الهائلة لهذه الأساليب. تقدم دراستنا نظاما فعالا من حيث التكلفة لفحص الأدوية القائم على النسخ ، ويجمع بين ثقافات الاضطراب المصغرة والنسخ السائبة الصغيرة. يوفر بروتوكول السائبة الصغيرة المحسن إشارات بيولوجية إعلامية على عمق تسلسل فعال من حيث التكلفة ، مما يتيح فحصا مكثفا للأدوية المعروفة والجزيئات الجديدة. اعتمادا على العلاج المختار ووقت الحضانة ، سيؤدي هذا البروتوكول إلى تسلسل المكتبات في غضون أيام 2 تقريبا. نظرا للعديد من نقاط التوقف داخل هذا البروتوكول ، يمكن إجراء إعداد المكتبة ، وكذلك التسلسل ، بشكل مستقل عن الوقت. معالجة عدد كبير من العينات في وقت واحد ممكن ؛ تم اختبار قياس ما يصل إلى 384 عينة دون فقدان جودة البيانات. لا توجد أيضا قيود معروفة على عدد الحالات و / أو الأدوية ، على الرغم من مراعاة التباين في أوقات حضانة الدواء المثلى.

Introduction

يعد تطوير عقاقير جديدة عملية معقدة وتستغرق وقتا طويلا وتتضمن تحديد الأدوية المحتملة وأهدافها ، وتحسين وتوليف الأدوية المرشحة ، واختبار فعاليتها وسلامتها في التجارب قبل السريرية والسريرية1. تتضمن الطرق التقليدية لفحص الأدوية ، أي التقييم المنهجي لمكتبات المركبات المرشحة للأغراض العلاجية ، استخدام نماذج حيوانية أو مقايسات قائمة على الخلايا لاختبار التأثيرات على أهداف أو مسارات محددة. في حين أن هذه الطرق كانت ناجحة في تحديد الأدوية المرشحة ، إلا أنها في كثير من الأحيان لم تقدم رؤى كافية حول الآليات الجزيئية المعقدة الكامنة وراء فعالية الدواء وكذلك السمية وآليات الآثار الجانبية المحتملة.

يقدم تقييم حالات النسخ على مستوى الجينوم نهجا قويا للتغلب على القيود الحالية في فحص الأدوية ، لأنه يتيح إجراء تقييمات شاملة للتعبير الجيني استجابة للعلاجات الدوائية2. من خلال قياس نسخ الحمض النووي الريبي بطريقة على مستوى الجينوم يتم التعبير عنها في وقت معين ، يهدف علم النسخ إلى توفير نظرة شاملة للتغيرات النسخية التي تحدث استجابة للأدوية ، بما في ذلك التغيرات في أنماط التعبير الجيني ، والربط البديل ، وتعبير الحمض النووي الريبي غير المشفر3. يمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد أهداف الأدوية ، والتنبؤ بفعالية الدواء وسميته ، وتحسين جرعات الأدوية وأنظمة العلاج.

تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية للجمع بين علم النسخ وفحص الأدوية غير المتحيز في إمكانية تحديد أهداف دوائية جديدة لم يتم النظر فيها من قبل. غالبا ما تركز مناهج فحص الأدوية التقليدية على الجزيئات أو المسارات المستهدفة المحددة ، مما يعيق تحديد أهداف جديدة ويحتمل أن يؤدي إلى عقاقير ذات آثار جانبية غير متوقعة وفعالية محدودة. يمكن لعلم النسخ التغلب على هذه القيود من خلال تقديم نظرة ثاقبة للتغيرات الجزيئية التي تحدث استجابة للعلاج الدوائي ، والكشف عن الأهداف أو المسارات المحتملة التي ربما لم يتم النظر فيها سابقا2.

بالإضافة إلى تحديد أهداف دوائية جديدة ، يمكن أيضا استخدام علم النسخ للتنبؤ بفعالية الدواء وسميته. من خلال تحليل أنماط التعبير الجيني المرتبطة بالاستجابات الدوائية ، يمكن تطوير المؤشرات الحيوية التي يمكن استخدامها للتنبؤ باستجابة المريض لدواء معين أو نظام علاج. يمكن أن يساعد هذا أيضا في تحسين جرعات الدواء وتقليل مخاطر الآثار الجانبية الضارة4.

على الرغم من فوائدها المحتملة ، لا تزال تكلفة النسخ تشكل عائقا كبيرا أمام تطبيقها على نطاق واسع في فحص المخدرات. يتطلب تحليل النسخ معدات متخصصة وخبرة فنية وتحليل البيانات ، مما قد يجعل من الصعب على فرق البحث الأصغر أو المنظمات ذات التمويل المحدود استخدام علم النسخ في فحص الأدوية. ومع ذلك ، فإن تكلفة النسخ آخذة في الانخفاض بشكل مطرد ، مما يجعلها في متناول مجتمعات البحث. بالإضافة إلى ذلك ، جعلت التطورات في التكنولوجيا وطرق تحليل البيانات النسخ أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة ، مما زاد من إمكانية الوصول إليها2.

في هذا البروتوكول ، نصف نظاما استكشافيا عالي الأبعاد لفحص الأدوية القائم على النسخ ، ويجمع بين ثقافات الاضطراب المصغرة وتحليل النسخ السائبالمصغر 5,6. باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن تقليل تكلفة العينة إلى 1/6 من التكلفة الحالية للحلول التجارية لتسلسل mRNA كامل الطول. ولا يتطلب البروتوكول سوى معدات مختبرية قياسية، والاستثناء الوحيد هو استخدام تكنولوجيات تسلسل القراءة القصيرة، التي يمكن الاستعانة بمصادر خارجية إذا لم تكن أدوات التسلسل متاحة داخليا. يوفر بروتوكول الحجم الصغير المحسن إشارات بيولوجية غنية بالمعلومات على عمق تسلسل فعال من حيث التكلفة ، مما يتيح فحصا مكثفا للأدوية المعروفة والجزيئات الجديدة.

الهدف من التجربة هو فحص نشاط الدواء على PBMCs في سياقات بيولوجية مختلفة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي سؤال بيولوجي حيث يجب اختبار العديد من الأدوية باستخدام قراءة نسخية ، مما يعطي رؤية واسعة للنسخ للتأثير الخلوي للعلاج.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان الأخلاقيات المحلية في جامعة بون. 1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول والمعدات إعداد الحلول وجمع المواد الموضحة في جدول المواد. قم بتسخين الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية وقم بتسخين وسط النمو الكامل (RPMI-1640 +…

Representative Results

باتباع البروتوكول المبلغ عنه ، تم زرع PBMCs البشرية ، ومعالجتها بأدوية مناعية مختلفة ، وبعد أوقات حضانة مختلفة ، تم حصادها لتحليل النسخ السائب باستخدام بروتوكول التسلسل (الشكل 1). يجب تحديد تركيزات الدواء المثالية وأوقات الحضانة لمركبات الاختبار قبل هذا البرو…

Discussion

يمكن أن يستفيد اكتشاف الأدوية وتطوير الأدوية بشكل كبير من النظرة الشاملة للعمليات الخلوية التي يمكن أن توفرها النسخ السائبة. ومع ذلك ، غالبا ما يكون هذا النهج محدودا بسبب التكلفة العالية للتجربة مع بروتوكول RNA-seq القياسي السائب ، مما يحظر تطبيقه في البيئات الأكاديمية بالإضافة إلى إمكانية …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم دعم JLS من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) في إطار استراتيجية التميز الألمانية (EXC2151-390873048) ، وكذلك بموجب SCHU 950 / 8-1 ؛ GRK 2168 ، TP11 ؛ CRC SFB 1454 Metaflammation ، IRTG GRK 2168 ، WGGC INST 216/981-1 ، CCU INST 217/988-1 ، مشروع التميز الممول من BMBF النظام الغذائي – الجسم – الدماغ (DietBB) ؛ ومشروع الاتحاد الأوروبي SYSCID بموجب المنحة رقم 733100. MBمدعوم من DFG (IRTG2168-272482170 ، SFB1454-432325352). L.B. مدعوم من DFG (ImmuDiet BO 6228 / 2-1 – رقم المشروع 513977171) واستراتيجية التميز الألمانية (EXC2151-390873048). الصور التي تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com.

Materials

50 mL conical tube fisher scientific 10203001
Adhesive PCR Plate Seals Thermo Fisher Scientific AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM) Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads Beckman Coulter A 63881
Betaine  Sigma-Aldrich 61962
Cell culture grade 96-well plates Thermo Fisher Scientific 260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) Integra Bioscience 158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each Fermentas R0192
DMSO Sigma-Aldrich 276855
DTT (100 mM) Invitrogen 18064-014
EDTA Sigma-Aldrich 798681 for adherent cells
Ethanol Sigma-Aldrich 51976
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 26140079
Filter tips (10 µL) Gilson  F171203
Filter tips (100 µL) Gilson  F171403
Filter tips (20 µL) Gilson  F171303
Filter tips (200 µL) Gilson  F171503
Guanidine Hydrochloride Sigma-Aldrich G3272
ISPCR primer (10 µM) Biomers.net GmbH SP10006 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) KAPA Biosystems KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)  Sigma-Aldrich M8266
Magnetic stand 96 Ambion AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer  Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer Illumina
Nuclease-free water Invitrogen 10977049
PBS Thermo Fisher Scientific AM9624
PCR 96-well plates Thermo Fisher Scientific AB0600
PCR plate sealer Thermo Fisher Scientific HSF0031
Penicillin / Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063
Qubit 4 fluorometer Invitrogen 15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) TAKARA 2313A
RPMI-1640 cell culture medium  Gibco 61870036 If not working with PBMCs, adjust to cell type 
SMART dT30VN primer Sigma-Aldrich 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standard lab equipment various various e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) Thermo Fisher Scientific 18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) Thermo Fisher Scientific 18064-014
Tagment DNA Buffer (TD) Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200 Agilent G2991BA
Thermocycler (S1000) Bio-Rad 1852148
TSO-LNA (100 uM) Eurogentec 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer Sigma-Aldrich Z258415

References

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
  3. Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
  4. Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
  5. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
  6. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
  7. De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
  8. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  9. Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  10. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  11. Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
check_url/fr/65930?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Leidner, J., Theis, H., Kraut, M., Ragogna, A., Beyer, M., Schultze, J., Schulte-Schrepping, J., Carraro, C., Bonaguro, L. Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening. J. Vis. Exp. (204), e65930, doi:10.3791/65930 (2024).

View Video