Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması
Summary
Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.
Abstract
Transkriptomik, hücresel programlar ve bunların bozulmalara verdiği yanıtlar hakkında kapsamlı bilgiler elde etmeyi sağlar. Son on yılda kütüphane üretim ve sıralama maliyetlerinde önemli bir düşüşe rağmen, bu teknolojilerin uyuşturucu taraması için gerekli ölçekte uygulanması aşırı derecede pahalı olmaya devam etmekte ve bu yöntemlerin muazzam potansiyelini engellemektedir. Çalışmamız, minyatür pertürbasyon kültürlerini mini-toplu transkriptomik ile birleştiren, transkriptom bazlı ilaç taraması için uygun maliyetli bir sistem sunmaktadır. Optimize edilmiş mini-bulk protokolü, uygun maliyetli dizileme derinliğinde bilgilendirici biyolojik sinyaller sağlayarak bilinen ilaçların ve yeni moleküllerin kapsamlı bir şekilde taranmasını sağlar. Seçilen tedavi ve inkübasyon süresine bağlı olarak, bu protokol yaklaşık 2 gün içinde kütüphanelerin dizilenmesiyle sonuçlanacaktır. Bu protokoldeki birkaç duraklama noktası nedeniyle, kütüphane hazırlığı ve sıralaması zamandan bağımsız olarak gerçekleştirilebilir. Aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesi mümkündür; 384 numuneye kadar ölçüm, veri kalitesinde kayıp olmadan test edilmiştir. Optimal ilaç inkübasyon sürelerindeki değişkenlik göz önüne alınmasına rağmen, koşulların ve/veya ilaçların sayısında bilinen bir sınırlama da yoktur.
Introduction
Yeni ilaçların geliştirilmesi, potansiyel ilaçların ve hedeflerinin belirlenmesini, ilaç adaylarının optimize edilmesini ve sentezlenmesini ve klinik öncesi ve klinik çalışmalarda etkinliklerinin ve güvenliklerinin test edilmesini içeren karmaşık ve zaman alıcı bir süreçtir1. İlaç taraması için geleneksel yöntemler, yani terapötik amaçlar için aday bileşiklerin kütüphanelerinin sistematik olarak değerlendirilmesi, belirli hedefler veya yollar üzerindeki etkileri test etmek için hayvan modellerinin veya hücre bazlı tahlillerin kullanılmasını içerir. Bu yöntemler ilaç adaylarının belirlenmesinde başarılı olmakla birlikte, genellikle ilaç etkinliğinin altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar ve ayrıca toksisite ve potansiyel yan etki mekanizmaları hakkında yeterli bilgi sağlamamıştır.
Genom çapında transkripsiyonel durumların değerlendirilmesi, ilaç tedavilerine yanıt olarak gen ekspresyonunun kapsamlı değerlendirmelerini mümkün kıldığından, ilaç taramasındaki mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek için güçlü bir yaklaşım sunmaktadır2. Transkriptomik, RNA transkriptlerini belirli bir zamanda ifade edilen genom çapında bir şekilde ölçerek, gen ekspresyon modellerindeki değişiklikler, alternatif ekleme ve kodlamayan RNA ekspresyonu dahil olmak üzere ilaçlara yanıt olarak meydana gelen transkripsiyonel değişikliklerin bütünsel bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır3. Bu bilgiler, ilaç hedeflerini belirlemek, ilaç etkinliğini ve toksisitesini tahmin etmek ve ilaç dozlama ve tedavi rejimlerini optimize etmek için kullanılabilir.
Transkriptomiklerin tarafsız ilaç taraması ile birleştirilmesinin en önemli faydalarından biri, daha önce dikkate alınmamış yeni ilaç hedeflerini belirleme potansiyelidir. Konvansiyonel ilaç tarama yaklaşımları genellikle yeni hedeflerin belirlenmesini engelleyen ve potansiyel olarak öngörülemeyen yan etkilere ve sınırlı etkinliğe sahip ilaçlarla sonuçlanan belirlenmiş hedef moleküllere veya yollara odaklanmaktadır. Transkriptomikler, ilaç tedavisine yanıt olarak meydana gelen moleküler değişiklikler hakkında bilgi sağlayarak, daha önce düşünülmemiş olabilecek potansiyel hedefleri veya yolları ortaya çıkararak bu sınırlamaların üstesinden gelebilir2.
Yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesine ek olarak, transkriptomikler ilaç etkinliğini ve toksisitesini tahmin etmek için de kullanılabilir. İlaç yanıtları ile ilişkili gen ekspresyon modellerini analiz ederek, bir hastanın belirli bir ilaca veya tedavi rejimine yanıtını tahmin etmek için kullanılabilecek biyobelirteçler geliştirilebilir. Bu aynı zamanda ilaç dozunu optimize etmeye ve olumsuz yan etki riskini azaltmaya yardımcı olabilir4.
Potansiyel faydalarına rağmen, transkriptomiklerin maliyeti, ilaç taramasında yaygın olarak uygulanmasının önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Transkriptomik analiz, özel ekipman, teknik uzmanlık ve veri analizi gerektirir, bu da daha küçük araştırma ekiplerinin veya sınırlı finansmana sahip kuruluşların ilaç taramasında transkriptomik kullanmasını zorlaştırabilir. Bununla birlikte, transkriptomiklerin maliyeti istikrarlı bir şekilde düşmekte ve bu da onu araştırma toplulukları için daha erişilebilir hale getirmektedir. Ek olarak, teknoloji ve veri analizi yöntemlerindeki gelişmeler, transkriptomikleri daha verimli ve uygun maliyetli hale getirerek erişilebilirliğini daha da artırmıştır2.
Bu protokolde, minyatür pertürbasyon kültürlerini mini-toplu transkriptomik analiz 5,6 ile birleştiren, transkriptom tabanlı ilaç taraması için yüksek boyutlu ve keşifsel bir sistem tanımlıyoruz. Bu protokol ile numune başına maliyeti, tam uzunlukta mRNA dizilimi için mevcut ticari çözümmaliyetinin 1/6’sına düşürmek mümkündür. Protokol yalnızca standart laboratuvar ekipmanı gerektirir, tek istisna, dizileme cihazlarının kurum içinde bulunmaması durumunda dış kaynaklı olabilen kısa okuma dizileme teknolojilerinin kullanılmasıdır. Optimize edilmiş mini-bulk protokolü, uygun maliyetli dizileme derinliğinde bilgi açısından zengin biyolojik sinyaller sağlayarak bilinen ilaçların ve yeni moleküllerin kapsamlı bir şekilde taranmasını sağlar.
Deneyin amacı, farklı biyolojik bağlamlarda PBMC’ler üzerindeki ilaç aktivitesini taramaktır. Bu protokol, birkaç ilacın transkriptomik bir okuma ile test edilmesi gereken herhangi bir biyolojik soruya uygulanabilir ve tedavinin hücresel etkisinin transkriptom çapında bir görünümünü verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İlaç keşfi ve ilaç geliştirme, toplu transkriptomiklerin sağlayabileceği hücresel süreçlerin bütünsel görünümünden büyük ölçüde yararlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle standart toplu RNA-seq protokolü ile yapılan deneyin yüksek maliyeti ile sınırlıdır ve akademik ortamlarda uygulanmasını ve endüstriyel ölçeklenebilirlik potansiyelini yasaklar.
Protokolün en kritik adımları hücre çözme ve kütüphane hazırlığının ilk adımlarıdır….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S., Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) ve SCHU 950/8-1 kapsamında; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammasyon, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF tarafından finanse edilen mükemmellik projesi Diyet-Vücut-Beyin (DietBB); ve 733100 hibe numarası altında AB projesi SYSCID. M.B., DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352) tarafından desteklenmektedir. L.B., DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Proje numarası 513977171) ve Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) tarafından desteklenmektedir. BioRender.com ile oluşturulan görüntüler.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
