費用対効果の高いトランスクリプトームベースの薬物スクリーニング
Summary
このプロトコルは費用効果が大きいトランスクリプトーム ベースの薬剤のスクリーニングのためのex 生体内 または 生体外の 細胞培養からのトランスクリプトーム データ前処理へのワークフローを記述する。
Abstract
トランスクリプトミクスは、細胞プログラムとその摂動に対する応答に関する包括的な洞察を得ることができます。過去10年間でライブラリーの作製とシーケンシングのコストが大幅に低下したにもかかわらず、これらの技術を薬物スクリーニングに必要な規模で適用することは依然として法外なコストがかかり、これらの方法の計り知れない可能性を妨げています。本研究は、小型の摂動培養とミニバルクトランスクリプトミクスを組み合わせた、トランスクリプトームベースの薬物スクリーニングのための費用対効果の高いシステムを提示しています。最適化されたミニバルクプロトコルは、費用対効果の高いシーケンシング深度で有益な生体シグナルを提供し、既知の薬物や新しい分子の広範なスクリーニングを可能にします。選択した治療とインキュベーション時間に応じて、このプロトコルは約2日以内にライブラリのシーケンシングになります。このプロトコル内にはいくつかの停止ポイントがあるため、ライブラリ調製とシーケンシングは時間に依存しない状態で行うことができます。多数のサンプルを同時に処理することが可能です。最大384サンプルの測定は、データ品質を損なうことなくテストされました。また、最適な薬物インキュベーション時間のばらつきを考慮しているにもかかわらず、条件および/または薬物の数に既知の制限はありません。
Introduction
新薬の開発は、候補となる医薬品とその標的の特定、医薬品候補の最適化と合成、前臨床試験および臨床試験での有効性と安全性の検証を含む、複雑で時間のかかるプロセスです1。従来の薬物スクリーニングの方法、すなわち治療目的で候補化合物のライブラリーを系統的に評価する方法では、動物モデルまたは細胞ベースのアッセイを使用して、特定の標的または経路に対する効果を試験します。これらの手法は、医薬品候補の同定には成功していますが、薬効の根底にある複雑な分子メカニズムや、毒性、潜在的な副作用のメカニズムについては、十分な洞察が得られないことが多かったのです。
ゲノムワイドな転写状態を評価することは、薬物治療に反応した遺伝子発現の包括的な評価を可能にするため、薬物スクリーニングにおける現在の限界を克服するための強力なアプローチを提示します2。トランスクリプトミクスは、ある時点で発現するRNA転写産物をゲノムワイドに測定することにより、遺伝子発現パターン、選択的スプライシング、ノンコーディングRNA発現の変化など、薬物に反応して起こる転写変化の全体像を提供することを目的としています3。この情報は、薬物標的の決定、薬物の有効性と毒性の予測、薬物の投与と治療計画の最適化に使用できます。
トランスクリプトミクスと偏りのない薬物スクリーニングを組み合わせることの主な利点の1つは、これまで考慮されていなかった新しい薬剤標的を特定できる可能性があることです。従来の薬物スクリーニングアプローチは、確立された標的分子や経路に焦点を当てることが多く、新しい標的の同定を妨げ、予期せぬ副作用や有効性が制限される薬剤につながる可能性があります。トランスクリプトミクスは、薬物治療に反応して起こる分子変化に関する洞察を提供し、これまで考慮されていなかった可能性のある潜在的な標的や経路を明らかにすることで、これらの限界を克服することができます2。
トランスクリプトミクスは、新しい創薬標的の同定に加えて、薬効や毒性の予測にも使用できます。薬物応答に関連する遺伝子発現パターンを解析することにより、特定の薬物または治療レジメンに対する患者の反応を予測するために使用できるバイオマーカーを開発することができます。これは、薬剤の投与量を最適化し、有害な副作用のリスクを軽減するのにも役立ちます4。
トランスクリプトミクスの潜在的な利点にもかかわらず、薬物スクリーニングにおけるトランスクリプトミクスの広範な適用に対する大きな障壁は依然として存在しています。トランスクリプトーム解析には特殊な機器、技術的専門知識、データ解析が必要であり、小規模な研究チームや資金が限られている組織では、薬物スクリーニングにトランスクリプトミクスを利用することが困難な場合があります。しかし、トランスクリプトミクスのコストは着実に低下しており、研究コミュニティにとってより身近なものとなっています。さらに、技術とデータ解析方法の進歩により、トランスクリプトミクスはより効率的で費用対効果が高くなり、アクセシビリティがさらに向上しました2。
このプロトコルでは、ミニチュア化された摂動培養とミニバルクトランスクリプトミクス分析を組み合わせた、トランスクリプトームベースの薬物スクリーニングのための高次元で探索的なシステムについて説明します5,6。このプロトコルにより、サンプルあたりのコストを、完全長mRNAシーケンシングの市販ソリューションの現在のコストの1/6に削減することが可能です。このプロトコルは、標準的な実験装置のみを必要とし、唯一の例外はショートリードシーケンシング技術の使用であり、シーケンシング機器が社内にない場合はアウトソーシングすることができます。最適化されたミニバルクプロトコルは、費用対効果の高いシーケンシング深度で情報量の多い生体シグナルを提供し、既知の薬物や新しい分子の広範なスクリーニングを可能にします。
この実験の目的は、さまざまな生物学的状況におけるPBMCの薬物活性をスクリーニングすることです。このプロトコルは、複数の薬剤をトランスクリプトーム読み出しでテストし、治療の細胞効果をトランスクリプトーム全体で把握できる生物学的問題に適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
創薬や創薬は、バルクトランスクリプトミクスが提供できる細胞プロセスの全体像から大きな恩恵を受けることができます。しかし、このアプローチは、標準的なバルクRNA-seqプロトコルを用いた実験のコストが高いため、学術的な環境での応用が妨げられることや、産業的なスケーラビリティの可能性が妨げられることが多くあります。
プロトコルの最も重要なステッ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S.は、ドイツの卓越性戦略(EXC2151-390873048)およびSCHU 950/8-1の下で、ドイツ研究財団(DFG)の支援を受けています。GRK 2168、TP11;CRC SFB 1454 Metaflammation、IRTG GRK 2168、WGGC INST 216/981-1、CCU INST 217/988-1、BMBFが資金提供するエクセレンスプロジェクトDiet-Body-Brain(DietBB);EUプロジェクトSYSCID(助成金番号733100)。M.B. は DFG (IRTG2168-272482170、SFB1454-432325352) でサポートされています。L.B.は、DFG(ImmuDiet BO 6228/2-1 – プロジェクト番号513977171)およびドイツのエクセレンス戦略(EXC2151-390873048)の支援を受けています。BioRender.com で作成された画像。
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
