Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi
Summary
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che va dalle colture cellulari ex vivo o in vitro alla pre-elaborazione dei dati trascrittomici per uno screening farmacologico basato sul trascrittoma economicamente vantaggioso.
Abstract
La trascrittomica consente di ottenere informazioni complete sui programmi cellulari e sulle loro risposte alle perturbazioni. Nonostante una significativa diminuzione dei costi di produzione e sequenziamento delle librerie nell’ultimo decennio, l’applicazione di queste tecnologie alla scala necessaria per lo screening dei farmaci rimane proibitivamente costosa, ostacolando l’immenso potenziale di questi metodi. Il nostro studio presenta un sistema economicamente vantaggioso per lo screening farmacologico basato sul trascrittoma, che combina colture di perturbazione miniaturizzate con trascrittomica mini-bulk. Il protocollo mini-bulk ottimizzato fornisce segnali biologici informativi a una profondità di sequenziamento conveniente, consentendo uno screening approfondito di farmaci noti e nuove molecole. A seconda del trattamento scelto e del tempo di incubazione, questo protocollo si tradurrà in librerie di sequenziamento entro circa 2 giorni. A causa dei diversi punti di arresto all’interno di questo protocollo, la preparazione della libreria, così come il sequenziamento, possono essere eseguiti indipendentemente dal tempo. È possibile processare contemporaneamente un numero elevato di campioni; La misurazione di un massimo di 384 campioni è stata testata senza perdita di qualità dei dati. Inoltre, non sono note limitazioni al numero di condizioni e/o farmaci, nonostante si consideri la variabilità nei tempi ottimali di incubazione dei farmaci.
Introduction
Lo sviluppo di nuovi farmaci è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo che comporta l’identificazione di potenziali farmaci e dei loro bersagli, l’ottimizzazione e la sintesi di farmaci candidati e la verifica della loro efficacia e sicurezza in studi preclinici e clinici1. I metodi tradizionali per lo screening dei farmaci, cioè la valutazione sistematica di librerie di composti candidati per scopi terapeutici, prevedono l’uso di modelli animali o saggi basati su cellule per testare gli effetti su bersagli o percorsi specifici. Sebbene questi metodi abbiano avuto successo nell’identificare i farmaci candidati, spesso non hanno fornito informazioni sufficienti sui complessi meccanismi molecolari alla base dell’efficacia dei farmaci e anche della tossicità e dei meccanismi dei potenziali effetti collaterali.
La valutazione degli stati trascrizionali dell’intero genoma rappresenta un approccio potente per superare gli attuali limiti nello screening farmacologico, in quanto consente valutazioni complete dell’espressione genica in risposta ai trattamenti farmacologici2. Misurando i trascritti dell’RNA in modo genome-wide espressi in un dato momento, la trascrittomica mira a fornire una visione olistica dei cambiamenti trascrizionali che si verificano in risposta ai farmaci, compresi i cambiamenti nei modelli di espressione genica, lo splicing alternativo e l’espressione dell’RNA non codificante3. Queste informazioni possono essere utilizzate per determinare i bersagli farmacologici, prevedere l’efficacia e la tossicità dei farmaci e ottimizzare il dosaggio dei farmaci e i regimi di trattamento.
Uno dei principali vantaggi della combinazione della trascrittomica con uno screening imparziale dei farmaci è la possibilità di identificare nuovi bersagli farmacologici che non sono stati precedentemente considerati. Gli approcci convenzionali di screening dei farmaci spesso si concentrano su molecole o percorsi bersaglio stabiliti, ostacolando l’identificazione di nuovi bersagli e potenzialmente dando luogo a farmaci con effetti collaterali imprevisti e un’efficacia limitata. La trascrittomica può superare queste limitazioni fornendo informazioni sui cambiamenti molecolari che si verificano in risposta al trattamento farmacologico, scoprendo potenziali bersagli o percorsi che potrebbero non essere stati considerati in precedenza2.
Oltre all’identificazione di nuovi bersagli farmacologici, la trascrittomica può essere utilizzata anche per prevedere l’efficacia e la tossicità dei farmaci. Analizzando i modelli di espressione genica associati alle risposte ai farmaci, è possibile sviluppare biomarcatori che possono essere utilizzati per prevedere la risposta di un paziente a un particolare farmaco o regime di trattamento. Questo può anche aiutare a ottimizzare il dosaggio del farmaco e ridurre il rischio di effetti collaterali avversi4.
Nonostante i suoi potenziali benefici, il costo della trascrittomica rimane un ostacolo significativo alla sua applicazione diffusa nello screening farmacologico. L’analisi trascrittomica richiede attrezzature specializzate, competenze tecniche e analisi dei dati, il che può rendere difficile per i team di ricerca più piccoli o le organizzazioni con finanziamenti limitati utilizzare la trascrittomica nello screening dei farmaci. Tuttavia, il costo della trascrittomica è in costante diminuzione, rendendola più accessibile alle comunità di ricerca. Inoltre, i progressi nella tecnologia e nei metodi di analisi dei dati hanno reso la trascrittomica più efficiente ed economica, aumentandone ulteriormente l’accessibilità2.
In questo protocollo, descriviamo un sistema altamente dimensionale ed esplorativo per lo screening di farmaci basato sul trascrittoma, combinando colture di perturbazione miniaturizzate con analisi trascrittomica mini-bulk 5,6. Con questo protocollo, è possibile ridurre il costo per campione a 1/6 del costo attuale delle soluzioni commerciali per il sequenziamento dell’mRNA a lunghezza intera. Il protocollo richiede solo attrezzature di laboratorio standard, con l’unica eccezione dell’uso di tecnologie di sequenziamento a lettura breve, che possono essere esternalizzate se gli strumenti di sequenziamento non sono disponibili internamente. Il protocollo mini-bulk ottimizzato fornisce segnali biologici ricchi di informazioni a una profondità di sequenziamento conveniente, consentendo uno screening approfondito di farmaci noti e nuove molecole.
Lo scopo dell’esperimento è quello di effettuare lo screening dell’attività dei farmaci sulle PBMC in diversi contesti biologici. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi questione biologica in cui diversi farmaci devono essere testati con una lettura trascrittomica, fornendo una visione a livello di trascrittoma dell’effetto cellulare del trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La scoperta e lo sviluppo di farmaci possono trarre grandi benefici dalla visione olistica dei processi cellulari che la trascrittomica di massa può fornire. Tuttavia, questo approccio è spesso limitato dall’alto costo dell’esperimento con il protocollo standard di RNA-seq di massa, che ne impedisce l’applicazione in ambienti accademici e dal suo potenziale di scalabilità industriale.
Le fasi più critiche del protocollo sono lo scongelamento delle cellule e le fasi iniziali della preparazi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. è sostenuta dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) nell’ambito della strategia di eccellenza tedesca (EXC2151-390873048), nonché nell’ambito dello SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, il progetto di eccellenza finanziato dal BMBF Diet-Body-Brain (DietBB); e il progetto europeo SYSCID con il numero di sovvenzione 733100. M.B. è supportato da DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. è sostenuta da DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Progetto numero 513977171) e dalla Strategia di Eccellenza della Germania (EXC2151-390873048). Immagini create con BioRender.com.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
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