Summary

Cribado de fármacos basado en transcriptómica rentable

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Este protocolo describe un flujo de trabajo desde los cultivos celulares ex vivo o in vitro hasta el preprocesamiento de datos transcriptómicos para el cribado rentable de fármacos basado en transcriptomas.

Abstract

La transcriptómica permite obtener información completa sobre los programas celulares y sus respuestas a las perturbaciones. A pesar de una disminución significativa en los costos de producción y secuenciación de bibliotecas en la última década, la aplicación de estas tecnologías a la escala necesaria para el cribado de drogas sigue siendo prohibitivamente costosa, lo que obstruye el inmenso potencial de estos métodos. Nuestro estudio presenta un sistema rentable para el cribado de fármacos basado en transcriptomas, que combina cultivos de perturbaciones miniaturizados con transcriptómica minimasiva. El protocolo minimasivo optimizado proporciona señales biológicas informativas a una profundidad de secuenciación rentable, lo que permite un cribado exhaustivo de fármacos conocidos y nuevas moléculas. Dependiendo del tratamiento elegido y del tiempo de incubación, este protocolo dará como resultado la secuenciación de las bibliotecas en aproximadamente 2 días. Debido a varios puntos de parada dentro de este protocolo, la preparación de la biblioteca, así como la secuenciación, se pueden realizar independientemente del tiempo. Es posible procesar simultáneamente un gran número de muestras; Se probó la medición de hasta 384 muestras sin pérdida de calidad de los datos. Tampoco se conocen limitaciones en cuanto al número de afecciones y/o fármacos, a pesar de tener en cuenta la variabilidad en los tiempos óptimos de incubación de fármacos.

Introduction

El desarrollo de nuevos fármacos es un proceso complejo y lento que implica la identificación de fármacos potenciales y sus dianas, la optimización y síntesis de candidatos a fármacos, y la comprobación de su eficacia y seguridad en ensayos preclínicos y clínicos1. Los métodos tradicionales para el cribado de fármacos, es decir, la evaluación sistemática de bibliotecas de compuestos candidatos con fines terapéuticos, implican el uso de modelos animales o ensayos basados en células para probar los efectos sobre dianas o vías específicas. Si bien estos métodos han tenido éxito en la identificación de candidatos a fármacos, a menudo no proporcionaron información suficiente sobre los complejos mecanismos moleculares que subyacen a la eficacia de los medicamentos y también sobre la toxicidad y los mecanismos de los posibles efectos secundarios.

La evaluación de los estados transcripcionales de todo el genoma presenta un enfoque poderoso para superar las limitaciones actuales en el cribado de fármacos, ya que permite realizar evaluaciones exhaustivas de la expresión génica en respuesta a los tratamientos farmacológicos2. Al medir las transcripciones de ARN de manera genómica expresada en un momento dado, la transcriptómica tiene como objetivo proporcionar una visión holística de los cambios transcripcionales que ocurren en respuesta a los fármacos, incluidos los cambios en los patrones de expresión génica, el empalme alternativo y la expresión de ARN no codificante3. Esta información se puede utilizar para determinar los objetivos farmacológicos, predecir la eficacia y toxicidad de los fármacos, y optimizar la dosificación de los fármacos y los regímenes de tratamiento.

Uno de los beneficios clave de combinar la transcriptómica con el cribado imparcial de fármacos es la posibilidad de identificar nuevas dianas farmacológicas que no se han considerado previamente. Los enfoques convencionales de cribado de fármacos a menudo se centran en moléculas o vías diana establecidas, lo que dificulta la identificación de nuevas dianas y puede dar lugar a fármacos con efectos secundarios imprevistos y eficacia restringida. La transcriptómica puede superar estas limitaciones al proporcionar información sobre los cambios moleculares que se producen en respuesta al tratamiento farmacológico, descubriendo posibles dianas o vías que pueden no haberse considerado previamente2.

Además de la identificación de nuevas dianas farmacológicas, la transcriptómica también puede utilizarse para predecir la eficacia y la toxicidad de los fármacos. Mediante el análisis de los patrones de expresión génica asociados con las respuestas a los fármacos, se pueden desarrollar biomarcadores que pueden utilizarse para predecir la respuesta de un paciente a un fármaco o régimen de tratamiento en particular. Esto también puede ayudar a optimizar la dosificación de medicamentos y reducir el riesgo de efectos secundarios adversos4.

A pesar de sus beneficios potenciales, el costo de la transcriptómica sigue siendo un obstáculo importante para su aplicación generalizada en el cribado de fármacos. El análisis transcriptómico requiere equipos especializados, conocimientos técnicos y análisis de datos, lo que puede dificultar la utilización de la transcriptómica en la detección de fármacos para equipos de investigación más pequeños u organizaciones con fondos limitados. Sin embargo, el costo de la transcriptómica ha ido disminuyendo constantemente, haciéndola más accesible para las comunidades de investigación. Además, los avances en la tecnología y los métodos de análisis de datos han hecho que la transcriptómica sea más eficiente y rentable, aumentando aún más su accesibilidad2.

En este protocolo, describimos un sistema exploratorio y de alta dimensión para el cribado de fármacos basado en transcriptoma, combinando cultivos de perturbaciones miniaturizados con análisis transcriptómicos minimasivos 5,6. Con este protocolo, es posible reducir el coste por muestra a 1/6 del coste actual de las soluciones comerciales para la secuenciación completa de ARNm. El protocolo solo requiere equipos de laboratorio estándar, con la única excepción del uso de tecnologías de secuenciación de lectura corta, que pueden subcontratarse si los instrumentos de secuenciación no están disponibles internamente. El protocolo minimasivo optimizado proporciona señales biológicas ricas en información a una profundidad de secuenciación rentable, lo que permite un cribado exhaustivo de fármacos conocidos y nuevas moléculas.

El objetivo del experimento es detectar la actividad farmacológica de las PBMC en diferentes contextos biológicos. Este protocolo se puede aplicar a cualquier cuestión biológica en la que se deban probar varios fármacos con una lectura transcriptómica, lo que proporciona una visión de todo el transcriptoma del efecto celular del tratamiento.

Protocol

Este protocolo sigue las directrices de los comités locales de ética de la Universidad de Bonn. 1. Preparación de tampones, soluciones y equipos Prepare las soluciones y reúna los materiales descritos en la Tabla de materiales. Calentar el baño de agua a 37 °C y calentar todo el medio de cultivo (RPMI-1640 + 10% de suero fetal de ternero (FCS) + 1% de penicilina/estreptomicina). Para la recolección de células, use solució…

Representative Results

Siguiendo el protocolo informado, las PBMC humanas se sembraron, se trataron con diferentes fármacos inmunomoduladores y, después de diferentes tiempos de incubación, se cosecharon para su análisis transcriptómico masivo utilizando el protocolo de secuenciación (Figura 1). Las concentraciones ideales del fármaco y los tiempos de incubación de los compuestos problema deben identificarse antes de este protocolo con la ayuda de estrategias experimentales comp…

Discussion

El descubrimiento y el desarrollo de fármacos pueden beneficiarse enormemente de la visión holística de los procesos celulares que puede proporcionar la transcriptómica masiva. Sin embargo, este enfoque a menudo se ve limitado por el alto costo del experimento con el protocolo estándar de secuenciación de ARN a granel, lo que prohíbe su aplicación en entornos académicos, así como su potencial de escalabilidad industrial.

Los pasos más críticos del protocolo son la descongelación c…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.L.S. cuenta con el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania (EXC2151-390873048), así como en el marco de la SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, el proyecto de excelencia financiado por BMBF Diet-Body-Brain (DietBB); y el proyecto europeo SYSCID con el número de subvención 733100. M.B. cuenta con el apoyo de DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. cuenta con el apoyo de DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Proyecto número 513977171) y de la Estrategia de Excelencia de Alemania (EXC2151-390873048). Imágenes creadas con BioRender.com.

Materials

50 mL conical tube fisher scientific 10203001
Adhesive PCR Plate Seals Thermo Fisher Scientific AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM) Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads Beckman Coulter A 63881
Betaine  Sigma-Aldrich 61962
Cell culture grade 96-well plates Thermo Fisher Scientific 260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) Integra Bioscience 158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each Fermentas R0192
DMSO Sigma-Aldrich 276855
DTT (100 mM) Invitrogen 18064-014
EDTA Sigma-Aldrich 798681 for adherent cells
Ethanol Sigma-Aldrich 51976
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 26140079
Filter tips (10 µL) Gilson  F171203
Filter tips (100 µL) Gilson  F171403
Filter tips (20 µL) Gilson  F171303
Filter tips (200 µL) Gilson  F171503
Guanidine Hydrochloride Sigma-Aldrich G3272
ISPCR primer (10 µM) Biomers.net GmbH SP10006 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) KAPA Biosystems KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)  Sigma-Aldrich M8266
Magnetic stand 96 Ambion AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer  Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer Illumina
Nuclease-free water Invitrogen 10977049
PBS Thermo Fisher Scientific AM9624
PCR 96-well plates Thermo Fisher Scientific AB0600
PCR plate sealer Thermo Fisher Scientific HSF0031
Penicillin / Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063
Qubit 4 fluorometer Invitrogen 15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) TAKARA 2313A
RPMI-1640 cell culture medium  Gibco 61870036 If not working with PBMCs, adjust to cell type 
SMART dT30VN primer Sigma-Aldrich 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standard lab equipment various various e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) Thermo Fisher Scientific 18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) Thermo Fisher Scientific 18064-014
Tagment DNA Buffer (TD) Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200 Agilent G2991BA
Thermocycler (S1000) Bio-Rad 1852148
TSO-LNA (100 uM) Eurogentec 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer Sigma-Aldrich Z258415

References

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
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check_url/fr/65930?article_type=t

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Citer Cet Article
Leidner, J., Theis, H., Kraut, M., Ragogna, A., Beyer, M., Schultze, J., Schulte-Schrepping, J., Carraro, C., Bonaguro, L. Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening. J. Vis. Exp. (204), e65930, doi:10.3791/65930 (2024).

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