Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo – oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.
Abstract
Die Transkriptomik ermöglicht es, umfassende Einblicke in zelluläre Programme und deren Reaktionen auf Störungen zu erhalten. Obwohl die Kosten für die Herstellung und Sequenzierung von Bibliotheken in den letzten zehn Jahren erheblich gesunken sind, ist die Anwendung dieser Technologien in dem für das Drogenscreening erforderlichen Umfang nach wie vor unerschwinglich teuer, was das immense Potenzial dieser Methoden behindert. Unsere Studie stellt ein kostengünstiges System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening vor, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik kombiniert. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informative biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Wirkstoffe und neuer Moleküle. Abhängig von der gewählten Behandlung und der Inkubationszeit führt dieses Protokoll innerhalb von ca. 2 Tagen zur Sequenzierung von Bibliotheken. Durch mehrere Haltepunkte innerhalb dieses Protokolls kann sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Sequenzierung zeitunabhängig durchgeführt werden. Die gleichzeitige Verarbeitung einer hohen Anzahl von Proben ist möglich; Die Messung von bis zu 384 Proben wurde ohne Verlust der Datenqualität getestet. Es gibt auch keine bekannten Beschränkungen für die Anzahl der Erkrankungen und/oder Medikamente, trotz der Berücksichtigung der Variabilität der optimalen Inkubationszeiten von Arzneimitteln.
Introduction
Die Entwicklung neuer Arzneimittel ist ein komplexer und zeitaufwändiger Prozess, der die Identifizierung potenzieller Arzneimittel und ihrer Ziele, die Optimierung und Synthese von Arzneimittelkandidaten sowie die Prüfung ihrer Wirksamkeit und Sicherheit in präklinischen und klinischen Studien umfasst1. Traditionelle Methoden für das Wirkstoff-Screening, d. h. die systematische Bewertung von Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten für therapeutische Zwecke, beinhalten die Verwendung von Tiermodellen oder zellbasierten Assays, um die Auswirkungen auf bestimmte Ziele oder Signalwege zu testen. Diese Methoden waren zwar erfolgreich bei der Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, lieferten aber oft keine ausreichenden Einblicke in die komplexen molekularen Mechanismen, die der Wirksamkeit von Medikamenten sowie der Toxizität und den Mechanismen potenzieller Nebenwirkungen zugrunde liegen.
Die Bewertung genomweiter Transkriptionszustände stellt einen leistungsstarken Ansatz dar, um die derzeitigen Einschränkungen des Wirkstoffscreenings zu überwinden, da sie eine umfassende Bewertung der Genexpression als Reaktion auf Arzneimittelbehandlungen ermöglicht2. Durch die Messung von RNA-Transkripten in einer genomweiten Weise, die zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird, zielt die Transkriptomik darauf ab, einen ganzheitlichen Überblick über die transkriptionellen Veränderungen zu erhalten, die als Reaktion auf Medikamente auftreten, einschließlich Änderungen der Genexpressionsmuster, alternatives Spleißen und nicht-kodierender RNA-Expression3. Diese Informationen können verwendet werden, um Arzneimittelziele zu bestimmen, die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln vorherzusagen und die Dosierung und Behandlung von Medikamenten zu optimieren.
Einer der Hauptvorteile der Kombination von Transkriptomik und unvoreingenommenem Wirkstoff-Screening ist das Potenzial, neue Wirkstoffziele zu identifizieren, die bisher nicht in Betracht gezogen wurden. Herkömmliche Wirkstoff-Screening-Ansätze konzentrieren sich oft auf etablierte Zielmoleküle oder -wege, was die Identifizierung neuer Zielmoleküle behindert und möglicherweise zu Medikamenten mit unvorhergesehenen Nebenwirkungen und eingeschränkter Wirksamkeit führt. Die Transkriptomik kann diese Einschränkungen überwinden, indem sie Einblicke in die molekularen Veränderungen liefert, die als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung auftreten, und potenzielle Ziele oder Signalwege aufdeckt, die bisher möglicherweise nicht in Betracht gezogen wurden2.
Neben der Identifizierung neuer Wirkstoffziele kann die Transkriptomik auch zur Vorhersage der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten verwendet werden. Durch die Analyse der Genexpressionsmuster, die mit Arzneimittelreaktionen verbunden sind, können Biomarker entwickelt werden, mit denen das Ansprechen eines Patienten auf ein bestimmtes Medikament oder Behandlungsschema vorhergesagt werden kann. Dies kann auch dazu beitragen, die Medikamentendosierung zu optimieren und das Risiko unerwünschter Nebenwirkungen zu verringern4.
Trotz ihrer potenziellen Vorteile bleiben die Kosten der Transkriptomik ein erhebliches Hindernis für ihre breite Anwendung im Wirkstoffscreening. Die Transkriptomanalyse erfordert spezielle Geräte, technisches Fachwissen und Datenanalysen, was es für kleinere Forschungsteams oder Organisationen mit begrenzten Mitteln schwierig machen kann, Transkriptomik im Arzneimittelscreening einzusetzen. Die Kosten für die Transkriptomik sind jedoch stetig gesunken, was sie für die Forschungsgemeinschaften zugänglicher macht. Darüber hinaus haben Fortschritte in der Technologie und in den Datenanalysemethoden die Transkriptomik effizienter und kostengünstiger gemacht, wodurch ihre Zugänglichkeit weiter verbessertwurde 2.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein hochdimensionales und exploratives System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik-Analyse kombiniert 5,6. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kosten pro Probe auf 1/6 der derzeitigen Kosten kommerzieller Lösungen für die mRNA-Sequenzierung in voller Länge zu senken. Das Protokoll erfordert nur Standard-Laborgeräte, die einzige Ausnahme ist die Verwendung von Short-Read-Sequenzierungstechnologien, die ausgelagert werden können, wenn Sequenziergeräte nicht im eigenen Haus verfügbar sind. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informationsreiche biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Medikamente und neuer Moleküle.
Ziel des Experiments ist es, die Wirkstoffaktivität auf PBMCs in verschiedenen biologischen Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf jede biologische Fragestellung angewendet werden, bei der mehrere Medikamente mit einer transkriptomischen Auslesung getestet werden sollten, um einen transkriptomweiten Überblick über die zelluläre Wirkung der Behandlung zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Arzneimittelforschung und -entwicklung kann stark von der ganzheitlichen Sicht auf zelluläre Prozesse profitieren, die die Bulk-Transkriptomik bieten kann. Dieser Ansatz wird jedoch oft durch die hohen Kosten des Experiments mit dem Standard-Bulk-RNA-seq-Protokoll eingeschränkt, was seine Anwendung im akademischen Umfeld sowie sein Potenzial für industrielle Skalierbarkeit verbietet.
Die kritischsten Schritte des Protokolls sind das Auftauen der Zellen und die ersten Schritte der Biblio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie (EXC2151-390873048) sowie im Rahmen von SCHU 950/8-1 gefördert; GRK 2168, TP11; SFB 1454 Metaflammation, IGK GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, das BMBF-geförderte Exzellenzprojekt Ernährung-Körper-Gehirn (DietBB); und das EU-Projekt SYSCID unter der Fördernummer 733100. M.B. wird von der DFG gefördert (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. wird gefördert durch die DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Projektnummer 513977171) und die Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder (EXC2151-390873048). Bilder, die mit BioRender.com erstellt wurden.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
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