בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית
Summary
פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.
Abstract
תמלול מאפשר לקבל תובנות מקיפות על תוכניות סלולריות ותגובותיהן להפרעות. למרות ירידה משמעותית בעלויות הייצור והריצוף של ספריות בעשור האחרון, יישום טכנולוגיות אלה בהיקף הדרוש לסינון תרופות נותר יקר מאוד, וחוסם את הפוטנציאל העצום של שיטות אלה. המחקר שלנו מציג מערכת חסכונית לבדיקת תרופות מבוססת תמלול, המשלבת תרביות הפרעה ממוזערות עם מיני-תמלול בתפזורת. פרוטוקול המיני-צובר הממוטב מספק אותות ביולוגיים אינפורמטיביים בעומק ריצוף חסכוני, ומאפשר סינון נרחב של תרופות ידועות ומולקולות חדשות. בהתאם לזמן הטיפול והדגירה שנבחר, פרוטוקול זה יביא לספריות רצף תוך כיומיים. בשל מספר נקודות עצירה בפרוטוקול זה, הכנת הספרייה, כמו גם הרצף, יכולים להתבצע ללא תלות בזמן. עיבוד בו זמנית מספר גבוה של דגימות אפשרי; מדידה של עד 384 דגימות נבדקה ללא אובדן איכות הנתונים. כמו כן, לא ידועות מגבלות על מספר המצבים ו/או התרופות, למרות שלוקחים בחשבון את השונות בזמני הדגירה האופטימליים של התרופה.
Introduction
פיתוח תרופות חדשות הוא תהליך מורכב וגוזל זמן הכולל זיהוי תרופות פוטנציאליות ומטרותיהן, אופטימיזציה וסינתזה של תרופות מועמדות ובדיקת יעילותן ובטיחותן בניסויים פרה-קליניים וקליניים1. שיטות מסורתיות לסינון תרופות, כלומר, הערכה שיטתית של ספריות של תרכובות מועמדות למטרות טיפוליות, כוללות שימוש במודלים של בעלי חיים או בדיקות מבוססות תאים כדי לבחון את ההשפעות על מטרות או מסלולים ספציפיים. בעוד ששיטות אלה הצליחו לזהות מועמדים לתרופה, לעתים קרובות הן לא סיפקו תובנות מספקות לגבי המנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס יעילות התרופה וגם רעילות ומנגנונים של תופעות לוואי אפשריות.
הערכת מצבי שעתוק כלל גנומיים מציגה גישה רבת עוצמה להתגברות על המגבלות הנוכחיות בבדיקת תרופות, שכן היא מאפשרת הערכה מקיפה של ביטוי גנים בתגובה לטיפולים תרופתיים2. על ידי מדידת תעתיקי RNA באופן כלל גנומי המתבטא בזמן נתון, שעתוק שואפת לספק מבט הוליסטי על שינויי השעתוק המתרחשים בתגובה לתרופות, כולל שינויים בדפוסי ביטוי גנים, שחבור חלופי וביטוי RNA לא מקודד3. ניתן להשתמש במידע זה כדי לקבוע מטרות לתרופות, לחזות יעילות ורעילות של תרופות ולמטב את מינון התרופות ואת משטרי הטיפול.
אחד היתרונות המרכזיים של שילוב תמלול עם סינון סמים בלתי משוחד הוא הפוטנציאל לזהות מטרות סמים חדשות שלא נלקחו בחשבון בעבר. גישות קונבנציונליות לסינון תרופות מתמקדות לעתים קרובות במולקולות מטרה או מסלולים מבוססים, מעכבים את זיהוי המטרות החדשות ועלולים לגרום לתרופות עם תופעות לוואי בלתי צפויות ויעילות מוגבלת. Transcriptomics יכול להתגבר על מגבלות אלה על ידי מתן תובנות לגבי השינויים המולקולריים המתרחשים בתגובה לטיפול תרופתי, חשיפת מטרות פוטנציאליות או מסלולים שאולי לא נחשבו בעבר2.
בנוסף לזיהוי מטרות תרופות חדשות, ניתן להשתמש בתמלול גם כדי לחזות יעילות ורעילות של תרופות. על ידי ניתוח דפוסי ביטוי הגנים הקשורים לתגובות לתרופות, ניתן לפתח סמנים ביולוגיים שניתן להשתמש בהם כדי לחזות את תגובת המטופל לתרופה מסוימת או למשטר טיפול מסוים. זה יכול גם לעזור לייעל את מינון התרופה ולהפחית את הסיכון לתופעות לוואי שליליות4.
למרות היתרונות הפוטנציאליים שלה, עלות התמלול נותרה מחסום משמעותי ליישומה הנרחב בסינון תרופות. ניתוח תמלול דורש ציוד מיוחד, מומחיות טכנית וניתוח נתונים, מה שיכול להקשות על צוותי מחקר קטנים יותר או ארגונים עם מימון מוגבל להשתמש בתמלול בסינון תרופות. עם זאת, עלות התמלול יורדת בהתמדה, מה שהופך אותה לנגישה יותר לקהילות המחקר. בנוסף, התקדמות הטכנולוגיה ושיטות ניתוח הנתונים הפכו את התמלול ליעיל וחסכוני יותר, והגדילו עוד יותר את נגישותו2.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת רב-ממדית וחקרנית לבדיקת תרופות מבוססת תמלול, המשלבת תרביות הפרעה ממוזערות עם ניתוח תמלול בתפזורתקטנה 5,6. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להפחית את העלות לדגימה ל -1/6 מהעלות הנוכחית של פתרונות מסחריים לריצוף mRNA באורך מלא. הפרוטוקול דורש רק ציוד מעבדה סטנדרטי, כאשר היוצא מן הכלל היחיד הוא השימוש בטכנולוגיות ריצוף בקריאה קצרה, שניתן לבצע במיקור חוץ אם מכשירי ריצוף אינם זמינים בתוך החברה. פרוטוקול המיני-צובר הממוטב מספק אותות ביולוגיים עשירים במידע בעומק ריצוף חסכוני, ומאפשר סריקה נרחבת של תרופות ידועות ומולקולות חדשות.
מטרת הניסוי היא לסנן פעילות תרופתית על PBMCs בהקשרים ביולוגיים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל שאלה ביולוגית שבה מספר תרופות צריכות להיבדק עם קריאה תמלולית, נותן מבט רחב על התעתיק של ההשפעה התאית של הטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
גילוי תרופות ופיתוח תרופות יכולים להפיק תועלת רבה מהראייה ההוליסטית של תהליכים תאיים שתעתיק בתפזורת יכול לספק. עם זאת, גישה זו מוגבלת לעתים קרובות על ידי העלות הגבוהה של הניסוי עם פרוטוקול RNA-seq סטנדרטי בתפזורת, האוסר על יישומו במסגרות אקדמיות, כמו גם הפוטנציאל שלו למדרגיות תעשייתית.
<p cla…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. נתמכת על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה (EXC2151-390873048), כמו גם תחת SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, פרויקט מצוינות במימון BMBF דיאטה-גוף-מוח (DietBB); ופרויקט האיחוד האירופי SYSCID תחת מענק מספר 733100. מ.ב. נתמך על ידי DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. נתמכת על ידי DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – פרויקט מספר 513977171) ואסטרטגיית המצוינות של גרמניה (EXC2151-390873048). תמונות שנוצרו באמצעות BioRender.com.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
