Summary
小菌落在念珠菌属耐药性中的意义尚未得到充分探索。抗菌光动力疗法 （aPDT） 提供了一种对抗耐药性真菌感染的有前途的策略。这项研究表明，孟加拉玫瑰介导的 aPDT 可有效灭活 光滑念珠菌 并诱导小菌落，呈现出独特的过程。
Abstract
面对念珠菌血症患者40%的死亡率，耐药念珠菌及其娇小的突变体仍然是一个主要的治疗挑战。与抗生素/抗真菌药不同，抗菌光动力疗法 （aPDT） 针对多种真菌结构，可能会阻碍耐药性。诱导小菌落的传统方法依赖于溴化乙锭或氟康唑，它们会影响药物敏感性和应激反应。本研究调查了绿光（峰值 520 nm）和孟加拉玫瑰 （RB） 光敏剂在对抗耐药性光滑念珠菌分离株中的应用。研究结果显示，aPDT处理显著抑制细胞生长（减少99.9%≥）并有效诱导小集落形成，如线粒体氧化还原指示剂染色尺寸减小和丢失所证明的那样。这项研究提供了初步证据，表明 aPDT 可以在体外诱导多重耐药光滑念珠菌菌株中的小菌落，为对抗耐药性真菌感染提供了一种潜在的变革性方法。
Introduction
真菌感染，特别是由白色念珠菌和日益耐药的光滑念珠菌引起的真菌感染，构成了严重的全球威胁1.这些感染可能是致命的，特别是对于住院患者和免疫系统较弱的患者。抗真菌耐药性的上升威胁到侵袭性念珠菌病的控制，侵袭性念珠菌病是一种严重的真菌感染，死亡率很高，尤其是白色念珠菌 2。耐药菌株阻碍了有效的治疗，可能会增加复杂性和死亡率。在美国加利福尼亚州阿拉米达县，C. glabrata 已成为最普遍的入侵物种3.念珠菌属流行率和分布的这种变化可能受到当地医疗保健实践、患者人口统计学、抗真菌药物的使用以及念珠菌感染危险因素的流行率的影响。
念珠菌中的娇小突变体缺乏功能性线粒体，揭示了这种细胞器如何影响药物反应、毒力和抗逆性 4,5。C. glabrata 很容易形成这些菌落，对多烯敏感，而对唑类6 失去敏感性。唑类药物敏感性和呼吸功能有着错综复杂的联系，呼吸减弱会通过线粒体 DNA 丢失导致抵抗7。已从接受氟康唑治疗的骨髓移植受者8 和血流感染患者的血培养瓶9 中分离出具有唑类耐药性的 C. glabrata 小菌落。它们在耐药性、毒力和应激反应方面的潜在影响凸显了其临床意义。此外，它们的独特特性使它们成为研究线粒体生物学基本问题的宝贵工具5。随着对娇小突变体研究的继续，它们在临床和基础研究中的应用可能会扩大。
这项研究发现，光动力疗法（PDT）可以诱导 光滑梭菌中的小菌落，扩大了 将光滑梭 菌暴露于溴化乙锭或氟康唑的传统技术之外的方法范围。
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Protocol
1. 光滑梭菌的培养
注：对大多数抗真菌剂（包括氟康唑）具有耐药性的多重耐药 光滑念珠菌 （C2-1000907）用于实验。实验条件可能需要根据特定菌株进行调整，因为不同菌株之间可能存在差异。所有实验都使用在25°C下生长的对数期念珠菌（模拟自然感染）以确保一致性。与白色念珠菌相比， 光滑念珠菌缺乏菌丝简化了定量， 白色念珠菌在37°C时形成菌丝10。
- 为了制备 光滑念珠菌的对数期培养物，从琼脂平板中挑选一个菌落，并将其转移到装有 3 mL 无菌酵母蛋白胨葡萄糖 （YPD） 培养基的玻璃试管中（参见 材料表）。在25°C下振荡孵育14-16小时（155rpm，45°角以增加对介质的空气传输）。
- 孵育后，使用无菌技术将新鲜 YPD 培养物稀释至 OD600 为 0.1。在25°C孵育6小时，以155rpm振荡。通过测量 OD600 来验证 C. glabrata 的对数阶段。目标为 0.65-1.00，相当于 1 × 10 7-1.5 × 10 7 个细胞/mL。
2. 通过溴化乙锭、氟康唑和光动力疗法诱导小菌落
- 溴化乙锭小菌落诱导
- 将酵母悬浮液调节至 OD600 为 0.1 （5 × 106 个细胞/mL），使用 YPD 至终体积为 3 mL，然后加入 30 μL 溴化乙锭储备液 （10 mg/mL）（参见 材料表），终浓度为 100 μg/mL。
- 将酵母悬浮液在25°C，155rpm，45°角下孵育过夜（16-18小时）。调节至 OD600 为 0.65 （1 × 107 个细胞/mL）。通过在 96 孔板中进行 10 倍稀释系列，方法是将 20 μL 调整后的酵母悬浮液添加到每孔 180 μL 的 PBS 中。这会产生六种稀释度，范围从 10-1 到 10-5。
- 选择 4 种稀释因子（例如，100、101、102 和 103），并在 YPD 琼脂平板的 4 个象限上各平板 3 滴 （20 μL）（一式三份）。
- 将板在37°C孵育过夜。 从先前选择的稀释液中选择具有 5-80 个菌落的象限，用于三苯基氯化四氮唑 （TTC） 染色11 （参见步骤 3）。使用 48 位全彩色光学扫描仪以 1200 dpi 扫描印版。
- 氟康唑小菌落诱导
注意：为了加快该过程，使用T3细胞（3次RB-PDT处理后获得的正常细胞和小细胞的混合物;参见步骤2.3）进行氟康唑诱导的小型菌落形成。这是因为标准治疗通常会导致形成速度减慢。- 按照步骤 2.1.1 中所述准备和调整酵母细胞悬浮液。
- 在25°C孵育过夜（16-18小时）。 再次将 OD600 调整到 0.1。
- 将 1 mL 调整后的悬浮液转移到无菌 5 mL 管中。
- 将无菌棉签（长 15 厘米，尖端为 0.9 厘米 x 2.6 厘米，参见 材料表）浸入酵母悬浮液中，确保与管底部接触并扭转以去除管壁上多余的液体。
- 使用Mueller-Hinton琼脂在罩中制备板（参见 材料表）。
- 将棉花在琼脂上来回擦拭，旋转 60° 两次，然后擦拭周边以均匀覆盖。
- 将镊子在火焰上灭菌 1-2 秒，让它们短暂冷却，然后用它们捡起空白的圆盘。
- 使用记号笔将板分成三个相等的扇区。将一个空白磁盘放在每个扇区的中心。
- 向每个圆盘（25μg/圆盘）中加入12.5μL氟康唑原液（2mg / mL，参见 材料表），充分混合以避免气泡，并在37°C下孵育20-24小时。
- 进行TTC染色（参见步骤3）。使用 48 位全彩色光学扫描仪以 1200 dpi 扫描印版。
- PDT小菌落诱导
注意：不同的真菌在 PDT 后可能会产生不同数量的小菌落。有些菌株可能根本不会产生任何菌株。- 准备 aPDT 系统。
注意：aPDT 系统设备的设置程序遵循 Hung 等人12 报告的方法。简而言之，aPDT 系统由一个绿色 LED 阵列组成，其峰值为 520 nm（参见 材料表），从底部照射光线，与 96 孔板的每个孔均具有良好的对准性。 - 将YPD培养基中的酵母细胞悬浮液调节至OD600 为0.65（约1×107 个细胞/ mL）。
- 将 1 mL 酵母悬浮液与 111 μL 2% 孟加拉玫瑰（RB， 图 1）（参见 材料表）混合在圆盖管中，最终 RB 浓度为 0.2%。将混合物在25°C孵育15分钟，以155rpm以45°角旋转。
- 将混合物转移到 1.5 mL 微量离心管中，并以 16,100 x g 离心 2.5 分钟（室温）。
- 丢弃上清液，在引擎盖地板上轻轻刮试管五次，以重新悬浮沉淀。
- 用1x PBS洗涤悬浮液四次，以除去所有RB。每次洗涤后，通过短暂的涡旋或移液将颗粒重新悬浮以彻底重悬。
- 最终洗涤后，加入 1000 μL PBS。溶液是浅粉红色。将 200 μL 洗涤的负载 RB 的酵母悬浮液转移到 96 孔板（一式三份）中的三个孔中的每一个。
- 将 96 孔板放在光动力光系统上，LED 灯泡从下方发出绿光。关闭室内灯，确保照明均匀，防止干扰。激活 LED 灯系统以在 2 分钟内提供 4.38 J/cm 2 的 PDT 剂量;确保系统与孔正确对齐。
- 辐照后，在 96 孔板中稀释酵母悬浮液。将 20 μL 酵母悬浮液加入含有 180 μL PBS 的孔中，产生 10 倍稀释度。对剩余的稀释液重复上述步骤，以达到 10-1 至 10-5 的范围。
- 根据酵母细胞浓度调节选择四种稀释因子（例如，10-2 至 10-5）。
- 对于每种稀释因子，在YPD琼脂平板上每象限平板3滴（每滴20μL）。
- 酵母悬浮液完全吸收后，通过琼脂平板约10分钟，倒置并在37°C下孵育过夜。
- 将 T0 定义为未经 PDT 处理的对照亲本 C. glabrata 。如上所述，在对数生长阶段制备T0真菌，并在0.2%RB存在下将它们暴露于4.38J /cm 2 绿光下。这种 PDT 条件始终抑制 3 至 3.5 个对数的真菌生长。
- 将存活的真菌表示为 T1，并在它们在体外扩增到对数生长阶段后再次将它们暴露于相同的 PDT 剂量。第二次 PDT 后存活的真菌表示为 T2，依此类推。
- 第二天，选择菌落数量在 5 到 80 之间的象限。计算每个象限中的菌落数，并使用以下公式计算滴度：菌落形成单位 （CFU）/mL = 菌落数（一式三份的平均值） ×稀释因子 × 50。
- 进行TTC染色（参见步骤3）。如前所述扫描板（步骤 2.2）。
- 准备 aPDT 系统。
3.线粒体功能分析（TCC染色试验）
注意：TTC 是一种氧化还原指示剂和电子受体。当白色化合物被电子11 破坏时，它会变成红色。请注意，并非所有细胞都必须在琼脂平板上培养后 24 小时内形成可见的菌落。具有功能性线粒体的菌落变成红色，而具有非功能性线粒体的菌落保持白色。这使得区分具有不同线粒体功能的菌落。
- 处理后，根据所需的细胞密度在YPD琼脂平板上稀释念珠菌悬浮液，以获得不同的菌落，以便于观察和染色。
- 在37°C下生长24小时后，从单个细胞形成可见菌落。将 20 μL 20% TTC 直接移液到每个菌落的中心。
- 完全吸收后，菌落约10分钟的TTC，在37°C孵育30-40分钟。
4. 正常和娇小的光滑梭菌的生长动力学
注：比较了三种酵母菌株： 光滑念珠菌 C2-1000907 T0（未经 PDT 处理的临床分离物）、T3n（连续 3 次 RB-PDT 后光滑念 珠菌 C2-1000907 表现出平均直径为 1.5 ± 0.8 mm 与亲本细胞相似）和 T3p（连续 3 次 RB-PDT 后 光滑念珠菌 C2-1000907 的小型菌落）。
- 在 3 mL 管中将 YPD 培养基中的酵母细胞悬浮液调节至 OD600 为 0.1 （5 × 106 个细胞/mL）。
- 使用多模式酶标仪（参见材料表）每20分钟自动测量静态培养物的OD600，持续24小时。
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Representative Results
数据以平均值表示，标准误差±，来自三个独立实验，每组至少一式三份。实验数据，包括菌落计数、OD600 测量值和 TTC 染色结果，使用绘图和统计软件进行绘图和统计分析（参见 材料表）。使用单因素方差分析或 t 检验 来分析数据， p 值 <0.05 被认为是显著的。使用 48 位全彩光学扫描仪以 1200 dpi 的分辨率进行扫描，随后使用 ImageJ 软件进行菌落直径的测量。
如图 2 中的生长曲线所示，与未经处理的正常大小 （T0） 的亲本真菌相比， 光滑念 珠菌 C2-1000907 （T3p） 的小型突变体表现出较慢的生长。当 将光滑梭 菌与0.2%RB混合15分钟并暴露于4.38 J /cm 2 绿光（PDT处理）时，真菌的滴度从107.5 CFU / mL降低到104.5 CFU / mL（至少3个log， 图3）与对照组（仅RB）相比，其细胞密度约为107 CFU / mL。此外，在 aPDT 之后，观察到小菌落。这些娇小菌落的平均尺寸为0.4 mm±0.25 mm，而不是通常的1.5 mm±0.8 mm（图4A）。用 20% TTC 染色后，可以通过其大小和颜色来识别具有线粒体功能障碍的小尺寸菌落。保持白色的娇小菌落（图3B，白色箭头）表现出线粒体功能障碍，而一些较小的红色菌落和正常大小的菌落保留了正常的线粒体功能（图4B）。传统的DNA嵌入剂溴化乙锭（图4C）和氟康唑（图4D）可以有效诱导念珠菌的小型突变体。圆盘扩散是一种定义真菌中药物敏感性的简单方法。 在图4D中，在T0培养物（无PDT）中含有25μg氟康唑的氟康唑盘周围有一个明显的无生长环，表明这种亲本真菌的耐药性较低。尽管如此， 光滑念 珠菌 C2-1000907 仍被定义为对氟康唑的最小抑制浓度（数据未显示）和透明区的直径的抗性菌株。在 T3 培养物中，在椎间盘附近形成许多娇小的菌落（箭头，下图），表明在三次重复 PDT 处理后具有耐药性。
图1：孟加拉玫瑰（RB）的分子结构。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：重复 RB-PDT 后 24 小时 光滑梭 菌 C2-1000907 的生长曲线。 比较了三种菌株的生长曲线： 光滑念珠菌 C2-1000907 T0（幼稚亲本细胞）、T3n（3 次重复处理后菌落大小正常）和 T3p（3 次重复处理后小菌落）。与 T0 和 T3n 相比，T3p 菌落的生长速率明显较慢 （n = 3， p < 0.05）。所有细胞都在YPD培养基中生长。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3： aPDT 后 C2-1000907 的生长抑制。 与幼稚对照组相比，4.38 J/cm² 光剂量和 0.2% RB 的单次 aPDT 处理显着抑制了 C. glabrata C2-1000907 的生长 3 个对数 （p < 0.0001，不配对 t 检验）。误差线代表 SEM ±平均值，数据来自 3 个独立实验。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：使用三苯基氯化四唑 （TCC） 染色的线粒体功能障碍分析。 （A） C. glabrata C2-1000907，aPDT 处理后 24 小时（0.2% RB，4.38 J/cm² 绿光），显示双峰菌落大小分布，具有大 （1.5 mm ± 0.8 mm） 和小 （娇小） 菌落 （0.4 mm ± 0.25 mm）。（B） TCC染色显示，大的菌落是功能性的，因为它们变成红色，而小的菌落是无功能的，因为它们仍然是白色的。（C） 溴化乙锭（100 μg/mL，30-40 分钟）和 （D） 氟康唑（25 μg/mL）处理也诱导小菌落。在T0培养物（无PDT）中，含有25μg氟康唑的氟康唑盘周围有一个明显的无生长的圆形区域，表明敏感性。在 T3 培养物中，在椎间盘附近形成许多娇小的菌落（箭头，下图），表明在三次重复 PDT 处理后具有耐药性。比例尺： 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这项研究揭示了 PDT 是首次报道的诱导念珠菌中小群体形成的方法，超过了溴化乙锭和氟康唑的既定作用。这一新颖的观察结果需要进一步探索，以揭示其通过降低毒力和耐药机制的出现来根除真菌的影响。
RB 介导的 PDT 有效抑制 光滑念珠菌的生长，为念珠菌感染提供了一种潜在的替代治疗方法。作为一种光激活光敏剂，RB 在暴露于特定波长时会产生单线态氧和活性氧 （ROS）。这种氧化应激会对脂质、蛋白质和核酸等基本细胞成分造成损害13，从而导致线粒体功能障碍，如本研究所示。这使得念珠菌很难通过标准抗真菌药物观察到的常规机制产生耐药性。
本研究中使用的三种酵母菌株 T0、T3n 和 T3p 表现出不同的生长模式。T0 仍未治疗，而 T3n 和 T3p 接受 RB-PDT 三次。T3n 显示正常大小的菌落，而 T3p 显示小菌落。娇小菌落的生长较慢可能表明细胞能量和新陈代谢发生了变化。娇小的表型通常与线粒体功能障碍4 有关，可能导致有氧呼吸受损，从而影响整体生长动力学。小群体的有氧呼吸受损可能会影响它们的毒力、药物敏感性或在不同环境中持续存在的能力。这种联系具有潜在的临床意义，并为未来的研究方向提供了途径。
Ethidium bromide 是一种 DNA 嵌入剂，可抑制线粒体 DNA 合成并降解现有的线粒体 DNA，将念珠菌转化为具有线粒体功能障碍的小菌落14。氟康唑通常用于治疗念珠菌感染，可诱导光滑念珠菌 6 的耐药性和娇小菌落发育。娇小突变体可能通过激活转录因子 PDR1 及其对基因 CDR1 和 CDR2 的调控表现出唑类耐药性15。此外，由于线粒体 DNA 的部分或完全丢失，线粒体功能受到损害16。
PDT 已被证明在降低细菌毒力17、诱导对抗生素的敏感性18 和减少细菌中生物膜的形成19 方面具有功效。关于PDT对抗真菌感染的研究有限20.这一发现提出了关于RB-PDT如何影响 C. glabrata中线粒体的有趣问题。为了充分理解RB-PDT如何影响酵母细胞，了解导致生长变化的分子机制至关重要。然而，PDT诱导的小型突变体目前研究不足，其详细的机制基础尚不清楚。需要进一步的研究，以确定由各种方法创建的小菌落之间是否存在任何差异。了解念珠菌物种中小石的形成方式对于研究线粒体功能与致病性之间的关系非常重要。此外，娇小的突变体可以作为探索抗真菌耐药机制的模型。
目前的研究虽然为RB介导的PDT对 光滑念珠菌 的影响和小群体的出现提供了宝贵的见解，但仍有一定的局限性，应该加以考虑。首先，该研究主要集中在体外实验上，将这些发现转化为临床环境值得进一步研究。此外，RB-PDT后形成小菌落的特定分子机制及其对抗真菌药物耐药性的潜在影响需要更深入的探索。此外，虽然该研究比较了不同酵母菌株的生长模式，但额外的分子和遗传分析可以更深入地了解与小菌落形成相关的代谢和遗传变化。
此外，本研究未解决 不同 临床分离株对 RB-PDT 反应的潜在变异性，这突出了更广泛的菌株特异性研究的必要性。解决这些局限性的未来研究对于更全面地理解 RB 介导的 PDT 和抗真菌治疗策略中小型菌落出现的影响至关重要。
综上所述，该研究揭示了aPDT诱导线粒体功能受损的 光滑念珠菌 （C2-1000907）小突变体。这种独特的机制可能为抗真菌研究提供一种新的方法。PDT诱导的小型菌落的确切作用机制仍有待阐明，探索与其他方法的潜在差异对于优化治疗策略至关重要。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了台湾科学技术部[MOST 110-2314-B-006-086-MY3]，国立成功大学[K111-B094]，[K111-B095]，台湾国立成功大学医院[NCKUH-11204031]，[NCKUMCS2022057]的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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