Summary
O significado de pequenas colônias em Candida spp. resistência a medicamentos não foi totalmente explorado. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) oferece uma estratégia promissora contra infecções fúngicas resistentes a medicamentos. Este estudo demonstra que a aPDT mediada por rosa bengala desativa efetivamente Candida glabrata e induz pequenas colônias, apresentando um procedimento único.
Abstract
Enfrentando uma taxa de mortalidade de 40% em pacientes com candidemia, a Candida resistente a medicamentos e seus pequenos mutantes continuam sendo um grande desafio de tratamento. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) tem como alvo várias estruturas fúngicas, ao contrário dos antibióticos/antifúngicos, potencialmente frustrando a resistência. Os métodos tradicionais para induzir colônias pequenas dependem de brometo de etídio ou fluconazol, que podem influenciar a suscetibilidade aos medicamentos e as respostas ao estresse. Este estudo investigou a aplicação de luz verde (pico de 520 nm) e fotossensibilizador de rosa bengala (RB) no combate a um isolado de Candida glabrata resistente a medicamentos. Os resultados revelaram que o tratamento com aPDT inibiu significativamente o crescimento celular (redução de ≥99,9%) e induziu efetivamente a formação de colônias pequenas, como evidenciado pela redução do tamanho e perda da coloração do indicador redox mitocondrial. Este estudo fornece evidências iniciais de que o aPDT pode induzir pequenas colônias em uma cepa de C. glabrata multirresistente in vitro, oferecendo uma abordagem potencialmente transformadora para combater infecções fúngicas resistentes.
Introduction
As infecções fúngicas, particularmente aquelas causadas por Candida albicans e Candida glabrata, cada vez mais resistentes, representam uma séria ameaça global1. Essas infecções podem ser mortais, especialmente para pacientes hospitalizados e aqueles com sistema imunológico enfraquecido. O aumento da resistência antifúngica ameaça o controle da candidíase invasiva, uma infecção fúngica grave com alta mortalidade, especialmente por Candida albicans2. Cepas resistentes dificultam o tratamento eficaz, aumentando potencialmente a complexidade e as taxas de mortalidade. No condado de Alameda, Califórnia, EUA, C. glabrata tornou-se a espécie invasora mais prevalente3. Essa mudança na prevalência e distribuição de espécies de Candida pode ser influenciada por práticas locais de saúde, dados demográficos do paciente, utilização de agentes antifúngicos e prevalência de fatores de risco para infecções por Candida.
Pequenos mutantes em Candida, sem mitocôndrias funcionais, revelam como essa organela afeta a resposta a medicamentos, virulência e resistência ao estresse 4,5. C. glabrata forma prontamente essas colônias, ganhando sensibilidade aos polienos e perdendo-a aos azóis6. A sensibilidade aos azóis e a função respiratória estão intrinsecamente ligadas, com a diminuição da respiração levando à resistência por meio da perda de DNA mitocondrial7. Pequenas colônias de C. glabrata com resistência aos azóis foram isoladas de amostras de fezes humanas de um receptor de transplante de medula óssea em tratamento com fluconazol8 e de frascos de hemocultura de pacientes com infecções da corrente sanguínea9. Suas implicações potenciais na resistência a medicamentos, virulência e resposta ao estresse destacam seu significado clínico. Além disso, suas propriedades distintas os tornam ferramentas valiosas para investigar questões fundamentais na biologia mitocondrial5. À medida que a pesquisa sobre pequenos mutantes continua, suas aplicações em pesquisas clínicas e básicas provavelmente se expandirão.
Este estudo descobriu que a terapia fotodinâmica (PDT) pode induzir pequenas colônias em C. glabrata, expandindo a gama de métodos além das técnicas tradicionais de exposição de C. glabrata ao brometo de etídio ou fluconazol.
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Protocol
1. Cultura de C. glabrata
NOTA: Um C. glabrata multirresistente (C2-1000907) que é resistente à maioria dos agentes antifúngicos, incluindo fluconazol, é usado para os experimentos. As condições experimentais podem precisar ser adaptadas à cepa específica, pois podem existir variações entre diferentes cepas. Todos os experimentos usaram Candida em fase logarítmica cultivada a 25 ° C (imitando a infecção natural) para consistência. A falta de hifas de C. glabrata simplifica a quantificação em comparação com C. albicans, que forma hifas a 37 °C10.
- Para preparar uma cultura em fase logarítmica de C. glabrata, pegue uma única colônia de uma placa de ágar e transfira-a para um tubo de ensaio de vidro com 3 mL de meio estéril de peptona dextrose de levedura (YPD) (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 14-16 h a 25 °C com agitação (155 rpm, ângulo de 45° para aumentar a transmissão de ar para o meio).
- Após a incubação, diluir a cultura com YPD fresco até um OD600 de 0,1 usando a técnica estéril. Incubar a 25 °C durante 6 h com agitação a 155 rpm. Verificar a fase logarítmica de C. glabrata medindo o OD600. Apontar para 0,65-1,00, o que corresponde a 1 × 10 7-1,5 × 107 células/mL.
2. Indução de pequenas colônias por brometo de etídio, fluconazol e terapia fotodinâmica
- Indução de colônias pequenas de brometo de etídio
- Ajuste uma suspensão de levedura para uma DO600 de 0,1 (5 × 106 células/mL) com YPD para um volume final de 3 mL e, em seguida, adicione 30 μL de estoque de brometo de etídio (10 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 μg/mL.
- Incubar a suspensão de levedura durante a noite (16-18 h) a 25 °C, 155 rpm, ângulo de 45°. Ajuste para um OD600 de 0,65 (1 × 107 células/mL). Realize uma série de diluição de 10 vezes em uma placa de 96 poços, adicionando 20 μL da suspensão de levedura ajustada a 180 μL de PBS por poço. Isso cria seis diluições que variam de 10-1 a 10-5.
- Selecione 4 fatores de diluição (por exemplo, 100, 101, 102 e 103) e 3 gotas de 3 (20 μL) cada um em 4 quadrantes de placas de ágar YPD (triplicado).
- Incubar as placas durante a noite a 37 °C. Selecione quadrantes com 5-80 colônias das diluições escolhidas anteriormente para a coloração de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)11 (consulte a etapa 3). Digitalize as chapas a 1200 dpi usando um scanner óptico colorido de 48 bits.
- Indução de colônias pequenas de fluconazol
NOTA: Para agilizar o processo, use células T3 (uma mistura de células normais e pequenas obtidas após 3 tratamentos RB-PDT; consulte a etapa 2.3) para a formação de colônias pequenas induzidas por fluconazol. Isso ocorre porque o tratamento padrão geralmente resulta em uma formação mais lenta.- Prepare e ajuste uma suspensão de células de levedura conforme descrito na etapa 2.1.1.
- Incubar durante a noite (16-18 h) a 25 °C. Ajuste o OD600 para 0.1 novamente.
- Transfira 1 mL da suspensão ajustada para um tubo estéril de 5 mL.
- Mergulhe um cotonete estéril (15 cm de comprimento, com ponta de 0,9 cm x 2,6 cm, consulte a Tabela de Materiais) na suspensão de levedura, garantindo o contato com o fundo do tubo e torcendo para remover o excesso de líquido da parede do tubo.
- Prepare as placas no exaustor usando ágar Mueller-Hinton (consulte a Tabela de Materiais).
- Passe o algodão para frente e para trás no ágar, gire 60° duas vezes e, em seguida, limpe o perímetro para uma cobertura uniforme.
- Esterilize as pinças sobre uma chama por 1-2 s, deixando-as esfriar brevemente, depois use-as para pegar os discos vazios.
- Divida a placa em três setores iguais usando um marcador. Coloque um disco vazio no centro de cada setor.
- Adicione 12,5 μL de estoque de fluconazol (2 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) a cada disco (25 μg / disco), misture bem para evitar bolhas e incube a 37 ° C por 20-24 h.
- Execute a coloração TTC (consulte a etapa 3). Digitalize as chapas a 1200 dpi usando um scanner óptico colorido de 48 bits.
- Indução de colônias pequenas PDT
NOTA: Diferentes fungos podem produzir diferentes números de colônias pequenas após a PDT. Algumas cepas podem não produzir nenhum.- Prepare o sistema aPDT.
NOTA: O procedimento de configuração para o dispositivo do sistema aPDT segue o método relatado por Hung et al12. Resumidamente, o sistema aPDT consiste em uma matriz de LED verde com um pico de 520 nm (consulte a Tabela de Materiais), brilhando luz do fundo com bom alinhamento com cada poço de uma placa de 96 poços. - Ajuste a suspensão de células de levedura no meio YPD para um OD600 de 0,65 (cerca de 1 × 107 células / mL).
- Misture 1 mL da suspensão de levedura com 111 μL de rosa bengala a 2% (RB, Figura 1) (ver Tabela de Materiais) em um tubo com tampa redonda para obter uma concentração final de RB de 0,2%. Incubar a mistura a 25 °C durante 15 min, rodando-a num ângulo de 45° a 155 rpm.
- Transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 16.100 x g por 2,5 min (à temperatura ambiente).
- Descarte o sobrenadante e raspe suavemente o tubo cinco vezes no chão do capô para ressuspender o pellet.
- Lave a suspensão com 1x PBS quatro vezes para remover todo o RB. Cada lavagem é seguida pela ressuspensão do pellet com breve vórtice ou pipetagem para ressuspensão completa.
- Após a lavagem final, adicione 1000 μL de PBS. A solução é de cor rosa claro. Transfira 200 μL da suspensão de levedura carregada com RB lavada para cada um dos três poços em uma placa de 96 poços (triplicata).
- Posicione a placa de 96 poços no sistema de luz fotodinâmica com lâmpadas LED brilhando luz verde por baixo. Apague as luzes da sala para garantir uma iluminação uniforme e evitar interferências. Ative o sistema de luz LED para fornecer a dose PDT de 4,38 J/cm2 em 2 min; Certifique-se de que o sistema esteja devidamente alinhado com os poços.
- Após a irradiação, diluir a suspensão de levedura em uma placa de 96 poços. Adicione 20 μL de suspensão de levedura a um poço contendo 180 μL de PBS, criando uma diluição de 10 vezes. Repita para as diluições restantes para atingir um intervalo de 10-1 a 10-5.
- Escolha quatro fatores de diluição (por exemplo, 10-2 a 10-5) com base no ajuste da concentração de células de levedura.
- Para cada factor de diluição, aplicar 3 gotas (20 μl cada) por quadrante em placas de ágar YPD.
- Após a suspensão da levedura ser completamente absorvida, cerca de 10 min pelas placas de ágar, inverter e incubar durante a noite a 37 °C.
- Defina T0 como o parente controle de C. glabrata sem tratamento com PDT. Prepare fungos T0 na fase de crescimento logarítmica conforme descrito acima e exponha-os a 4,38 J / cm2 luz verde na presença de 0,2% RB. Esta condição de PDT inibe consistentemente 3 a 3,5 logs de crescimento de fungos.
- Denote os fungos sobreviventes como T1 e exponha-os à mesma dose de PDT novamente depois de serem expandidos in vitro para uma fase de crescimento logarítmico. Os fungos sobreviventes após a segunda PDT são denotados como T2 e assim por diante.
- No dia seguinte, escolha quadrantes com contagem de colônias entre 5 e 80. Contar o número de colónias em cada quadrante e calcular o título com a seguinte fórmula: Unidade formadora de colónias (UFC)/ml = Número de colónias (média do triplicado) × Factor de diluição × 50.
- Execute a coloração TTC (consulte a etapa 3). Digitalize a placa conforme descrito anteriormente (etapa 2.2).
- Prepare o sistema aPDT.
3. Análise da função mitocondrial (teste de coloração TCC)
NOTA: TTC é um indicador redox e um aceptor de elétrons. Fica vermelho quando os compostos brancos são quebrados por elétrons11. Observe que nem todas as células necessariamente formam colônias visíveis dentro de 24 horas após a cultura em uma placa de ágar. As colônias com mitocôndrias funcionais ficam vermelhas, enquanto aquelas com mitocôndrias não funcionais permanecem brancas. Isso permite a diferenciação entre colônias com diferentes funcionalidades mitocondriais.
- Após o tratamento, diluir as suspensões de Candida em placas de ágar YPD de acordo com a densidade celular desejada para obter colônias distintas para fácil visualização e coloração.
- Após 24 h de crescimento a 37 °C, as colônias visíveis são formadas a partir de uma única célula. Pipete 20 μL de TTC a 20% diretamente no centro de cada colônia.
- Após a absorção completa, cerca de 10 min de TTC pelas colônias, incubar a 37 °C por 30-40 min.
4. Cinética de crescimento de C. glabrata normal e pequena
NOTA: Três cepas de levedura foram comparadas: C. glabrata C2-1000907 T0 (isolado clínico sem tratamento com PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 após 3 colônias RB-PDT consecutivas exibindo um diâmetro médio de 1,5 ± 0,8 mm semelhante às células parentais) e T3p (colônias pequenas de C. glabrata C2-1000907 após 3 RB-PDT consecutivas).
- Ajuste a suspensão de células de levedura em meio YPD para um OD600 de 0,1 (5 × 106 células / mL) em um tubo de 3 mL.
- Meça automaticamente o OD600 da cultura estática a cada 20 minutos usando o leitor de microplacas multimodo (consulte a Tabela de Materiais) por 24 h.
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Representative Results
Os dados são apresentados como a média com ± erro padrão e foram obtidos a partir de três experimentos independentes, com pelo menos triplicatas em cada grupo. Os dados experimentais, incluindo contagens de colônias, medições de OD600 e resultados de coloração TTC, foram representados graficamente e analisados estatisticamente usando gráficos e software estatístico (ver Tabela de Materiais). A análise dos dados foi realizada por ANOVA ou teste t de uma via, sendo considerado significativo um valor de p <0,05. A varredura foi realizada com um scanner óptico colorido de 48 bits com resolução de 1200 dpi, e as medições subsequentes dos diâmetros das colônias foram realizadas usando o software ImageJ.
Conforme ilustrado nas curvas de crescimento na Figura 2, pequenos mutantes de C. glabrata C2-1000907 (T3p) exibiram crescimento mais lento em comparação com os fungos parentais não tratados de tamanho regular (T0). Quando C. glabrata foi misturado com 0,2% de RB por 15 min e exposto a 4,38 J/cm2 de luz verde (tratamento PDT), o título dos fungos diminuiu de 107,5 UFC/mL para 104,5 UFC/mL (pelo menos 3 logs, Figura 3) em comparação com o grupo controle (somente RB), que tinha uma densidade celular de cerca de 107 UFC/mL. Além disso, após aPDTs, colônias pequenas foram observadas. Essas pequenas colônias tinham um tamanho médio de 0,4 mm ± 0,25 mm, em vez do tamanho usual de 1,5 mm ± 0,8 mm (Figura 4A). Colônias de tamanho pequeno com disfunção mitocondrial podem ser identificadas por seu tamanho e cor após coloração com 20% de TTC. As pequenas colônias que mantiveram uma cor branca (Figura 3B, setas brancas) exibiram disfunção mitocondrial, enquanto algumas colônias menores de cor vermelha e colônias de tamanho normal mantiveram a função mitocondrial normal (Figura 4B). O agente intercalante de DNA tradicional brometo de etídio ( Figura 4C ) e fluconazol ( Figura 4 D ) pode efetivamente induzir pequenos mutantes de Candida. A difusão em disco é um método simples para definir a suscetibilidade a drogas em fungos. Na Figura 4D, uma zona circular clara de nenhum crescimento circundou o disco de fluconazol contendo 25 μg de fluconazol na cultura T0 (sem PDT), indicando menor resistência aos medicamentos neste fungo parental. No entanto, a C. glabrata C2-1000907 ainda é definida como uma cepa resistente pela concentração mínima de inibição em relação ao fluconazol (dados não mostrados) e pelo diâmetro da zona clara. Na cultura T3, muitas colônias pequenas se formaram perto do disco (seta, painel inferior), sugerindo resistência aos medicamentos após três tratamentos repetidos de PDT.
Figura 1: Estrutura molecular da rosa Bengala (RB). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curvas de crescimento de C. glabrata C2-1000907 24 h após RB-PDT repetitivo. As curvas de crescimento foram comparadas para três cepas: C. glabrata C2-1000907 T0 (células parentais virgens), T3n (colônias com tamanho normal após 3 tratamentos repetidos) e T3p (colônias pequenas após 3 tratamentos repetidos). Em comparação com T0 e T3n, as colônias T3p exibiram uma taxa de crescimento significativamente mais lenta (n = 3, p < 0,05). Todas as células são cultivadas em meio YPD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Inibição do crescimento de C. glabrata C2-1000907 após aPDT. Um único tratamento com aPDT com uma dose de luz de 4,38 J/cm² e 0,2% de RB inibiu significativamente o crescimento de C. glabrata C2-1000907 em 3 logs em comparação com o controle virgens (p < 0,0001, teste t não pareado). As barras de erro representam a média ± SEM, os dados são agrupados de 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da disfunção mitocondrial usando coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TCC). (A) C. glabrata C2-1000907, 24 h após o tratamento com aPDT (0,2% RB, 4,38 J / cm² luz verde), exibiu uma distribuição bimodal do tamanho da colônia, com colônias grandes (1,5 mm ± 0,8 mm) e pequenas (pequenas) (0,4 mm ± 0,25 mm). (B) A coloração TCC revelou que as colônias grandes eram funcionais, pois ficaram vermelhas, enquanto as colônias pequenas não eram funcionais, pois permaneceram brancas. (C) Colônias pequenas também foram induzidas pelo tratamento com brometo de etídio (100 μg/mL por 30-40 min) e (D) fluconazol (25 μg/mL). Uma zona circular clara de nenhum crescimento circundou o disco de fluconazol contendo 25 μg de fluconazol na cultura T0 (sem PDT), indicando suscetibilidade. Na cultura T3, muitas colônias pequenas se formaram perto do disco (seta, painel inferior), sugerindo resistência aos medicamentos após três tratamentos repetidos de PDT. Barras de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo revela a PDT como o primeiro método relatado para induzir a formação de pequenas colônias em Candida, superando os efeitos estabelecidos do brometo de etídio e do fluconazol. Esta nova observação requer uma exploração mais aprofundada para desvendar suas implicações tanto para a erradicação de fungos, diminuindo a virulência quanto para o surgimento de mecanismos de resistência.
A PDT mediada por RB inibe efetivamente o crescimento de C. glabrata, sugerindo uma potencial abordagem de tratamento alternativo para infecções por Candida. Como um fotossensibilizador ativado por luz, o RB produz oxigênio singlete e espécies reativas de oxigênio (ROS) quando exposto a um comprimento de onda específico. Esse estresse oxidativo causa danos a componentes celulares essenciais, como lipídios, proteínas e ácidos nucléicos13, levando à disfunção mitocondrial, como mostrado no presente estudo. Isso dificulta o desenvolvimento de resistência por meio de mecanismos convencionais observados com medicamentos antifúngicos padrão.
As três cepas de levedura usadas neste estudo, T0, T3n e T3p, exibem padrões de crescimento distintos. T0 permanece sem tratamento, enquanto T3n e T3p sofrem RB-PDT três vezes. T3n exibe colônias de tamanho normal, enquanto T3p exibe colônias pequenas. O crescimento mais lento das colônias pequenas pode indicar alterações na energia celular e no metabolismo. O fenótipo pequeno, frequentemente associado à disfunção mitocondrial4, pode levar ao comprometimento da respiração aeróbica, consequentemente influenciando a cinética geral do crescimento. A respiração aeróbica prejudicada em colônias pequenas pode afetar sua virulência, suscetibilidade a drogas ou capacidade de persistir em diferentes ambientes. Essa conexão tem implicações clínicas potenciais e fornece caminhos para futuras direções de pesquisa.
O brometo de etídio, um agente intercalante de DNA, inibe a síntese de DNA mitocondrial e degrada o DNA mitocondrial existente, transformando Candida em pequenas colônias com disfunção mitocondrial14. O fluconazol, comumente usado para tratar infecções por Candida, pode induzir resistência a drogas e desenvolvimento de colônias pequenas em C. glabrata6. Pequenos mutantes podem apresentar resistência a drogas azólicas por meio da ativação do fator de transcrição PDR1 e sua regulação dos genes CDR1 e CDR215. Além disso, devido à perda parcial ou completa do DNA mitocondrial, a função mitocondrial fica comprometida16.
A TFD demonstrou eficácia na redução da virulência bacteriana17, induzindo suscetibilidade a antibióticos18 e reduzindo a formação de biofilme19 em bactérias. Os estudos sobre TFD contra infecções fúngicas são limitados20. Esta descoberta levanta questões intrigantes sobre como RB-PDT afeta as mitocôndrias em C. glabrata. Para compreender completamente como o RB-PDT afeta as células de levedura, é crucial entender os mecanismos moleculares que causam variações de crescimento. No entanto, pequenos mutantes induzidos por PDT são atualmente pouco estudados e seus fundamentos mecanicistas detalhados permanecem obscuros. Mais investigações são necessárias para determinar se existem diferenças entre pequenas colônias criadas por vários métodos. Compreender como os petites se formam em espécies de Candida é importante para estudar a relação entre a função mitocondrial e a patogenicidade. Além disso, pequenos mutantes podem servir de modelo para explorar os mecanismos de resistência a medicamentos antifúngicos.
O estudo atual, embora forneça informações valiosas sobre os efeitos da TFD mediada por RB em C. glabrata e o surgimento de colônias pequenas, tem certas limitações que devem ser consideradas. Em primeiro lugar, o estudo se concentrou principalmente em experimentos in vitro, e a tradução desses achados para ambientes clínicos justifica uma investigação mais aprofundada. Além disso, os mecanismos moleculares específicos subjacentes à formação de pequenas colônias após RB-PDT e suas implicações potenciais para a resistência a medicamentos antifúngicos requerem uma exploração mais aprofundada. Além disso, enquanto o estudo comparou os padrões de crescimento de diferentes cepas de levedura, análises moleculares e genéticas adicionais podem fornecer uma compreensão mais profunda das mudanças metabólicas e genéticas associadas à formação de colônias pequenas.
Além disso, a potencial variabilidade na resposta à RB-PDT entre diferentes isolados clínicos de C. glabrata não foi abordada neste estudo, destacando a necessidade de investigações específicas de cepas mais amplas. Estudos futuros abordando essas limitações serão cruciais para uma compreensão mais abrangente das implicações da PDT mediada por RB e do surgimento de pequenas colônias no contexto de estratégias de tratamento antifúngico.
Em resumo, esta investigação revela que a aPDT induz pequenos mutantes de C. glabrata (C2-1000907) com função mitocondrial prejudicada. Esse mecanismo único pode oferecer um novo método para estudos antifúngicos. O mecanismo de ação preciso subjacente às pequenas colônias induzidas por PDT ainda precisa ser elucidado, e explorar possíveis diferenças de outros métodos será crucial para otimizar as estratégias terapêuticas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho recebeu financiamento do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], Universidade Nacional de Cheng Kung [K111-B094], [K111-B095], Hospital Universitário Nacional de Cheng Kung, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
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