Summary
Betydningen av små kolonier i Candida spp. stoffresistens har ikke blitt fullstendig utforsket. Antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) tilbyr en lovende strategi mot stoffresistente soppinfeksjoner. Denne studien viser at rose bengal-mediert aPDT effektivt deaktiverer Candida glabrata og induserer petite kolonier, og presenterer en unik prosedyre.
Abstract
Overfor en dødelighet på 40% hos candidemi-pasienter, er stoffresistent Candida og deres petite mutanter fortsatt en stor behandlingsutfordring. Antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) retter seg mot flere soppstrukturer, i motsetning til antibiotika / antifungale midler, som potensielt hindrer resistens. Tradisjonelle metoder for å indusere petite kolonier stole på ethidiumbromid eller flukonazol, noe som kan påvirke stofffølsomhet og stressresponser. Denne studien undersøkte anvendelsen av grønt lys (topp 520 nm) og rose bengal (RB) fotosensibilisator for å bekjempe et stoffresistent Candida glabrata-isolat . Funnene viste at aPDT-behandling signifikant hemmet cellevekst (≥99,9% reduksjon) og effektivt induserte petite kolonidannelse, som det fremgår av redusert størrelse og tap av mitokondriell redoksindikatorfarging. Denne studien gir innledende bevis på at aPDT kan indusere petite kolonier i en multidrugresistent C. glabrata-stamme in vitro, og tilbyr en potensielt transformativ tilnærming for å bekjempe resistente soppinfeksjoner.
Introduction
Soppinfeksjoner, spesielt de som er forårsaket av Candida albicans og stadig mer stoffresistente Candida glabrata, utgjør en alvorlig global trussel1. Disse infeksjonene kan være dødelige, spesielt for pasienter på sykehus og de med svekket immunforsvar. Økende soppdrepende resistens truer kontrollen av invasiv candidiasis, en alvorlig soppinfeksjon med høy dødelighet, spesielt fra Candida albicans2. Resistente stammer hindrer effektiv behandling, noe som potensielt øker både kompleksiteten og dødsraten. I Alameda County, California, USA, har C. glabrata blitt den mest utbredte invasive arten3. Dette skiftet i utbredelsen og distribusjonen av Candida-arter kan påvirkes av lokal helsepraksis, pasientdemografi, bruk av antifungale midler og forekomsten av risikofaktorer for Candida-infeksjoner.
Petite mutanter i Candida, som mangler funksjonelle mitokondrier, avslører hvordan denne organellen påvirker legemiddelrespons, virulens og stressmotstand 4,5. C. glabrata danner lett disse koloniene, og får følsomhet for polyener mens de mister den til azoler6. Azolfølsomhet og respirasjonsfunksjon er intrikat forbundet, med redusert respirasjon som fører til resistens via mitokondrielt DNA-tap7. Petitekolonier av C. glabrata med azolresistens er isolert fra avføringsprøver fra benmargstransplanterte som gjennomgår flukonazolbehandling8 og fra blodkulturflasker hos pasienter med blodbaneinfeksjoner9. Deres potensielle implikasjoner i stoffresistens, virulens og stressrespons fremhever deres kliniske betydning. I tillegg gjør deres distinkte egenskaper dem til verdifulle verktøy for å undersøke grunnleggende spørsmål i mitokondriebiologi5. Etter hvert som forskningen på små mutanter fortsetter, vil deres anvendelser i både klinisk og grunnleggende forskning sannsynligvis utvides.
Denne studien oppdaget at fotodynamisk terapi (PDT) kan indusere petite kolonier i C. glabrata, og utvide rekkevidden av metoder utover de tradisjonelle teknikkene for å eksponere C. glabrata for ethidiumbromid eller flukonazol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrking av C. glabrata
MERK: En multidrugresistent C. glabrata (C2-1000907) som er resistent mot de fleste antifungale midler, inkludert flukonazol, brukes til forsøkene. De eksperimentelle forholdene må kanskje tilpasses den spesifikke stammen, da variasjoner kan eksistere mellom forskjellige stammer. Alle forsøkene brukte log-fase Candida dyrket ved 25 ° C (etterligner naturlig infeksjon) for konsistens. C. glabratas mangel på hyfer forenkler kvantifiseringen sammenlignet med C. albicans, som danner hyfer ved 37 °C10.
- For å forberede en logfasekultur av C. glabrata, velg en enkelt koloni fra en agarplate og overfør den til et glassreagensrør med 3 ml steril gjærpeptondekstrose (YPD) medium (se materialfortegnelse). Inkuber i 14-16 timer ved 25 °C med risting (155 o / min, 45 ° vinkel for å øke luftoverføringen til mediet).
- Etter inkubering, fortynn kulturen med fersk YPD til en OD600 på 0,1 ved hjelp av steril teknikk. Inkuber ved 25 °C i 6 timer med risting ved 155 o / min. Bekreft loggfasen til C. glabrata ved å måle OD600. Sikt på 0,65-1,00, som tilsvarer 1 × 10 7-1,5 × 107 celler / ml.
2. Induksjon av petite kolonier ved ethidiumbromid, flukonazol og fotodynamisk terapi
- Ethidiumbromid petite koloni induksjon
- Juster en gjærsuspensjon til en OD600 på 0,1 (5 × 106 celler/ml) med YPD til et endelig volum på 3 ml, tilsett deretter 30 μL ethidiumbromidlager (10 mg/ml) (se materialfortegnelse) for en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml.
- Inkuber gjærsuspensjonen over natten (16-18 timer) ved 25 ° C, 155 o / min, 45 ° vinkel. Juster til en OD600 på 0,65 (1 × 107 celler/ml). Utfør en 10 ganger fortynningsserie i en 96-brønnplate ved å tilsette 20 μL av den justerte gjærsuspensjonen til 180 μL PBS per brønn. Dette skaper seks fortynninger fra 10-1 til 10-5.
- Velg 4 fortynningsfaktorer (f.eks. 100, 101, 102 og 103) og plate 3 dråper (20 μL) hver på 4 kvadranter av YPD-agarplater (triplikat).
- Inkuber platene over natten ved 37 °C. Velg kvadranter med 5-80 kolonier fra de tidligere valgte fortynningene for trifenyltetrazoliumklorid (TTC)-farging11 (se trinn 3). Skann plater med 1200 dpi ved hjelp av en 48-biters fullfarget optisk skanner.
- Flukonazol petite koloni induksjon
MERK: For å fremskynde prosessen, bruk T3-celler (en blanding av normale og petite celler oppnådd etter 3 RB-PDT-behandlinger; se trinn 2.3) for flukonazol-indusert petite kolonidannelse. Dette skyldes at standardbehandling vanligvis resulterer i langsommere dannelse.- Forbered og juster en gjærcellesuspensjon som beskrevet i trinn 2.1.1.
- Inkuber over natten (16-18 timer) ved 25 °C. Juster OD600 til 0,1 igjen.
- Overfør 1 ml av den justerte suspensjonen til et sterilt 5 ml rør.
- Dypp en steril bomullspinne (15 cm lang, med en 0,9 cm x 2,6 cm spiss, se materialfortegnelse) i gjærsuspensjonen, og sørg for kontakt med rørbunnen og vri for å fjerne overflødig væske fra rørveggen.
- Forbered platene i hetten ved hjelp av Mueller-Hinton-agar (se materialfortegnelse).
- Vatt bomullen frem og tilbake på agar, roter 60° to ganger, og stryk deretter omkretsen for jevn dekning.
- Steriliser tang over en flamme i 1-2 s, slik at de kan avkjøles kort, og bruk dem til å plukke opp de tomme diskene.
- Del platen i tre like sektorer ved hjelp av en markør. Plasser en tom disk i midten av hver sektor.
- Tilsett 12,5 μL flukonazollager (2 mg/ml, se materialfortegnelse) i hver disk (25 μg/disk), bland grundig for å unngå bobler og inkuber ved 37 °C i 20-24 timer.
- Utfør TTC-fargingen (se trinn 3). Skann plater med 1200 dpi ved hjelp av en 48-biters fullfarget optisk skanner.
- PDT petite koloni induksjon
MERK: Ulike sopp kan produsere forskjellig antall petite kolonier etter PDT. Noen stammer kan ikke produsere noen i det hele tatt.- Forbered aPDT-systemet.
MERK: Oppsettprosedyren for aPDT-systemenheten følger metoden rapportert av Hung et al12. Kort fortalt består aPDT-systemet av et grønt LED-array med en topp på 520 nm (se materialfortegnelse), skinnende lys fra bunnen med god justering med hver brønn på en 96-brønnsplate. - Juster gjærcellesuspensjonen i YPD-mediet til en OD600 på 0,65 (ca. 1 × 107 celler/ml).
- Bland 1 ml av gjærsuspensjonen med 111 μL 2 % bengalrose (RB, figur 1) (se materialfortegnelse) i et avrundet rør for å gi en endelig RB-konsentrasjon på 0,2 %. Inkuber blandingen ved 25 °C i 15 minutter, roter den i en 45° vinkel ved 155 o / min.
- Overfør blandingen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 16 100 x g i 2,5 minutter (ved romtemperatur).
- Kast supernatanten og skrap forsiktig røret fem ganger på hettegulvet for å resuspendere pelleten.
- Vask suspensjonen med 1x PBS fire ganger for å fjerne all RB. Hver vask etterfølges av resuspendering av pelleten med kort virvel eller pipettering for grundig resuspensjon.
- Etter den endelige vasken, tilsett 1000 μL PBS. Løsningen er lys rosa i fargen. Overfør 200 μL av den vaskede RB-belastede gjærsuspensjonen til hver av tre brønner i en 96-brønnplate (triplikat).
- Plasser 96-brønnsplaten på det fotodynamiske lyssystemet med LED-pærer som skinner grønt lys nedenfra. Slå av romlysene for å sikre jevn belysning og forhindre forstyrrelser. Aktiver LED-lyssystemet for å levere PDT-dosen på 4,38 J / cm2 over 2 minutter; Forsikre deg om at systemet er riktig justert med brønnene.
- Etter bestråling, fortynn gjærsuspensjonen i en 96-brønnsplate. Tilsett 20 μL gjærsuspensjon til en brønn som inneholder 180 μL PBS, og skaper en 10 ganger fortynning. Gjenta for de resterende fortynningene for å oppnå et område på 10-1 til 10-5.
- Velg fire fortynningsfaktorer (f.eks. 10-2 til 10-5) basert på justeringen av gjærcellekonsentrasjonen.
- For hver fortynningsfaktor skal platen 3 dråper (20 μL hver) per kvadrant på YPD-agarplater.
- Etter at gjærsuspensjonen er fullstendig absorbert, rundt 10 min av agarplatene, inverteres og ruges over natten ved 37 °C.
- Definer T0 som kontrollforelder C. glabrata uten PDT-behandling. Forbered T0-sopp i loggvekstfasen som beskrevet ovenfor og utsett dem for 4,38 J / cm2 grønt lys i nærvær av 0,2% RB. Denne PDT-tilstanden hemmer konsekvent 3 til 3,5 logger av soppvekst.
- Angi de overlevde soppene som T1 og utsett dem for samme PDT-dose igjen etter at de er utvidet in vitro til en loggvekstfase. De overlevde soppene etter den andre PDT betegnes som T2 og så videre.
- Neste dag velger du kvadranter med kolonitellinger mellom 5 og 80. Tell antall kolonier i hver kvadrant og beregne titer med følgende formel: Kolonidannende enhet (CFU) / ml = Antall kolonier (gjennomsnitt av triplikat) × Fortynningsfaktor × 50.
- Utfør TTC-fargingen (se trinn 3). Skann platen som beskrevet tidligere (trinn 2.2).
- Forbered aPDT-systemet.
3. Mitokondriell funksjonsanalyse (TCC-fargetest)
MERK: TTC er en redoksindikator og en elektronakseptor. Det blir rødt når hvite forbindelser brytes av elektroner11. Merk at ikke alle celler nødvendigvis danner synlige kolonier innen 24 timer etter kultur på en agarplate. Kolonier med funksjonelle mitokondrier blir røde, mens de med ikke-funksjonelle mitokondrier forblir hvite. Dette tillater differensiering mellom kolonier med forskjellig mitokondriell funksjonalitet.
- Etter behandling, fortynn Candida-suspensjoner på YPD-agarplater i henhold til ønsket celletetthet for å oppnå forskjellige kolonier for enkel visualisering og farging.
- Etter 24 timers vekst ved 37 °C dannes synlige kolonier fra en enkelt celle. Pipette 20 μL med 20 % TTC direkte på midten av hver koloni.
- Etter fullstendig absorpsjon, rundt 10 min TTC av koloniene, ruge ved 37 ° C i 30-40 minutter.
4. Vekstkinetikk av normal og petite C. glabrata
MERK: Tre gjærstammer ble sammenlignet: C. glabrata C2-1000907 T0 (klinisk isolat uten PDT-behandling), T3n (C. glabrata C2-1000907 etter 3 påfølgende RB-PDT som viste kolonier med en gjennomsnittlig diameter på 1,5 ± 0,8 mm lik foreldrecellene) og T3p (petite kolonier av C. glabrata C2-1000907 etter 3 påfølgende RB-PDT).
- Juster gjærcellesuspensjonen i YPD-medium til en OD600 på 0,1 (5 × 106 celler / ml) i et 3 ml rør.
- Mål automatisk OD600 av statisk kultur hvert 20. minutt ved hjelp av multi-modus mikroplateleser (se materialfortegnelse) i 24 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene presenteres som gjennomsnittet med ± standardfeil og ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter, med minst triplikater i hver gruppe. Eksperimentelle data, inkludert kolonitelling, OD600-målinger og TTC-fargeresultater, ble grafet og statistisk analysert ved hjelp av grafisk og statistisk programvare (se materialfortegnelse). Enveis ANOVA eller t-test ble brukt for å analysere dataene, og en p-verdi <0,05 ble vurdert som signifikant. Skanning ble utført med en 48-bits fullfarge optisk skanner med en oppløsning på 1200 dpi, og påfølgende målinger av koloniens diametre ble utført ved hjelp av ImageJ-programvare.
Som vist i vekstkurvene i figur 2, viste petite mutanter av C. glabrata C2-1000907 (T3p) langsommere vekst sammenlignet med de ubehandlede foreldresoppene av vanlig størrelse (T0). Når C. glabrata ble blandet med 0,2 % RB i 15 minutter og utsatt for 4,38 J/cm2 grønt lys (PDT-behandling), sank soppens titer fra 107,5 CFU/ml til 104,5 CFU/ml (minst 3 logger, figur 3) sammenlignet med kontrollgruppen (kun RB), som hadde en celletetthet på rundt 107 CFU/ml. I tillegg, etter aPDTer, ble petite kolonier observert. Disse petite koloniene hadde en gjennomsnittlig størrelse på 0,4 mm ± 0,25 mm i stedet for den vanlige størrelsen på 1,5 mm ± 0,8 mm (figur 4A). Små kolonier med mitokondriell dysfunksjon kan identifiseres av deres størrelse og farge etter farging med 20% TTC. De små koloniene som hadde hvit farge (figur 3B, hvite piler) hadde mitokondriell dysfunksjon, mens noen mindre rødfargede kolonier og kolonier av normal størrelse beholdt normal mitokondriefunksjon (figur 4B). Det tradisjonelle DNA-interkaleringsmiddelet ethidiumbromid (figur 4C) og flukonazol (figur 4D) kan effektivt indusere petite mutanter av Candida. Diskdiffusjon er en enkel metode for å definere legemiddelfølsomhet hos sopp. I figur 4D omringet en klar sirkulær sone uten vekst flukonazolskiven med 25 μg flukonazol i T0-kulturen (uten PDT), noe som indikerer mindre legemiddelresistens hos denne foreldresoppen. Likevel er C. glabrata C2-1000907 fortsatt definert som en resistent stamme ved minimal hemmingskonsentrasjon mot flukonazol (data ikke vist) og diameteren av klar sone. I T3-kulturen ble mange petite kolonier dannet nær disken (pil, nedre panel), noe som tyder på stoffresistens etter tre gjentatte PDT-behandlinger.
Figur 1: Molekylær struktur av rose Bengal (RB). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vekstkurver for C. glabrata C2-1000907 24 timer etter repeterende RB-PDT. Vekstkurver ble sammenlignet for tre stammer: C. glabrata C2-1000907 T0 (naive foreldreceller), T3n (kolonier med normal størrelse etter 3 gjentatte behandlinger) og T3p (petite kolonier etter 3 gjentatte behandlinger). Sammenlignet med T0 og T3n viste T3p-kolonier en signifikant langsommere vekstrate (n = 3, p < 0,05). Alle celler dyrkes i YPD-medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Veksthemming av C. glabrata C2-1000907 etter aPDT. En enkelt aPDT-behandling med en lett dose på 4,38 J/cm² og 0,2 % RB hemmet signifikant veksten av C. glabrata C2-1000907 med 3 logger sammenlignet med den naive kontrollen (p < 0,0001, uparet t-test). Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± SEM, data er samlet fra 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Mitokondriell dysfunksjonsanalyse med trifenyltetrazoliumklorid (TCC)-farging. (A) C. glabrata C2-1000907, 24 timer etter aPDT-behandling (0,2 % RB, 4,38 J/cm² grønt lys), viste en bimodal kolonistørrelsesfordeling, med store (1,5 mm ± 0,8 mm) og små (petite) kolonier (0,4 mm ± 0,25 mm). (B) TCC-farging avslørte at de store koloniene var funksjonelle, da de ble røde, mens de små koloniene var ikke-funksjonelle, da de forble hvite. (C) Petite kolonier ble også indusert av ethidiumbromid (100 μg / ml i 30-40 minutter) og (D) flukonazol (25 μg / ml) behandling. En klar sirkulær sone uten vekst omga flukonazolskiven inneholdende 25 μg flukonazol i T0-dyrkning (uten PDT), noe som indikerer følsomhet. I T3-kulturen ble mange petite kolonier dannet nær disken (pil, nedre panel), noe som tyder på stoffresistens etter tre gjentatte PDT-behandlinger. Vektstenger: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien avslører PDT som den første rapporterte metoden for å indusere petite kolonidannelse i Candida, som overgår de etablerte effektene av ethidiumbromid og flukonazol. Denne nye observasjonen nødvendiggjør videre utforskning for å avdekke implikasjonene for både sopputryddelse ved å redusere virulens og fremveksten av resistensmekanismer.
RB-mediert PDT hemmer effektivt veksten av C. glabrata, noe som tyder på en potensiell alternativ behandlingstilnærming for Candida-infeksjoner. Som en lysaktivert fotosensibilisator produserer RB singlet oksygen og reaktive oksygenarter (ROS) når de utsettes for en bestemt bølgelengde. Dette oksidative stresset forårsaker skade på essensielle cellulære komponenter som lipider, proteiner og nukleinsyrer13, noe som fører til mitokondriell dysfunksjon, som vist i denne studien. Dette gjør det vanskelig for Candida å utvikle resistens gjennom konvensjonelle mekanismer observert med standard antifungale legemidler.
De tre gjærstammene som ble brukt i denne studien, T0, T3n og T3p, viser forskjellige vekstmønstre. T0 forblir ubehandlet, mens T3n og T3p gjennomgår RB-PDT tre ganger. T3n viser kolonier av normal størrelse, mens T3p viser petite kolonier. Den langsommere veksten av de små koloniene kan indikere endringer i cellulær energi og metabolisme. Den petite fenotypen, ofte assosiert med mitokondriell dysfunksjon4, kan føre til nedsatt aerob respirasjon, og dermed påvirke den generelle vekstkinetikken. Den svekkede aerobe respirasjonen i små kolonier kan påvirke deres virulens, legemiddelfølsomhet eller evne til å vedvare i forskjellige miljøer. Denne forbindelsen har potensielle kliniske implikasjoner og gir muligheter for fremtidige forskningsretninger.
Ethidiumbromid, et DNA-interkaleringsmiddel, hemmer mitokondriell DNA-syntese og nedbryter eksisterende mitokondrielt DNA, og transformerer Candida til petite kolonier med mitokondriell dysfunksjon14. Flukonazol, som vanligvis brukes til å behandle Candida-infeksjoner, kan indusere stoffresistens og petite koloniutvikling i C. glabrata6. Petite mutanter kan vise azolresistens gjennom aktivering av transkripsjonsfaktoren PDR1 og dens regulering av gener CDR1 og CDR215. Videre, på grunn av delvis eller fullstendig tap av mitokondrielt DNA, er mitokondriell funksjon kompromittert16.
PDT har vist effekt i å redusere bakteriell virulens17, indusere følsomhet for antibiotika18, og redusere biofilmdannelse19 i bakterier. Studier på PDT mot soppinfeksjoner er begrenset20. Denne oppdagelsen reiser spennende spørsmål om hvordan RB-PDT påvirker mitokondrier i C. glabrata. For å forstå hvordan RB-PDT påvirker gjærceller, er det viktig å forstå de molekylære mekanismene som forårsaker vekstvariasjoner. Imidlertid er petite mutanter indusert av PDT for tiden understudert, og deres detaljerte mekanistiske grunnlag forblir uklare. Videre undersøkelser er nødvendig for å avgjøre om det er noen forskjeller mellom små kolonier skapt av ulike metoder. Å forstå hvordan petites dannes i Candida-arter er viktig for å studere forholdet mellom mitokondriell funksjon og patogenisitet. Videre kan petite mutanter tjene som en modell for å utforske antifungale stoffresistensmekanismer.
Den nåværende studien, samtidig som den gir verdifull innsikt i effekten av RB-mediert PDT på C. glabrata og fremveksten av petite kolonier, har visse begrensninger som bør vurderes. For det første fokuserte studien primært på in vitro-eksperimenter, og oversettelsen av disse funnene til kliniske innstillinger garanterer videre undersøkelser. I tillegg krever de spesifikke molekylære mekanismene som ligger til grunn for dannelsen av petite kolonier etter RB-PDT og deres potensielle implikasjoner for antifungal stoffresistens, mer grundig utforskning. Videre, mens studien sammenlignet vekstmønstrene til forskjellige gjærstammer, kunne ytterligere molekylære og genetiske analyser gi en dypere forståelse av metabolske og genetiske endringer forbundet med petite kolonidannelse.
Videre ble den potensielle variabiliteten i respons på RB-PDT blant forskjellige kliniske isolater av C. glabrata ikke adressert i denne studien, noe som understreker behovet for bredere belastningsspesifikke undersøkelser. Fremtidige studier som adresserer disse begrensningene vil være avgjørende for en mer omfattende forståelse av implikasjonene av RB-mediert PDT og fremveksten av petite kolonier i sammenheng med antifungal behandlingsstrategier.
Oppsummert viser denne undersøkelsen at aPDT induserer C. glabrata (C2-1000907) petite mutanter med nedsatt mitokondriefunksjon. Denne unike mekanismen kan tilby en ny metode for antifungal studier. Den nøyaktige virkningsmekanismen som ligger til grunn for PDT-induserte petite kolonier gjenstår å bli belyst, og å utforske potensielle forskjeller fra andre metoder vil være avgjørende for å optimalisere terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet har mottatt finansiering fra departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J.
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).
- Whittaker, P. A.
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).
- Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038 (2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558 (2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J.
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
