Voorbereiding van de gepoolde humane bloedplaatjes Lysate (pHPL) als een efficiënte Supplement voor Animal Serum-Free menselijke stamcellen culturen
Summary
Menselijke bloedplaatjes lysaat is een rijke bron van groeifactoren en een krachtig supplement in celcultuur. Dit protocol bevat het proces van het opstellen van een grote pool van de menselijke bloedplaatjes lysaat door uit te gaan van de bloedplaatjes rijk plasma, het uitvoeren van een aantal vries-dooi cycli en uitputting van de bloedplaatjes fragmenten.
Abstract
Bloedplaatjes afgeleide groeifactoren is aangetoond dat celproliferatie efficiënt te stimuleren<em> In vivo</em<sup> 1,2</sup> En<em> In vitro</em>. Dit effect is gemeld voor mesenchymale stromale cellen (MSC's), fibroblasten en endotheelcellen kolonievormende cellen met bloedplaatjes geactiveerd door trombine<sup> 3-5</sup> Of gelyseerd door vries / dooi cycli<sup> 6-14</sup> Voordat de bloedplaatjes releasate wordt toegevoegd aan de celkweek medium. De trofische werking van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren is al getest in een aantal trials voor tissue engineering en regeneratieve therapie.<sup> 1,15-17</sup> Wisselende efficiency wordt beschouwd als ten minste gedeeltelijk te wijten aan individueel afwijkende concentraties van groeifactoren<sup> 18,19</sup> En een huidige gebrek aan gestandaardiseerde protocollen voor bloedplaatjes voorbereiding.<sup> 15,16</sup> Dit protocol bevat een uitvoerbare procedure om een pool van menselijke bloedplaatjes lysaat (pHPL), afkomstig van routinematig geproduceerd bloedplaatjes rijk plasma (PRP) van veertig tot vijftig enkele bloeddonaties te genereren. Door verschillende vries / dooi cycli van de bloedplaatjes membranen zijn beschadigd en groeifactoren worden efficiënt uitgescheiden in het plasma. Ten slotte worden de bloedplaatjes fragmenten verwijderd door centrifugatie tot uitgebreide aggregaat vorming te vermijden en uitputten potentiële antigenen. De implementatie van pHPL in standaard cultuur-protocollen is een veelbelovend instrument voor de verdere ontwikkeling van de Cell Therapeutics gekweekt in een dierlijk eiwit-vrij systeem.
Protocol
Discussion
In sommige regio's bloedplaatjes rijk plasma (PRP) kan worden verkregen bij buffy-jassen anderszins een afvalproduct van verpakte productie van rode bloedcellen uit donorbloed getest (figuur 1). Optimaal wordt PRP onmiddellijk wordt gebruikt voor de verdere voorbereiding van pHPL, zoals in verouderde bloedplaatjes concentreert de beschikbaarheid van groeifactoren kunnen als gevolg van bloedplaatjes opslag laesies en de afbraak 20 worden verminderd. Verder is het aan te raden om PRP te produceren door het …
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Research Foundation (FWF, subsidie N211-NAN naar de DS) en de Oostenrijkse Research Promotion Agency (FFG verlenen N200 naar de DS). De auteurs danken Claudia Url voor een uitstekende technische bijstand en Monica Farrell voor vertalers.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | ||
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | ||
| Plasma bags (600mL) | Baxter | R4R2021 | ||
| Sterile tubing welder | Terumo | TSCD-II | ||
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | ||
| Water bath | ||||
| Sterile scissors | ||||
| Clamps | ||||
| Centrifuge |
Riferimenti
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &. a. m. p. ;. a. m. p., Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P. The platelet storage lesion. Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A., Gad, S. C. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. , 97-115 (2008).
