הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע
Summary
Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.
Abstract
טסיות דם גורמי גדילה שמקורם הוכחו לעורר התפשטות תאים ביעילות<em> In vivo</em<sup> 1,2</sup> ו<em> במבחנה</em>. השפעה זו דווחה עבור תאים סטרומה mesenchymal (MSCs), fibroblasts ו אנדותל מושבת תאים יוצרי עם טסיות מופעל על ידי תרומבין<sup> 3-5</sup> או lysed על ידי הקפאה / הפשרה מחזורי<sup> 6-14</sup> לפני releasate טסיות מתווסף במדיום תרבית תאים. האפקט trophic של טסיות גורמי גדילה נגזר כבר נוסתה בניסויים מספר הנדסת רקמות וטיפול רגנרטיבית.<sup> 1,15-17</sup> יעילות משתנה נחשב לפחות בחלקה בשל ריכוזי מסתעף פרטני של גורמי גדילה<sup> 18,19</sup> וחוסר הנוכחי של פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת טסיות.<sup> 15,16</sup> פרוטוקול זה מציג תהליך מעשי לייצר מאגר של lysate טסיות הדם האנושי (pHPL) נגזר פלזמה המיוצר באופן שגרתי עשיר בטסיות (PRP) של 40-50 תרומות דם אחת. על ידי הקפאה / הפשרה מחזורים כמה ממברנות טסיות ניזוקים גורמי גדילה משתחררים ביעילות לתוך הפלזמה. לבסוף, שברי טסיות יוסרו על ידי צנטריפוגה כדי למנוע היווצרות מצטבר רב לרוקן אנטיגנים פוטנציאליים. יישום pHPL לתוך תרבות פרוטוקולים סטנדרטיים מהווה כלי מבטיח עבור פיתוח נוסף של הרפוי תא מופצות בבעל חיים חלבון ללא המערכת.
Protocol
Discussion
באזורים מסוימים טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) ניתן לקבל אצל באפי, מעילים אחרת שהוא תוצר פסולת של ארז ייצור תאים דם אדומים מתרומות דם שנבדקו (איור 1). באופן אופטימלי, PRP משמש מיד להכנת נוספת של pHPL, כמו טסיות מיושן מרכזת את הזמינות של גורמי גדילה עשוי להיות מופחת בשל נגעים אחסון ?…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר האוסטרי (FWF, מענק N211-NAN ל DS) לבין מחקר אוסטרי קידום הסוכנות (FFG, מענק N200 ל DS). המחברים מודים Url קלאודיה לקבלת סיוע טכני מעולה מוניקה פארל לעריכה לשונית.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | ||
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | ||
| Plasma bags (600mL) | Baxter | R4R2021 | ||
| Sterile tubing welder | Terumo | TSCD-II | ||
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | ||
| Water bath | ||||
| Sterile scissors | ||||
| Clamps | ||||
| Centrifuge |
Riferimenti
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &. a. m. p. ;. a. m. p., Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P. The platelet storage lesion. Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A., Gad, S. C. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. , 97-115 (2008).
