Overview
该视频演示了小鼠模型中的乳腺癌矫型接种技术。与皮下注射或非手术注射相比,该技术产生的肿瘤发生率高,肿瘤大小和形状的变异性较小。
Protocol
1. 细胞准备(10只小鼠)
注:细胞应在与菜分离后1小时内接种,以避免细胞存活率下降。具体来说,细胞悬浮应在将细胞从盘子中分离后15分钟内混合到明胶蛋白混合物中,以保持其生存能力。
- 培养4T1-luc2细胞,一个小鼠乳腺癌细胞系表达红素酶,在RPMI 1640介质与10%FBS在加湿孵化器在37°C在5%CO2.
- 使用 10 mL 血清移液器用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 在 10 厘米的盘子中清洗粘附的 4T1-luc2 细胞。使用 P1000 移液器添加 1 mL 的 0.25% trypsin,然后在 37 °C 下孵化样品 5 分钟。然后,使用 5 mL 血清移液器添加 4 mL 的生长介质(RPMI-1640 与 10% FBS),并将细胞悬架转移到组织培养罩中的 15 mL 锥形管中。将细胞悬浮在 180 x g下 5 分钟。
- 吸附超自然分子,在PBS的2mL中恢复细胞:然后,使用血细胞仪数一数细胞。
- 在组织培养罩中将 2 x 106 4T1-luc2 细胞悬浮在 40 μL 的冷 PBS(pH 7.4, 4 °C)中。
- 将 40-μL 细胞悬浮液与 360 μL 的明胶蛋白混合物混合在组织培养罩冰上的 1.5 mL 微中量管中。
注:最终浓度为 1 x 105/20μL(1:9 PBS:明胶蛋白混合物)。对于正交模型(无乳房切除术),使用最终浓度的 1 x 104/20μL,以避免在两周内达到安乐死标准(肿瘤大小 + 2 厘米)。
2. 癌细胞接种
- 将小鼠放入麻醉感应室,2-4%异氟兰和0.2L/分钟氧气流动,直到小鼠平静地呼吸(2~3分钟)。
- 抓住鼠标,将0.05毫克/千克丁丙诺啡注射到其肩部皮下。
- 确认足够的麻醉缺乏反应的脚趾捏。将鼠标的鼻子插入小鼠面膜的孔中,使吸入性麻醉具有 2-4% 异氟兰和 2 L/min 氧气流连接到木炭罐单元。
- 使用实验室胶带抑制小鼠的四肢,使用氯西丁、碘和75%乙醇用棉签对皮肤进行消毒。
- 使用无菌微切除剪刀在胸前壁中间切开 5 毫米皮肤切口,将切口旁边的右侧皮肤抬起,然后用剪刀将皮肤从胸壁上分离出来,然后倒置皮肤,露出右#2乳腺脂肪垫。
- 使用 1 mL 胰岛素注射器(带 28.5 G 针头)小心地将 20 μL 的癌细胞悬浮剂注射到通过伤口直接视力下的脂肪垫中。
注:针穿过伤口,而不是皮肤。在拔出针头之前,先将针头放在脂肪垫中5s,这样明胶蛋白混合物才能凝固。 - 使用无菌 5-0 不可吸收的缝合来缝合皮肤切口。
- 手术后,将动物放归干净的笼子,并监测它们,直到它们康复并自由移动(约1~2分钟后)。如果动物在手术后24小时内身体状况不佳,服用丁丙诺啡(0.2毫克/千克)。
- 手术后在麻醉下取出缝合线(见第 2.1 步)7 d。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
5-0 silk sutures | Look | 774B F | |
Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | For cell culture |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell innoculation |