Ортопедическая инъекция: имплантация тканей специфических раковых клеток во взрослую мышь

Overview

Видео демонстрирует технику ортопедической прививки рака молочной железы в модели мыши. Этот метод производит высокий уровень опухолевых с меньшей изменчивостью в размере опухоли и формы по сравнению с подкожной или нехирургической инъекции.

Protocol

1. Подготовка клеток (для 10 мышей)

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть привиты в течение 1 ч после того, как отделены от блюда, чтобы избежать снижения жизнеспособности клеток. В частности, подвеска клетки должна быть смешана в желатиновую белковую смесь в течение 15 минут после отсоединения клеток от блюда, чтобы сохранить их жизнеспособность.

1. Культура 4T1-luc2 клетки, мышь молочной аденокарциномы клеточной линии, выражают люциферазы, в RPMI 1640 средств массовой информации с 10% FBS во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию в 5% CO₂.
2. Вымойте адепт 4T1-luc2 клетки в 10-сантиметровой тарелке с фосфат-буфером солевого раствора (PBS) с помощью 10 мл серологической пипетки. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина с помощью пипетки P1000, а затем инкубировать образец при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Затем добавьте 4 мл средств роста (RPMI-1640 с 10% FBS) с помощью серологического пипетки 5 мл и перенесите подвесную клетку в коническую трубку 15 мл в капюшоне культуры тканей. Центрифуга клеточной суспензии при 180 x g в течение 5 мин.
3. Аспирировать супернатант и повторное распределение клеток в 2 мл PBS; Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
4. Приостановить 2 х 10⁶ 4T1-luc2 клеток в 40 йл холодного PBS (рН 7,4, 4 КК) в ткани культуры капот.
5. Смешайте 40-х клеток подвески с 360 МЛ желатиновой белковой смеси в 1,5 мл микроцентрифуг трубки на льду в ткани культуры капот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 1 х 10⁵/20 йл (1:9 PBS: желатиновая белковая смесь). Для ортопедической модели (без мастэктомии) было использовано 1^{х 10 4}/20 МКЛ конечной концентрации, чтобы в течение двух недель избежать достижения критериев эвтаназии (размер опухоли и 2 см).

2. Прививка раковых клеток

1. Поместите мышей в индукционной камере анестезии с 2-4% изофлюран и 0,2 л / мин кислорода, пока мыши дышать спокойно (2-3 мин).
2. Возьмитесь за мышь и ввимите бупренорфин 0,05 мг/кг в плечо подкожно.
3. Подтвердите адекватную анестезию отсутствием реакции на щепотку нося. Вставьте нос мыши в отверстие маски мыши, что позволяет ингаляционной анестезии с 2-4% изофлюран и 2 л / мин потока кислорода прилагается к блоку канистры древесного угля.
4. Сдерживайте конечности мыши с помощью лабораторной ленты и стерилизовать ее кожу с помощью хлоргексидина, йода и 75% этанола, используя ватные тампоны.
5. Сделайте 5 мм разрез кожи в середине передней стенки грудной клетки, используя стерильные ножницы микроперепись, поднимите правую кожу рядом с разрезом и отсоедините кожу от грудной стенки с помощью ножниц, а затем, инвертировать кожу, чтобы разоблачить право #2 молочного жира площадку.
6. Тщательно ввиснуть 20 МКЛ подвески раковых клеток с помощью 1 мл инсулина шприц с 28,5 Г иглы в жировой колодки под прямым зрением через рану.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игла проходит через рану, а не кожу. Держите иглу в жировой прокладке в течение 5 с до потянув его, что позволяет время для желатиновой белковой смеси, чтобы затвердеть.
7. Закройте разрезы кожи, сшивая, используя стерильные 5-0 неаспасаемых швов.
8. После операции верните животных в чистую клетку и следите за ними до тех пор, пока они не выздоровеют и не будут свободно передвигаться (после 1-2 мин). Если животное не находится в добром состоянии в течение 24 ч после операции, ввести бупренорфин (0,2 мг/кг).
9. Удалить швы под наркозом (см. шаг 2.1) 7 d после операции.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell innoculation and mastectomy
5-0 silk sutures	Look	774B F
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell innoculation and mastectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell innoculation and mastectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell innoculation and mastectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell innoculation and mastectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell innoculation