Overview
הסרטון מדגים את טכניקת החיסון האורתוטופי של סרטן השד במודל עכבר. טכניקה זו מייצרת שיעור גידול גבוה עם פחות שונות בגודל ובצורה של הגידול בהשוואה להזרקה תת עורית או לא כירורגית.
Protocol
1. הכנת תאים (עבור 10 עכברים)
שים לב: התאים צריכים להיות מחוסנים בתוך 1 שעה לאחר מנותק מן המנה, כדי למנוע ירידה בכדאיות התא. באופן ספציפי, השעיית התא צריך להיות מעורבב לתוך תערובת חלבון ג'לטין בתוך 15 דקות לאחר ניתוק התאים מן המנה כדי לשמור על הכדאיות שלהם.
- תרבות 4T1-luc2 תאים, קו תאים אדמנוקרצינומה של עכבר המבטא luciferase, במדיה RPMI 1640 עם 10% FBS באינקובטור לח ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO2.
- שטפו את תאי ה-4T1-luc2 החסידים בצלחת של 10 ס"מ עם תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין באמצעות פיפטה P1000 ולאחר מכן, דגירה המדגם ב 37 °C (69 °F) במשך 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 4 מ"ל של מדיה צמיחה (RPMI-1640 עם 10% FBS) באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל ולהעביר את השעיית התא צינור חרוט 15 מ"ל במכסה המנוע של תרבות הרקמה. צנטריפוגה השעיית התא ב 180 x g במשך 5 דקות.
- לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב 2 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- להשעות 2 x 106 4T1-luc2 תאים 40 μL של PBS קר (pH 7.4, 4 °C (60 °F) במכסה המנוע של תרבות הרקמות.
- מערבבים את השעיית התא 40-μL עם 360 μL של תערובת החלבון הג'לטיני בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח במכסה המנוע של תרבות הרקמות.
שים לב: הריכוז הסופי הוא 1 x 105/20 μL (1:9 PBS:תערובת חלבון ג'לטיני). עבור המודל האורתוטופי (ללא כריתת שד), 1 x 104/20 μL של הריכוז הסופי שימש, כדי למנוע הגעה לקריטריונים המתת חסד (גודל הגידול > 2 ס"מ) בתוך שבועיים.
2. חיסון תאי סרטן
- שים את העכברים בתא אינדוקציה הרדמה עם 2-4% isoflurane ו 0.2 L / min זרימת חמצן עד העכברים לנשום ברוגע (2-3 דקות).
- לתפוס את העכבר ולהזריק 0.05 מ"ג /ק"ג buprenorphine לתוך הכתף שלה תת עורית.
- אשר הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה לצביטת בוהן. הכנס את האף של העכבר לתוך החור של מסכת העכבר, המאפשר הרדמה בשאיפה עם 2-4% איזופלורן ו 2 L / min זרימת חמצן מחובר ליחידת מיכל פחם.
- רסנו את איברי העכבר באמצעות סרט מעבדה ועקרו את עורו באמצעות כלורהקסידין, יוד ואתנול 75%, באמצעות ספוגיות כותנה.
- הפוך חתך עור 5 מ"מ באמצע דופן החזה הקדמון ניצול מספריים microdissection סטרילי, להרים את העור בצד ימין ליד החתך ולנתק את העור מקיר החזה באמצעות מספריים, ולאחר מכן, להפוך את העור כדי לחשוף את הזכות #2 כרית שומן ממותה.
- בזהירות להזריק 20 μL של השעיית תא סרטן באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28.5 G לתוך כרית השומן תחת ראייה ישירה דרך הפצע.
שים לב: המחט עוברת דרך הפצע, לא דרך העור. ממשיכים להחזיק את המחט בכרית השומן במשך 5 שניות לפני משיכתה החוצה, מה שמאפשר זמן לתערובת החלבון הג'לטיני להתמצק. - סגור את חתכי העור על ידי תפירה, באמצעות תפרים סטריליים 5-0 שאינם נספגים.
- לאחר הניתוח, להחזיר את בעלי החיים לכלוב נקי לפקח עליהם עד שהם התאוששו והם נעים בחופשיות (לאחר ~ 1-2 דקות). אם בעל חיים לא נראה במצב בריאותי טוב בתוך 24 שעות של ניתוח, לנהל buprenorphine (0.2 מ"ג / קילוגרם).
- הסר את התפרים תחת הרדמה (ראה שלב 2.1) 7 ד לאחר הניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
5-0 silk sutures | Look | 774B F | |
Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | For cell culture |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell innoculation and mastectomy |
Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell innoculation |