Summary
הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.
Abstract
אנו מתארים את השימוש בInterferometry Bio-השכבה ללמוד אינטראקציות מעכבות של ε למקטע עם מורכב הקטליטית של ה-ATP synthase Escherichia coli. ה-ATP synthase F-סוג חיידקים הוא היעד של אנטיביוטיקה חדשה, שאושרה על ידי ה-FDA כדי להילחם שבחפת עמידה לתרופות. הבנת חיידקים ספציפיים אוטומטי עיכוב של ה-ATP synthase ידי תחום בטרמינל C-של ε למקטע יכול לספק אמצעי חדש כדי למקד את האנזים לגילוי של תרופות אנטי בקטריאליים. תחום בטרמינל C-של ε עובר שינוי קונפורמציה דרמטי כאשר מעברי האנזים בין המדינות פעילות ולא פעילים, וligands קטליטי האתר יכולים להשפיע על איזה מהתצורות של ε הוא דומיננטי. צעדי assay קינטיקה של מחייב / הניתוק של ε עם מורכב קטליטי, ובעקיפין מאהsures המשמרת של ε בכריכת האנזים ומקונפורמציה המעכבת nondissociable כנראה. אות Interferometry Bio-השכבה אינה רגישה יתר על המידה להרכב פתרון, כך גם ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands קטליטי האתר על שינויי קונפורמציה של ε.
Introduction
אינטראקציות בין חלבונים חשובות לתהליכים ביולוגיים רבים, ושיטות אופטיות ללא תווית כמו Surface Plasmon תהודה (SPR) היו בשימוש במבחנה ללמוד קינטיקה של מחייב ודיסוציאציה 1. רוב השיטות ללא תווית לשתק biomolecule אחד על משטח חיישן ולהשתמש אות אופטי לאיתור שותף מחייב מפתרון כפי שהוא מקשר עם biomolecule המשותק 1. בעוד SPR הוא שיטה רגישה מאוד, הוא נוטה להפרעות כתוצאה משינויים במדד השבירה של הפתרון זורם על החיישן 2. למרות שלא רגיש כמו SPR, Bio-שכבת Interferometry (BLI) הוא פחות מושפע משינויים בהרכב מדגם 1,3. BLI משתמש biosensors סיבים האופטיים שיש להם ציפוי ביולוגית קניינית בקצה. המערכת משמשת כאן (שמינייה-RED96) מכילה שמונה הספקטרופוטומטרים. אור לבן מוזרם לשורה של בדיקות שתעבורנה על זרוע רובוטית. חיישנים אופטיים סיבי arדואר נאסף על ידי החלליות ועבר לצלחת 96 היטב המכילה דגימות. אחת ממולקולות המטרה הוא משותק על פני השטח biosensor. אז חיישנים מועברים לבארות המכילות שותף המחייב בתמיסה. BLI עוקב אחר קשר של השותף מחייב עם המולקולה המשותקת, ולאחר מכן עוקב אחר ניתוק לאחר שעבר את החיישנים לפתרון ללא שותף המחייב. הכריכה של מולקולות על פני השטח biosensor מובילה לשינויים בהפרעות אופטיות בין גלי אור המשקפים חזרה להספקטרופוטומטרים ממשטח פנימי ומתוך הממשק החיצוני בין החיישן ופתרון. שינויים אלה בהתערבות ניתן לכמת ומשמשים לקביעת שיעורים הקינטית של כריכה, דיסוציאציה, כפי שסוכם באנימציה של איור 1.
יש לנו ליישם BLI למדוד אינטראקציות בין המתחם הקטליטית של ה-ATP synthase חיידקים ומקטע ε שלה, אשר יכול אוטומטית מעכב את האנזים. סאי ה-ATPnthase הוא nanomotor סיבובי מוטבע קרום שמזרז סינתזה והידרוליזה של 4-ATP. קומפלקס קטליטי (F 1) יכול להיות מבודד בצורה מסיסה שעובדת כATPase. יש ε המקטע שני תחומים: תחום N-המסוף (NTD) הוא דרוש להרכבה נכונה וצימוד תפקודי של האנזים, אך לא במגע ישיר עם יחידות משנה קטליטי; תחום בטרמינל C-(CTD) יכול לעכב את האנזים על ידי אינטראקציה עם יחידות משנה קטליטי מספר 5,6. רגולציה בתיווך ε זה היא ספציפית לsynthases ה-ATP בקטריאלי ואינו נצפתה בhomologue המיטוכונדריה. ה-ATP synthase התפתחה כמטרה לתרופות אנטיבקטריאליות, כפי שמוצג על ידי אישור ה-FDA לאחרונה bedaquiline לטיפול שבחפת עמידה לתרופות 7. לכן, מיקוד התפקיד המעכב של ε לגילוי סמים יכולים להניב antibacterials שלא לעכב את ה-ATP synthase המיטוכונדריה. עם המתחם המבודד קטליטי (F 1), εהופך למקטע קשור זה. עם זאת, עם ε חייב 1 F, εCTD יכול לעבור שינוי קונפורמציה דרמטי, החדרה באופן חלקי לתוך החלל המרכזי של האנזים ולהרכיב מדינה מעכבת שלא סביר לנתק ישירות 6,8. אנו משתמשים BLI למדוד קינטיקה של F 1 / ε מחייב ודיסוציאציה, ובעקיפין, על מנת לבחון אפקטי allosteric של קטליטי אתר ligands על קונפורמציה של ε.
במערכת שלנו, ε נבחר לקיבוע על משטח החיישן מאז אות BLI (כמו SPR) הוא רגיש למסה של המולקולות מחייבות על פני השטח. מקטע ε הוא (~ 15 KDA) קטן יחסית למתחם העיקרי F 1 (~ 347 KDA). לפיכך, אות BLI גדולה יותר תגרום מכריכה של 1 F לε המשותק. על מנת לפקח דיסוציאציה F 1, אשר יכול להיות מאוד איטי, ε חייב להיות חזק משותק. לכן בחרנו biotinylate; ולשתק אותו על biosensors streptavidin מצופה. ניתן biotinylated חלבונים על ידי שינוי (i) אקראי של lysines פני השטח 9, (ii) תגובה של ציסטאין ילידים מהונדס או ייחודי עם מגיב ביוטין-maleimide 10 או (iii) גנטי הוספת הפפטיד יוטין-acceptor ספציפי שbiotinylated אנזימים במהלך בביטוי vivo של החלבון מתויג 11. במערכת שלנו, ε הוא biotinylated באמצעות שיטה (iii) 8. ברגע שε-מתויג ביוטין הוא משותק על חיישני streptavidin, BLI יכול למדוד את הכריכה וניתוק של 1 F כי כבר מדולדל של ε למקטע (F 1 (-ε)). לניסויים שתוארו כאן, מבחני ראשוניים שנעשו כדי לקבוע כמויות סבירות של חלבון biotinylated כדי לשתק בחיישנים. זה יכול להשתנות, בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון ושותף המחייב שלה, אבל המטרה היא לקבוע כמות מזערית של חלבון לא משותקיםכובע מספק (i) מקובל אות לרעש לכריכת קינטיקה עם ריכוז נמוך של שותף המחייב (להלן K D) וכן (ii) עיוות מינימאלית של כריכת קינטיקה עם ריכוז להרוות-קרוב של שותף המחייב. כמו כן, הרכב של biotinylation עשוי להשתנות (אך להימנע> ביוטין / חלבון mol mol 1), ולכן חלק assay הראשוני עשוי להיות נחוץ לכל מנה חדשה של חלבון biotinylated כדי לאשר שאות BLI עקבית יכולה להיות מושגת בחוסר התנועה בstreptavidin מצופה חיישנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכנות המכשיר לAssay BLI
הפעל את המכשיר לפחות שעה אחת מראש כדי לאפשר את המנורה כדי להתחמם, זה הכרחי כדי למזער את הרעש ולהיסחף באותות אופטיים במהלך הניסוי. הגדר את הטמפרטורה הרצויה באמצעות כרטיסיית המכשיר לprewarm מדגם בעל הצלחת. ואז להגדיר את עיצוב הניסיון בתוכנת רכישת נתונים. בחר "ניסוי החדש קינטיקס" בכרטיסייה אשף הניסוי. זה מציג תפריט עם לשוניות עם כל הצעדים שחייבים להיות מוגדר.
1.1. הגדרת פלייט
הגדר את העמודות כדי לשמש על צלחת מדגם 96 היטב. הקצאת עמודות להכיל חיץ, חלבון משותק או שותף מחייב. לכל עמותה גם, הזן את הריכוז מחייב שותף לשמש. הערה: יש לו את הגדרת הצלחת שמוצגת באיור 2 אפשרויות למבחנים שונים.
1.2. הגדרת assay
ontent "> הגדר את כל נחוצים עבור assay הצעדים. אלה כוללים Baseline (ט) (מספר), (ii) טוען, (iii) התאחדות וכן (iv) דיסוציאציה מחייב שותף. ואז, כפי שיתואר להלן, לקשר צעדי assay פרט עם עמודות של בארות על צלחת המדגם על ידי בחירת צעד assay ולאחר מכן לחיצה כפולה על העמודה המתאימה. תוכניות זה החיישנים שעברו מטור אחד של בארות למשנהו במהלך assay.- Baseline
להתחיל בצעד קצר בסיסי (≥ 60 שניות), עם חיישנים במאגר assay (איור 2, טור 1), להקים אותות BLI ראשוניים בצלחת 96 היטב. - טוען (לשתק את חלבון biotinylated על החיישנים)
הקצאת חיישנים לבארות שיכילו חלבון biotinylated (איור 2, עמודת 2). השתמש בפונקצית הסף כדי להשיג רמה קבועה מראש של מחייב (ראה מבוא). הגדר את אפשרות הסף, כך שכל החיישנים יהיו מהלךד לטור הבא של בארות, כאשר כל אחד מהחיישנים מגיע לסף. - Baseline
כולל צעד בסיסי אחר במאגר (איור 2, טור 3, בדרך כלל> 5 דקות) כדי לשטוף חלבוני biotinylated nonimmobilized מהחיישנים ולהקים אותות בסיס חדשים, יציבים. עבור מבחני מחייב / ניתוק בסיסיים בלבד (כמו באיור 3), כולל צעד נוסף בסיסי (60 שניות) עם חיישנים בבארות חדשות של חיץ (איור 2, טור 4) לפני השלב האגודה. - האגודה (של השותף מחייב את החלבון המשותק)
עבור assay בסיסי מחייב / דיסוציאציה (כמו באיור 3), בחר טווח ריכוזים של שותף מחייב לשמש לחיישנים / בארות שונות (איור 2, בטור 5). התאם את זמן צעד, כך שלפחות ריכוז להרוות של שותף המחייב צריך גישת שיווי משקל מחייב אות. עבורassay כדי לבדוק את השפעות allosteric של ligands הקטן על ניתוק של מתחם חלבונים (כמו באיור 5), בחר ריכוז אחד גבוה של שותף מחייב (~ פי 10 מעל המוערך K D) לשימוש בכל בארות העמותה. - דיסוציאציה (של שותף המחייב)
עבור assay בסיסי מחייב / ניתוק בלבד (כמו באיור 3), לייעד את החיישנים כדי לחזור לעמודת 4 (איור 2), אותו בארות המאגר כמשמש לבסיס הנוסף לפני האגודה. עבור assay כדי לבחון השפעות allosteric של ligands הקטן, במקום לייעד חיישנים כדי לעבור לעמודה 6 (איור 2), שבו כל אחד גם יכול להכיל חיץ בתוספת ligands allosteric שונה.
1.3. הקצאת חיישן
לציין את מיקומם במגש החיישן שיכיל חיישני prewetted עבור assay. זהה את כל עמדות ריקות מאז הניסוי FAIl אם אין חיישנים נאספים.
1.4. ניסוי ביקורת
דמיינו את כל הצעדים המתוכננים כדי לבדוק טעויות ולחזור כדי לתקן אותם.
1.5. הפעל ניסוי
הזן את פרטים דרושים, ובכלל זה מיקום של קבצי הנתונים. הזן את הטמפרטורה הרצויה לצורך הניסוי. אם חיישנים עדיין דורשים prewetting, בחר את האפשרות לדחות את תחילת הניסוי. לבסוף, לאחר כל הכנת המדגם היא מלאה (שלב 2) והן את צלחת המדגם ומגש חיישן נטענות במכשיר, לחץ על כפתור Go כדי להפעיל את assay.
2. לדוגמא הכנה
- הכן את חיץ assay מתאים. המאגר משמש לניסויים מוצגים באיורים 3 ו -5: 20 מ"מ מגבים (3 - חומצה (N-morpholino) propanesulfonic), טריס (טריס (hydroxymethyl) אמינו מתאן) (הוסיפו לכדי להתאים את pH 8.0), 50 מ"מ KCl. כולל ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור, חומצות שומן חופשי, 0.5מ"ג / מיליליטר סופי) במאגר עבור כל שלבי assay ולתמיד דילולים של חלבון biotinylated או השותף מחייב למזער ספציפי מחייב של חלבונים לחיישנים.
- לדלל את חלבון biotinylated (ε) במאגר assay לריכוז מתאים (ראה מבוא).
- הכן דילולים של שותף המחייב (F 1 (-ε)) במאגר assay (ראה דיון לטווח של ריכוזים להשתמש).
- Prewet חיישני streptavidin המצופה לפחות 10 דקות כדי להסיר ציפוי סוכרוז המגן שלהם. הסר את המדף המכיל חיישן ממגש החיישן ולהכניס את צלחת 96 היטב בחלקו התחתון של המגש, הזזה פינה אחת של הצלחת לתוך החריץ המכוון על המגש. לטור של חיישנים כדי לשמש, להוסיף 200 μl של חיץ assay לכל טוב באותה עמודה של צלחת 96 היטב. להחזיר את המתלה של חיישנים למגש בכיוון הנכון (עם כרטיסיות בחריצים).
- כפי שהוקצה במהלך תכנות בשלב 1, למלא בארות oו צלחת המדגם עם חיץ assay או דילולים החלבון המתאימים, כמו באיור 2. למנוע החדרת בועות, כפי שהם יכולים לגרום לרעש באותות אופטיים. כולל בארות התייחסות אחת או יותר שמשמיטות או חלבון (i) biotinylated או (ii) שותף מחייב.
- פתח את הדלת של המכשיר והכנס את מגש החיישן על הבמה (משמאל), עם הכרטיסיות של המגש מוכנסות לתוך החריצים של הבמה. הכנס את צלחת המדגם לבעל הצלחת (מימין); לוודא כי הצלחת יושבת שטוחה ובכיוון הנכון, כפי שמצוין על בעל הצלחת. סגור את הדלת ולהתחיל assay מתכנית רכישת נתונים (שלב 1.5).
3. עיבוד נתונים
- לאחר assay יש לרוץ, לפתוח את תוכנת ניתוח נתונים ולטעון את התיקייה המכילה את הנתונים. לחץ על הלשונית "עיבוד" כדי לראות תפריט צעד חכם עיבוד (בצד השמאל) ואת הנתונים הקינטית הגלם, עם כל חיישן (AH) שהוקצה בצבע שונה (ראהאיור 3).
- תחת "נתונים לבחירה", לחץ על הכפתור "חיישן לבחירה". על "מפת פלייט לדוגמא", לייעד את הבארות לחיישני 1 או 2 שליטה (G, H בassay של איור 3) כמו בארות התייחסות. בתפריט העיבוד, סמן את תיבת "חיסור" ובחר באפשרות "הפניה ולס" להחסיר אות ייחוס (בודדת או בממוצע) מהאותות של כל חיישן אחר.
- יישר את כל העקבות לY = 0 על ידי שימוש בצעד "יישור Y הציר". בחר "Baseline" כצעד היישור (זה להיות הבסיס האחרון לפני השלב האגודה). עבור "טווח זמן", הזן שעברה 10 שניות של בסיס ש( כלומר 50-60 שניות לתחילת מחקר 60-sec, כמו באיור 3).
- סמן את תיבת "Inter-צעד תיקון" כדי למזער משמרות אות בין צעדי האיגוד ודיסוציאציה. בחר ליישר קו בסיס או דיסוציאציה.
- בחר פונקצית סינון Savitzky-Golay ברוב המקרים ולחץ על "נתונים בתהליך!" כדי להמשיך. ראייה לבדוקעיבודים הסופיים (פנל ימני תחתון). עם מבחני המיועדים לניתוח נתונים הגלובלי (כמו באיור 4), אם עקבות אות מראות שינוי משמעותי בין האיגוד וצעדי דיסוציאציה, לשנות את הבחירה של דיסוציאציה או Baseline ל" תיקון אינטר הצעד "ולעבד מחדש את הנתונים לפני שתמשיך לנתונים ניתוח.
4. ניתוח נתונים
לחץ על הלשונית "ניתוח" בניתוח נתונים כדי להתחיל. הערה: בדוגמא על השלבים להלן לניתוח הגלובלי של עקומות מחייב / ניתוק מרובים (כמו באיור 3).
- ל" צעד כדי לנתח ", בחר איגוד ודיסוציאציה. עבור "דגם", בחר 1:1. הערה: אפשרויות מוגבלות אחרות זמינות.
- ל" התאמה ", לבחור גלובלי (מלא). עבור "קיבוץ לפי" בחר צבע (כמו בגרף). בחר "מקסימום R לא צמוד על ידי חיישן" כדי לאפשר התאמה עצמאית של מקסימום R (תגובת אות מקסימלי על להרוות מחייב של הנקובtner לחלבון המשותק). הערה: אנחנו עושים את זה עבור רוב מבחני, כמו חיישנים להשתנות מעט בכמות החלבון המשותקת (ראה איור 3, טוען).
- בטבלה המוצגת, ודא שיש כל עקבות החיישן להיות מנותחים באותו צבע, ולכן הם ינותחו כמערכת גלובלית. במידת צורך, בחר חיישן אחד או יותר עקבות להשמיט ממדידה העולמית: תחת העמודה "כלול", לחץ לחיצה ימנית על מיקום החיישן הרצוי ובחר "תכלול ולס".
- לחץ על "Curves Fit!" כדי להתחיל את ניתוח רגרסיה ליניארית. לבחון את התוצאות מתאימות, הכוללות כיסוי (i) של עקומות רגרסיה עם עקבות נתוני חיישן (כמו באיור 4), (ii) מגרשים של שאריות הולמת, וכן (iii) טבלה עם ערכי פרמטרים שנקבעו (קבועי קצב, R מקסימום, K D) ונתונים סטטיסטיים (סטיות התקן עבור פרמטרים, צ'י בריבוע, R 2).
- תחת "יצוא נתונים", לשמור את התוצאות מתאימות על ידי לחיצה על "יצוא טבלה ל. קובץ CSV". לgrapהינג או ניתוח נוסף של הנתונים / עקומות מצוידות בתוכנה אחרת, לחץ על "התאמת תוצאות יצוא" כדי לשמור את הנתונים של כל חיישן ועקומה מצויד בקובץ טקסט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זמן אמת מחייב וקינטיקה BLI הניתוק מוצגות באיור 3. ניסוי זה נעשה עם חיץ assay בעמותה ודיסוציאציה. ניסוי זה החל בצעד בסיסי 10 דקות מאז החיישנים היו prewet רק לזמן קצר. בשלב בא, ε biotinylated הועמס על החיישנים. אין ניתוק לגילוי של ε התרחש לאורך כל השלבים הנותרים כפי שניתן לראות מעקומת ההתייחסות (G) שלא הייתה לו שותף מחייב הוסיף. חיישן התייחסות שני (H) היה נטול חלבון משותק והראה ספציפי מחייב נמוך של שותף המחייב. ריכוזים שונים של F 1 (-ε) שימשו בשלב העמותה לחיישנים AF על מנת להתאים את התוצאות בעולם ולקבל את הערכים הטובים ביותר עבור k, ד יא, ו-K D. תוצאות עובדו כמו בפרוטוקול, מניב עקבות נתונים (הכחול) באיור 4. במקרה זה, H עקבות חיישן ההתייחסות הופחת מTR המדגםאסים כדי לתקן ספציפי מחייב של סחיפת השותף ואות המערכת המחייבת. בשלב ניתוח הנתונים, את כל העקומות היו בעולם כושר עם מודל 1:1 (אחד יא, ד יא היחיד); "גלובל (מלא)" בכושר מניח ניתוק של שותף המחייב שלם (אות תחזור לאפס באינסוף זמן) (איור 4, אדום). שימו לב, לשני הריכוזים הגבוהים ביותר של F 1 (-ε), יש סטיות קטנות אך משמעותיות של נתונים מהמודל הגלובלי, 1:1. רמות נמוכה של ליגנד המשותק (למקטע "ε" biotinylated) שימשו, והכושר לא השתפר על ידי הכללת גורם המוני תחבורה במודל (לא מוצג). עם זאת, F 1 (- "ε") הוא מורכב (~ 350 KDA) גדול, וניסויים אחרים (לא מוצגים) מראים כי סטיות אלה בשל נגישות מחייבת מופחתת של שבריר של ליגנד המשותק, כלומר 1 F חייב "Ε" אפשר sterically לעכב גישה לbiotinylated אחר"Ε" מחויב באותו tetramer streptavidin.
איור 5 מראה ניסוי שונה בהם את האנזים היה קשור לחיישן משותק ε בנוכחות 1 מ"מ ATP / EDTA, זה לתשומת ביותר F 1 מתחמים "ε" / להניח קונפורמציה noninhibitory, אשר מנתק בקלות 8. חיישנים אז הועברו לניתוק בארות המכילות חיץ assay עם ligands שונה. זה מדגים את ההשפעות של ligands שונה בקונפורמציה של ε. לדוגמא, חשיפה לMgADP / פיי האטה דרמטית דיסוציאציה נטו, המציין כי ε עבר קונפורמציה למדינה בחוזקה-הכפות, מעכבות. קינטיקה דיסוציאציה מורכבת נצפתה מאז ligands שונה הנגרם על משמרות שונות בכל החלק של 1 F. מתחמי ε עם ε בתצורות הפעילים (קשורות זה) או מעכבות (nondissociable). ייתכן גם ששינויי קונפורמציה משמעותיים של חלבונים קשוריםלתרום ישירות לשינויים באות BLI אבל, במחקרים שלנו, זה נראה זניח בהשוואה לאות לכריכה / ניתוק של המתחם F 1 הגדול (ראה שאה ואח' 8, איור 5D;. מעבר לעקומות 3 ו 6 תכנית התנהגות דומה מאוד, אם כי התנאים שלהם לטובת תצורות שונות של F כבול 1). תוכנת ניתוח נתונים שאינה מיועדת לקינטיקה דיסוציאציה מורכבת כאלה. לפיכך, אנו לייצא את הנתונים לקבצי טקסט לניתוח רגרסיה ליניארית עם תוכנות אחרות.
איור 1. עקרונות Interferometry Bio-השכבה. אנימציה מסכמת את הפיזיקה שבבסיס לאיתור האינטראקציה biomolecular ידי BLI. אור עובר דרך הבדיקות באו לידי ביטוי בחזרה להספקטרופוטומטרים (i) מהמשטח הפנימי של החיישן וכן (ii) מהחיצוני בterface של החיישן עם הפתרון לדוגמא. התוצאה בתבנית התאבכות. כריכה של מולקולות על פני השטח החיישן משנה את תבנית ההתאבכות. ניתן להתוות כמשמרת ננומטר של עוצמה היחסית לעומת אורך גל. ניטור משמרת ננומטר זה לאורך הזמן מספק קינטיקה מחייבת ודיסוציאציה. גרפיקה מותאמת באישור 12 FortéBio.
איור 2. הסדר סכמטי של דגימות בצלחת דגימת 96 היטב. החיישנים יועברו במקביל מעמודה לעמודה וניתן להעביר או שמאלה או ימינה כפי שהוגדרו בפרוטוקול assay מסוים. ולס עם צבע אפור מייצג חיץ assay ואילו אדום, כחול וירוק מייצג חלבון משותק, מחייב השותף וligands, בהתאמה.
איור 3. לכידת מסך המציגה נתונים גולמיים מassay BLI. קווים אדומים אנכיים מצביעות על תנועה של חיישנים בין שלבי assay של הפרוטוקול. סוגי שלב מסומנים בתמונה. מיקומים של חיץ ודגימות כפי שמוצגים באיור 2. כפי שצוין על ידי מספרים לאורך החלק העליון של הגרף, חיישני streptavidin מצופה הועברו בין עמודות השונות של צלחת המדגם לפי הסדר הבא: 123,454. האגדה מתחת לגרף מציינת את הצבע לעקבות נתונים של כל חיישן. בשלב הטעינה, כל חיישן למעט H הודגר עם 50 ננומטר למקטע "ε" biotinylated. בצעד האיגוד, חיישנים הודגרו עם ריכוזי ננומטר של מדולדל F "ε" 1: 30 (, H), 20 (, 15 (C), 10 (ד '), 5 (ה), 2.5 (F) B), 0 ננומטר (G). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. לכידת מסך של הנתונים נותחו מassay BLI של איור 3. הנתונים הייתה מעובד ומצויד כפי שמתוארת בטקסט. רק צעדי איגוד ודיסוציאציה מוצגים, מחולקים על ידי קו אדום אנכי. עקומות העיבודים הן כחולות; רגרסיה ליניארית מתאימה מ1:01 ניתוח הגלובלי מוצגות באדום. תוצאות הולמת גלובל 8: k = 2 x 10 5 מ -1 s -1 (± 0.1%), ד k = 4.8 x 10 -5 s -1 ("±" 0.1%), מניב K D = 0.24 ננומטר. טיב ההתאמה: R2 = .999054. הפרמטר המקסימאלי המחייב (מקסימום R) היה בכושר בנפרד לכל חיישן, עם ערך ממוצע = 0.813 ננומטר ("±" .0803). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. תוצאות מassay BLI שהראה השפעות allosteric של ligands בקונפורמציה של ε. F 1 (-ε) היה קשור לחיישן משותק ε בנוכחות 1 מ"מ ATP / EDTA. סיום שלב ההתאגדות וחלק של שלב הניתוק מוצג. במהלך שלב דיסוציאציה, ligands הברור עבור F 1 אתרי קטליטי (רשומים לכל זכר) נכללו להתבונן השפעות allosteric על ניתוק של 1 F
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מכשירים זמינים כעת עבור BLI לאפשר תפוקה משמעותית וגמישות במבחנים לאינטראקציות biomolecular. דגימות פתרון שונות הם ויתרו בבארות של צלחת microtiter שחורה, ומערכת של חיישני BLI מקבילים מתוכנתות לנוע קדימה ואחורה בין העמודים של בארות על הצלחת. הדגימות הם עוררו על ידי טלטול מסלולית לאורך assay. יש המערכת המשמשת כאן 8 חיישנים ומשתמשת בצלחת דגימת 96 היטב, אבל מערכת אחרת משתמשת 16 חיישנים וצלחת מדגם 384 גם. כך, אינטראקציה בין biomolecule משותק חיישן ושותף המחייב שלה בפתרון, ניתן לבדוק בתנאים שונים עם חיישנים מרובים במקביל. לדוגמא, בassay הראשון שהוצג כאן עם מקטע ε המעכב המשותק, אינטראקציות נמדדו עם שישה ריכוזים שונים של האנזים (שותף מחייב) במקביל (איורים 3 ו -4). זה אפשר ניתוח גלובלי לdetermine זוג אחד של קבועי קצב (k ד יא,) לנטו מחייב ודיסוציאציה, וכך קבוע דיסוציאציה שיווי המשקל (K D = k ד / יא), שמסכים באופן הדוק עם קבוע המעכב (K אני) נקבע מ מבחני פתרון של עיכוב אנזים על ידי ε 8. סוג שני של ניסוי (איור 5) הוכיח כי BLI יכול גם לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands הקטן על יחסי הגומלין בין שני חלבונים; ההשפעות של ligands שונה הושוו במקביל. ישנן מגבלות לאיתור תופעות של ligands allosteric, שכן אות BLI תלויה במסה של המולקולה המחייבת, ובאופן ישיר יכולה לזהות מחייב של תרכובות קטנות בתנאים מותאמים 13. עם זאת, בassay של איור 5, שותף המחייב, 1 F, היה גדול ומורכב חלבון (~ 347 KDA), ולכן אות BLI ל/ ניתוק המחייב שלה לא הושפעה באופן משמעותי על ידי מודעהditional מחייב של ligands הקטן כגון ה-ATP (~ 500 דא) למתחם F 1. זו אושרה במבחנים שבי ligands אלה לא השפיע על אות BLI עבור F 1 חייב צורה קטועה של ε חסר CTD המעכב 8. לפיכך, מבחני של אפקטי allosteric חייבים לשקול את המסה של קרוב המשפחה יגנד allosteric להמונים של חלבוני האינטראקציה, ורצוי לכלול בקרות לבדיקת תגובות BLI ישירות על הכריכה של ליגנד.
שים לב שצעדים מסוימים ושינויים בפרוטוקול הניסוי יכולים להיות קריטיים להשגת תוצאות וניתוח מדויק יותר יותר טובים. לדוגמא, כמו בפרוטוקול המתואר כאן (ראה צעדים 1.2.3, 1.2.5), assay המיועד לניתוח הגלובלי של מחייב וקבועים שיעור דיסוציאציה צריך לכלול צעד נוסף בסיסי (ראה שלב 1.2.3) בטור חדש בארות חיץ (איור 2, טור 4) לפני שלב האיגוד, והחיישנים צריכים להיות returned לאותה עמודה של בארות חיץ לצעד דיסוציאציה (ראה צעד 1.2.5). לאחר כל חיישן באותו גם (עם אותו התכונות אופטיות) לפני ואחרי צעד האיגוד יכול לשפר את התיקון בין הצעד (צעד 3.4) לצעדי האגודה / דיסוציאציה, וזה מאפשר התאמה הקינטית הגלובלית של עקבות נתונים מרובות (כמו ב איור 4). כמו כן, למבחנים, כי הם יותר מאשר ראשוניים שמוצגים כאן, יש לו את תכנית אופציה לקצר או להאריך את הזמן של כל שלב במהלך assay (בזמן שהוא השלב הפעיל). זה שימושי, למשל, אם אות הטעינה האופטימלית אינה ידועה כבר, או אם הוא זקוק לזמן נוסף כדי לאפשר מספיק דיסוציאציה כדי להשיג בכושר טוב לשיעור דיסוציאציה.
לא ספציפי מחייב של השותף מחייב את משטח החיישן יכול להיות בעיה לשיטות ללא תווית כגון SPR וBLI. במבחנים שלנו, זה היה ממוזער ביעילות על ידי ארגון ה-BSA, כולל במאגר assay. כמו בimmunoblotפרוטוקולי טינג, יכולים לשמש חלבונים אחרים מאשר ארגון ה-BSA, וריכוזים נמוכים של חומר ניקוי עשויים גם לצמצם ספציפי מחייב (Tween20 משמש בקינטיקה חיץ מהספק). אפילו עם כריכה ספציפי מינימאלית, רוב מבחני צריכים לכלול חיישן שלט אחד לפחות ללא חלבון משותק, אך עם הריכוז הגבוה ביותר של שותף מחייב בשלב האגודה (ראה איור 3, H חיישן); חיסור של ספציפי שיורי מחייבים (והריקבון שלה במהלך צעד דיסוציאציה) יכול לשפר באופן משמעותי הקינטית מנתח עבור הנלמד מחייב / ניתוק מסוים. מצד השני, ברגע שמבחנים ראשוניים מאשרים כי חלבון biotinylated נשאר כבול ביציבות לאחר שלב הטעינה (ראה איור 3, G חיישן), שליטה שיכולה להיות מושמטת והחיישן שניתן להשתמש בם למצב מדגם.
לקביעה חזקה של קבועי עמותה ודיסוציאציה שיעור באמצעות BLI, ריכוזים שונים של bיש להשתמש שותף inding וכל עקבות הנתונים צריכים להיות בכושר על ידי ניתוח הגלובלי, במידת האפשר (כמו באיורים 3 ו -4). באופן אידיאלי, בטווח של ריכוזים צריך לכלול ~ מעל פי 10 ומתחת D K המשוער. במקרה שלנו, עם אינטראקציה גבוהה זיקה (K D = 0.25 ננומטר), רעש אות להיה עני לכריכת קינטיקה עם ריכוזי D תת-K. לכן, ריכוזים של מחייב שותף מעל K D שימשו כך ששינויים משמעותיים בשיעורים ורמות של הכריכה נצפו התקבלו (ראה איור 3). כמו כן, צעד ניתוק ארוך שימש כדי לשפר את הביטחון בהתאמת שיעור הניתוק האיטי. עם אינטראקציות זיקה גבוהות, אפשר גם שניתוק איטי מוגזם על ידי rebinding במהלך שלב הניתוק, שכן מבחני BLI נעשים במדגם עורר ולא זרימה המשיכה על החיישן, כמו עבור SPR. חפץ פוטנציאל זה ניתן לבדוק עם כאומר שבחיץ הניתוק מכיל 'כיור' של חלבון התחרותי העודף שנקשר שותף מחייב ניתק ומונע ממנו rebinding לחלבון משותק חיישן 14. במערכת שלנו, זה נעשה על ידי השוואת תוצאות עם ובלי (> פי 10 מעל K D) nonbiotinylated בדיסוציאציה היטב, ואנחנו אישרו rebinding שלא הייתה בעיה משמעותית 8. לבסוף, אם סטים של תוצאות הקינטית לא מתאימים היטב על ידי ניתוח הגלובלי (1:1 או 2:01 דגמים זמינים), יש אפשרויות ניתוח אחרות לפתרון בעיות. לדוגמא, במקום לבחור "גלובל (מלא)" (בשלב 4.2), ניתן לבחור "מקומי" כדי שיתאימו לכל עקבות חיישן באופן עצמאי. אם מחייב כדלקמן מודל פשוט 1:1, זומם שיעורים שנצפו המחייבים (תצפיות k) לעומת הריכוזים של מחייב שותף צריך להראות תלות ליניארית, עם השיפוע שווה מסדר השנייה, השיעור מחייב הפנימי. כרטיסיית ניתוח של התוכנה יש "XY"חלון גרף שמאפשר הדמיה מהירה של מערכת יחסים זו.
מגבלה אחת של המכשיר שבו השתמש היא טווח הטמפרטורות זמין. עם טווח של 2 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת סביבה ל40 º C, ניתן להשתמש רק מולקולות שאינן יציבים בטווח זה. יתר על כן, ניתוח תרמודינמי הוא מוגבל על ידי טווח הטמפרטורות הצר. מגבלה נוספת כללית היא שזמן assay המרבי הוא ~ 4 שעות, אחרי זה, חפצים לפתח בשל התאדות של דגימות מצלחת microtiter הפתוחה.
BLI כרוך הסדר פשוט יחסית בהשוואה לSPR. החיישנים מועברים בין העמודות של בארות עם כמויות קבועות, ולא זרם בלתי פוסק של מדגם על פני החיישן. למרות שלא רגיש כמו SPR, BLI הוא פחות מושפע משינויים במקדם שביר עקב שינויים בהרכב מדגם. בסך הכל, בקלות יחסית זה של שימוש וגמישות של המכשיר בהסטה בין תנאי assay, BLI לספקsa כלי תכליתי למבחני חוץ גופייה של אינטראקציות biomolecular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים FortéBio למתן גרפיקה המשמשת באיור 1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM083088 לTMD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
References
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. Hackney, D. D., Tamanoi, F. XXIII, Elsevier Academic Press. 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -x, Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
