Summary
यहाँ प्रोटोकॉल जैव परत इंटरफेरोमेट्री साथ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की गतिज assays का वर्णन है. सेलुलर ऊर्जा चयापचय में शामिल है जो एफ प्रकार एटीपी synthase, बैक्टीरिया में अपनी ε सबयूनिट से हिचकते जा सकता है. हम ε की निरोधात्मक सी टर्मिनल डोमेन के साथ उत्प्रेरक परिसर के संबंधों का अध्ययन करने के लिए जैव परत इंटरफेरोमेट्री ढाल लिया है.
Abstract
हम Escherichia कोलाई एटीपी synthase उत्प्रेरक जटिल साथ सबयूनिट ε की निरोधात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए जैव परत इंटरफेरोमेट्री के उपयोग का वर्णन. बैक्टीरियल एफ प्रकार एटीपी synthase दवा प्रतिरोधी तपेदिक से निपटने के लिए एक नया, एफडीए को मंजूरी दी एंटीबायोटिक का लक्ष्य है. सबयूनिट ε के सी टर्मिनल डोमेन से एटीपी synthase की समझ बैक्टीरिया विशेष ऑटो निषेध जीवाणुरोधी दवाओं की खोज के लिए एंजाइम लक्ष्य के लिए एक नया अर्थ दे सकती है. Ε के सी टर्मिनल डोमेन सक्रिय और निष्क्रिय राज्यों, और उत्प्रेरक साइट ligands के बीच एंजाइम संक्रमण प्रमुख है ε की रचना की जो प्रभावित कर सकते हैं जब एक नाटकीय गठनात्मक बदलाव आए. परोक्ष रूप से ε के बंधन / उत्प्रेरक जटिल साथ हदबंदी, और विदेश मंत्रालय की परख उपायों कैनेटीक्सउपायों जाहिरा तौर पर nondissociable निरोधात्मक रचना करने के लिए और से एंजाइम बाध्य ε की पारी. जैव परत इंटरफेरोमेट्री संकेत समाधान संरचना करने के लिए पीढ़ी संवेदनशील नहीं है, तो यह भी ε के गठनात्मक परिवर्तन पर उत्प्रेरक साइट ligands की allosteric प्रभाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, और सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) की तरह लेबल से मुक्त तरीकों ऑप्टिकल 1 बाध्यकारी और पृथक्करण की कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया है. अधिकांश लेबल से मुक्त तरीकों एक संवेदक सतह पर एक बायोमोलिक्यूल स्थिर करना और इसे immobilized बायोमोलिक्यूल 1 के साथ सहयोगियों के रूप में समाधान से एक बाध्यकारी साथी का पता लगाने के लिए एक ऑप्टिकल संकेत का उपयोग करें. एसपीआर एक बेहद संवेदनशील विधि है, यह कारण संवेदक 2 पर बह समाधान का अपवर्तनांक में परिवर्तन करने के लिए हस्तक्षेप की संभावना है. एसपीआर, जैव परत इंटरफेरोमेट्री (BLI) के रूप में संवेदनशील नहीं कम नमूना रचना 1,3 में परिवर्तन से प्रभावित होता है. BLI नोक पर एक मालिकाना biocompatible कोटिंग है कि फाइबर ऑप्टिक biosensors का उपयोग करता है. (octet-RED96) का यहां इस्तेमाल किया प्रणाली आठ स्पेक्ट्रो होता है. सफेद रोशनी एक रोबोट बांह पर कदम है कि जांच की एक पंक्ति को पहुंचाया जाता है. फाइबर ऑप्टिक सेंसर की गिरफ्तारीई जांच से उठाया और नमूने युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली में ले जाया गया. लक्ष्य अणुओं में से एक biosensor सतह पर स्थिर है. फिर सेंसर समाधान में बाध्यकारी साथी युक्त कुओं में ले जाया जाता है. BLI immobilized अणु के साथ बंधन साथी के सहयोग से नज़र रखता है, और फिर बाध्यकारी साथी के बिना समाधान के लिए सेंसर जाने के बाद हदबंदी नजर रखता है. Biosensor सतह अणुओं के बंधन एक आंतरिक सतह से और सेंसर और समाधान के बीच बाहरी इंटरफ़ेस से वापस स्पेक्ट्रो को प्रतिबिंबित कि प्रकाश तरंगों के बीच ऑप्टिकल हस्तक्षेप में परिवर्तन होता है. हस्तक्षेप में ये परिवर्तन और मात्रा निर्धारित चित्रा 1 के एनीमेशन में संक्षेप के रूप में, बंधन और पृथक्करण की गतिज दरों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम उत्प्रेरक बैक्टीरियल एटीपी synthase की जटिल और एंजाइम ऑटो बाधित कर सकते हैं जो अपनी ε सबयूनिट, के बीच बातचीत को मापने के लिए BLI आवेदन किया है. एटीपी एसवाईnthase संश्लेषण और एटीपी 4 की hydrolysis catalyzes कि एक झिल्ली एम्बेडेड रोटरी nanomotor है. उत्प्रेरक परिसर (एफ 1) एक ATPase के रूप में काम करता है कि एक घुलनशील रूप में अलग किया जा सकता है. सबयूनिट ε दो डोमेन है: एन टर्मिनल डोमेन (NTD) उचित विधानसभा और एंजाइम की कार्यात्मक युग्मन के लिए आवश्यक है, लेकिन उत्प्रेरक सब यूनिटों के साथ सीधे बातचीत नहीं करता; सी टर्मिनल डोमेन (CTD) के साथ बातचीत से एंजाइम को बाधित कर सकते हैं कई उत्प्रेरक सब यूनिटों 5,6. इस ε की मध्यस्थता विनियमन बैक्टीरियल एटीपी synthases के लिए विशिष्ट है और mitochondrial सजात में नहीं मनाया जाता है. दवा प्रतिरोधी तपेदिक 7 के इलाज के लिए bedaquiline की हाल ही में एफडीए अनुमोदन के रूप में दिखाया एटीपी synthase, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एक लक्ष्य के रूप में उभरा है. इस प्रकार, दवाओं की खोज के लिए ε की निरोधात्मक भूमिका को लक्षित mitochondrial एटीपी synthase को बाधित नहीं है कि antibacterials उपज सकती है. पृथक उत्प्रेरक परिसर (एफ 1), ε के साथएक अयुक्त सबयूनिट हो जाता है. हालांकि, एफ 1 के लिए बाध्य ε साथ, εCTD आंशिक रूप से एंजाइम की केंद्रीय गुहा में डालने और सीधे 6,8 अलग कर देना करने की संभावना नहीं है कि एक निरोधात्मक राज्य के गठन, एक नाटकीय गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं. हम उत्प्रेरक साइट ε की रचना पर ligands की allosteric प्रभाव की जांच करने के लिए परोक्ष रूप से एफ 1 / ε बाध्यकारी और पृथक्करण की कैनेटीक्स को मापने, और करने के लिए BLI का उपयोग करें.
हमारी प्रणाली में, ε (एसपीआर) की तरह BLI संकेत के बाद सेंसर की सतह पर स्थिरीकरण के लिए चुना गया था सतह पर बाध्यकारी अणु की जन के प्रति संवेदनशील है. ε सबयूनिट मुख्य एफ 1 जटिल (~ 347 केडीए) के लिए छोटे (~ 15 केडीए) रिश्तेदार है. इस प्रकार, एक बड़ा BLI संकेत immobilized ε एफ 1 के बंधन से परिणाम होगा. बहुत धीमी गति से किया जा सकता है एफ 1 हदबंदी की निगरानी करने के लिए, ε दृढ़ता से स्थिर हो जाना चाहिए. इस प्रकार हम biotinylate करने के लिए चुना; और streptavidin लेपित biosensors पर यह स्थिर करना. प्रोटीन सतह lysines 9 (i) यादृच्छिक संशोधन, एक बायोटिन maleimide अभिकर्मक 10 या (iii) आनुवंशिक रूप से enzymatically दौरान biotinylated है कि एक विशिष्ट बायोटिन स्वीकर्ता पेप्टाइड को जोड़ने के साथ एक अद्वितीय देशी या इंजीनियर सिस्टीन (ii) प्रतिक्रिया से biotinylated किया जा सकता है टैग प्रोटीन 11 के vivo अभिव्यक्ति में. हमारी प्रणाली में, ε विधि (तीन) 8 का उपयोग biotinylated है. बायोटिन टैग ε streptavidin सेंसर पर स्थिर हो जाने के बाद, BLI बाध्यकारी और सबयूनिट ε (एफ 1 (ε)) के समाप्त हो गया है कि एफ 1 की हदबंदी उपाय कर सकते हैं. यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, प्रारंभिक assays के सेंसर पर स्थिर biotinylated प्रोटीन की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था. इस प्रोटीन की आणविक वजन और अपनी बाध्यकारी साथी पर निर्भर करता है, भिन्न हो सकते हैं, लेकिन लक्ष्य immobilized प्रोटीन टी की एक न्यूनतम राशि निर्धारित करने के लिए हैटोपी प्रदान करता है (मैं) स्वीकार्य संकेत करने वाली शोर एक (कश्मीर डी नीचे) बाध्यकारी साथी की कम एकाग्रता और बाध्यकारी साथी के पास saturating एकाग्रता के साथ कैनेटीक्स बंधन (ii) न्यूनतम विरूपण के साथ कैनेटीक्स बाइंडिंग के लिए. इसके अलावा, biotinylation के stoichiometry एक सुसंगत BLI संकेत streptavidin लेपित पर स्थिरीकरण के दौरान प्राप्त किया जा सकता है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए अलग अलग है (लेकिन> 1 मोल बायोटिन / मोल प्रोटीन से बचने), तो कुछ प्रारंभिक परख biotinylated प्रोटीन के प्रत्येक नए बहुत कुछ के लिए आवश्यक हो सकता है हो सकता है सेंसर.
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Protocol
1. BLI परख के लिए साधन प्रोग्रामिंग
दीपक को गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए अग्रिम में साधन कम से कम एक घंटे पर मुड़ें, इस शोर को कम करने और प्रयोग के दौरान ऑप्टिकल संकेत में बहाव के लिए आवश्यक है. नमूना थाली धारक prewarm के लिए साधन टैब के माध्यम से वांछित तापमान सेट. फिर डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रयोगात्मक डिजाइन की स्थापना की. प्रयोग जादूगर टैब में "नई काइनेटिक्स प्रयोग" का चयन करें. यह परिभाषित किया जाना चाहिए कि सभी चरणों के साथ एक tabbed मेनू प्रस्तुत करता है.
1.1. प्लेट परिभाषा
96 अच्छी तरह से नमूना थाली पर इस्तेमाल किया जा स्तंभों को परिभाषित. बफर, immobilized प्रोटीन या बाध्यकारी साथी को रोकने के लिए कॉलम निरुपित. अच्छी तरह से प्रत्येक संघ के लिए इस्तेमाल किया जा साथी बंधन की एकाग्रता दर्ज करें. नोट: चित्रा 2 में दिखाया थाली परिभाषा अलग assays के लिए विकल्प है.
1.2. परख परिभाषा
ontent "> परख के लिए आवश्यक सभी कदम को परिभाषित. ये (मैं) आधारभूत (कई), (द्वितीय) लोड हो रहा है, (iii) एसोसिएशन और साथी बंधन (iv) हदबंदी में शामिल हैं. फिर, जैसा कि नीचे वर्णित, साथ व्यक्तिगत परख कदम लिंक संबंधित स्तंभ पर परख कदम और फिर डबल क्लिक का चयन करके नमूना प्लेट पर कुओं का कॉलम. इस कार्यक्रमों सेंसर परख के दौरान अगले करने के लिए कुओं के एक स्तंभ से स्थानांतरित करने के लिए.- आधार रेखा
96 अच्छी तरह से थाली में प्रारंभिक BLI संकेतों की स्थापना के लिए, परख बफर में सेंसर (चित्रा 2, स्तंभ 1) के साथ एक संक्षिप्त आधारभूत कदम (≥ 60 सेकंड) के साथ शुरू करो. - (सेंसर पर biotinylated प्रोटीन immobilizing) लोड हो रहा है
Biotinylated प्रोटीन (चित्रा 2, स्तंभ 2) में शामिल होंगे कि वेल्स को सेंसर निरुपित. बंधन के एक पूर्व निर्धारित स्तर (परिचय देखें) प्राप्त करने के लिए सीमा समारोह का प्रयोग करें. सभी सेंसर कदम होगा कि इतना दहलीज विकल्प सेट करेंसेंसर के किसी भी एक सीमा तक पहुँच जाता है जब वेल्स के अगले स्तंभ के लिए डी. - आधार रेखा
सेंसर से दूर nonimmobilized biotinylated प्रोटीन धोने और नई, स्थिर आधारभूत संकेतों की स्थापना के लिए, बफर में एक और आधारभूत कदम (आमतौर> 5 मिनट चित्रा 2, स्तंभ 3) शामिल हैं. केवल (चित्रा 3 के रूप में) बुनियादी बंधन / हदबंदी assays के लिए, एसोसिएशन कदम से पहले बफर के नए कुओं में सेंसर के साथ एक अतिरिक्त आधारभूत कदम (60 सेकंड) (चित्रा 2, स्तंभ 4) शामिल हैं. - (Immobilized प्रोटीन के लिए बाध्य साथी की) एसोसिएशन
(चित्रा 3 के रूप में) एक बुनियादी बंधन / हदबंदी परख के लिए, विभिन्न सेंसर / वेल्स के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए बाध्य साथी की सांद्रता की एक सीमा (चित्रा 2, स्तंभ 5) का चयन करें. बाध्यकारी साथी के कम से कम एक saturating एकाग्रता संकेत बंधन संतुलन दृष्टिकोण चाहिए कि इतनी कदम समय समायोजित करें. एक के लिए(चित्रा 5 में) के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन जटिल की हदबंदी पर छोटे ligands की allosteric प्रभाव का परीक्षण करने के लिए परख, सभी एसोसिएशन कुओं में उपयोग के लिए (10 गुना अनुमानित कश्मीर डी ऊपर ~) बाध्यकारी साथी की एक भी उच्च एकाग्रता का चयन करें. - (बाध्यकारी साथी की) हदबंदी
केवल (चित्रा 3 के रूप में) एक बुनियादी बंधन / हदबंदी परख के लिए, स्तंभ 4 (चित्रा 2), एसोसिएशन से पहले अतिरिक्त आधारभूत के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही बफर वेल्स को वापस करने के लिए सेंसर नामित. छोटे ligands की allosteric प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक परख के लिए, बजाय स्तंभ 6 अच्छी तरह से प्रत्येक बफर प्लस अलग allosteric ligands के हो सकते हैं, जहां चित्रा (2), को स्थानांतरित करने के लिए सेंसर नामित.
1.3. सेंसर असाइनमेंट
परख के लिए prewetted सेंसर शामिल होंगे कि सेंसर ट्रे में संकेत स्थानों. प्रयोग Fai जाएगा के बाद से किसी भी खाली पदों की पहचानएल कोई सेंसर उठाया रहे हैं.
1.4. समीक्षा प्रयोग
गलतियों के लिए जाँच करें और उन्हें दूर करने के लिए वापस जाने के लिए सब कुछ योजना के कदम कल्पना.
1.5. प्रयोग चलाने
डेटा फ़ाइलों के स्थान सहित आवश्यक विवरण दर्ज करें. प्रयोग के लिए वांछित तापमान दर्ज करें. सेंसर अभी भी prewetting की आवश्यकता है, प्रयोग शुरू करने में देरी करने के विकल्प का चयन करें. अंत में, एक बार सभी नमूना तैयार (चरण 2) पूरा हो गया है और नमूना थाली और सेंसर ट्रे दोनों साधन में लोड कर रहे हैं, परख चलाने के लिए जाओ बटन पर क्लिक करें.
2. नमूना तैयार
- एक उपयुक्त परख बफर तैयार करें. (8.0 पीएच को समायोजित करने के लिए जोड़ा) - ((एन morpholino) propanesulfonic एसिड 3), Tris (Tris (hydroxymethyl) एमिनो मीथेन), 50 मिमी KCl 20 मिमी MOPS: बफर आंकड़े 3 और 5 में दिखाया प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया. बीएसए (गोजातीय सीरम albumin, फैटी एसिड मुक्त, 0.5 शामिल करेंसभी परख चरणों के लिए और biotinylated प्रोटीन या सेंसर करने के लिए प्रोटीन की अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए बाध्य साथी के सभी dilutions के लिए बफर में) अंतिम मिलीग्राम मिलीग्राम /.
- (परिचय देखें) एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए परख बफर में biotinylated प्रोटीन (ε) पतला.
- परख बफर में बाध्यकारी साथी (एफ 1 (ε)) (उपयोग करने के लिए सांद्रता की श्रृंखला के लिए चर्चा देखें) के dilutions तैयार.
- उनकी सुरक्षा सुक्रोज कोटिंग दूर करने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए streptavidin लेपित सेंसर Prewet. सेंसर ट्रे से सेंसर युक्त रैक निकालें और ट्रे पर orienting पायदान में थाली के एक कोने रपट, ट्रे के तल में एक 96 अच्छी तरह से थाली डालें. सेंसर के स्तंभ में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, 96 अच्छी तरह से थाली के उस स्तंभ में अच्छी तरह से प्रति परख बफर के 200 μl जोड़ें. (स्लॉट्स में टैब के साथ) सही ओरिएंटेशन में ट्रे को सेंसर की रैक लौटें.
- चरण 1 में प्रोग्रामिंग के दौरान सौंपा के रूप में, ओ कुओं को भरनेचित्रा 2 के रूप परख बफर या उचित प्रोटीन dilutions के साथ एफ नमूना थाली,. वे ऑप्टिकल संकेत में शोर पैदा कर सकता है, के रूप में बुलबुले शुरू करने से बचें. (मैं) biotinylated प्रोटीन या (ii) बाध्यकारी साथी या तो छोड़ देते हैं कि एक या एक से अधिक संदर्भ कुओं को शामिल करें.
- साधन का दरवाजा खुला है और मंच के स्लॉट में डाला ट्रे के टैब के साथ, मंच (बाएं) पर सेंसर ट्रे डालें. थाली धारक (दाएं) में नमूना थाली डालें, थाली धारक पर संकेत के रूप में थाली, फ्लैट और सही ओरिएंटेशन में बैठा है कि सुनिश्चित करें. दरवाजा बंद करो और डाटा अधिग्रहण कार्यक्रम (1.5 कदम) से परख शुरू.
3. डेटा संसाधन
- परख चलने के बाद, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर को खोलने और डेटा युक्त फ़ोल्डर लोड. प्रत्येक संवेदक के साथ, (बाएं) एक कदम वार प्रसंस्करण मेनू और कच्चे गतिज डेटा को देखने के लिए "संसाधन" टैब पर क्लिक करें (मुख्यालय) एक अलग रंग सौंपा (देखेंचित्रा 3).
- "डाटा चुनाव" के तहत, "सेंसर चुनाव" बटन पर क्लिक करें. "नमूना थाली नक्शा" पर, संदर्भ कुओं के रूप में 1 या 2 नियंत्रण सेंसर (जी, चित्रा 3 की परख में एच) के लिए कुओं को नामित. प्रसंस्करण मेनू पर, "घटाना" बॉक्स की जाँच करें और हर दूसरे संवेदक के संकेत से संदर्भ संकेत (एकल या औसतन) घटाना "संदर्भ वेल्स" का चयन करें.
- "संरेखित वाई अक्ष" कदम का उपयोग करके = 0 वाई करने के लिए सभी निशान संरेखित करें. संरेखण कदम (इस एसोसिएशन कदम से पहले पिछले आधारभूत जा रहा है) के रूप में "आधारभूत" का चयन करें. "समय सीमा" के लिए, कि आधारभूत (चित्रा 3 में के रूप में एक 60 सेकंड आधारभूत के लिए यानी 50-60 सेकंड,) के अंतिम 10 सेकंड में प्रवेश.
- एसोसिएशन और हदबंदी कदम के बीच संकेत पारियों को कम करने के लिए "इंटर कदम सुधार" बॉक्स की जाँच करें. बेसलाइन या हदबंदी के लिए पंक्ति का चयन करें.
- ज्यादातर मामलों में Savitzky-Golay फ़िल्टरिंग समारोह का चयन करें और क्लिक करें "प्रक्रिया डाटा!" आगे बढ़ने के लिए. नेत्रहीन का निरीक्षणअंतिम संसाधित डेटा (निचले सही पैनल). संकेत निशान एसोसिएशन और हदबंदी कदम के बीच एक महत्वपूर्ण बदलाव दिखा अगर (4 चित्र में) के रूप में वैश्विक डेटा विश्लेषण के लिए करना assays के साथ,, "इंटर कदम सुधार" के लिए हदबंदी या आधारभूत के चयन को बदलने और डेटा के लिए आगे बढ़ने से पहले डेटा पुनर्संसाधन विश्लेषण.
4. डेटा विश्लेषण
शुरू करने के लिए डेटा विश्लेषण में "विश्लेषण" टैब पर क्लिक करें. नोट: उदाहरण के बंधन, कई / हदबंदी घटता की वैश्विक विश्लेषण के लिए (चित्रा 3 के रूप में) कर रहे हैं नीचे दिए गए चरणों.
- "विश्लेषण करने के लिए कदम 'के लिए, एसोसिएशन और पृथक्करण का चयन करें. "मॉडल" के लिए, 1:1 का चयन करें. नोट: अन्य सीमित विकल्प उपलब्ध हैं.
- "फिटिंग" के लिए, (पूर्ण) विश्व चुनें. "द्वारा समूह" के लिए (ग्राफ के अनुसार) रंग का चयन करें. (नि. अधिकतम की स्वतंत्र फिटिंग अनुमति देने के लिए "संवेदक द्वारा अनलिंक आर अधिकतम" का चयन सममूल्य के बंधन saturating पर अधिक से अधिक संकेत प्रतिक्रिया) immobilized प्रोटीन को tner. नोट: सेंसर immobilized प्रोटीन की मात्रा में थोड़ा भिन्न रूप में हम (चित्रा 3, देखें लोड), सबसे assays के लिए ऐसा करते हैं.
- पता चला मेज पर, विश्लेषण किया जा करने के लिए सभी सेंसर निशान एक ही रंग है, ताकि वे एक वैश्विक सेट के रूप में विश्लेषण किया जाएगा सुनिश्चित करें. यदि आवश्यक हो, एक या अधिक सेंसर वैश्विक फिटिंग से चूकना निशान चुनें: "शामिल करें" स्तंभ के तहत, इच्छित सेंसर स्थिति पर राइट क्लिक करें और "वेल्स को बाहर निकालें" का चयन करें.
- "फ़िट घटता!" क्लिक करें nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण शुरू करने के लिए. (4 चित्र में) के रूप में सेंसर डेटा निशान के साथ प्रतिगमन घटता (i) ओवरले, फिटिंग बच (ii) भूखंडों, और निर्धारित पैरामीटर मान (दर स्थिरांक, आर अधिकतम के साथ (iii) एक तालिका में शामिल हैं जो फिटिंग परिणामों की जांच, कश्मीर डी) और आँकड़ों के मापदंडों के लिए (मानक त्रुटियों, ची चुकता, आर 2).
- "डेटा निर्यात" के अंतर्गत, "तालिका निर्यात करने के लिए. सीएसवी फाइल" पर क्लिक करके ढाले परिणामों को बचाने के. ग्रैप लिएहींग या अन्य सॉफ्टवेयर के साथ डेटा / फिट घटता के आगे के विश्लेषण, एक पाठ फ़ाइल में प्रत्येक संवेदक के डेटा और फिट वक्र को बचाने के लिए "निर्यात फिटिंग परिणाम" पर क्लिक करें.
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Representative Results
रियल समय बाध्यकारी और पृथक्करण BLI कैनेटीक्स 3 चित्र में दिखाया गया. इस प्रयोग एसोसिएशन और हदबंदी में परख बफर के साथ किया गया था. सेंसर केवल संक्षिप्त prewet किया गया था के बाद से यह प्रयोग एक 10 मिनट आधारभूत कदम के साथ शुरू किया गया था. अगला, biotinylated ε सेंसर पर लोड किया गया था. Ε की कोई detectable हदबंदी कोई बाध्यकारी साथी गयी थी जो संदर्भ वक्र (जी) से देखा के रूप में सभी बचे हुए चरणों के दौरान हुई. एक दूसरा संदर्भ संवेदक (एच) immobilized प्रोटीन से रहित था और बाध्यकारी साथी की कम अविशिष्ट बंधन दिखाया. एफ 1 (ε) के विभिन्न सांद्रता विश्व स्तर पर परिणामों को फिट और कश्मीर एक, कश्मीर विकास, और कश्मीर विकास के लिए सबसे अच्छा मूल्य प्राप्त करने के क्रम में सेंसर वायुसेना के लिए एसोसिएशन चरण में इस्तेमाल किया गया. परिणाम चित्रा 4 में डेटा निशान (नीला) बेदखल प्रोटोकॉल के रूप में प्रोसेस किया गया. इस मामले में, संदर्भ सेंसर ट्रेस एच नमूना टीआर से घटाया गया थाबाध्यकारी साथी और सिस्टम संकेत बहाव की अविशिष्ट बाइंडिंग के लिए सही करने के लिए इक्के. डेटा विश्लेषण चरण में, सभी घटता एक 1:1 मॉडल (एकल कश्मीर एक एकल कश्मीर घ) के साथ विश्व स्तर पर फिट थे, "ग्लोबल (यूके)" फिट बाध्यकारी साथी का पूरा हदबंदी मानता है (संकेत अनंत पर शून्य करने के लिए वापस आ जाएगी समय) लाल (चित्रा 4,). ध्यान दें कि, एफ 1 (ε) के दो सबसे अधिक सांद्रता के लिए, वैश्विक, 1:1 मॉडल से डेटा की छोटी लेकिन महत्वपूर्ण विचलन कर रहे हैं. Immobilized ligand (biotinylated "ε" सबयूनिट) के निम्न स्तर का इस्तेमाल किया गया, और फिट मॉडल में एक जन परिवहन कारक (नहीं दिखाया गया है) सहित द्वारा सुधार नहीं किया गया था. हालांकि, एफ 1 (- "ε") एक बड़ी जटिल (~ 350 केडीए) है, और () नहीं दिखाया अन्य प्रयोगों इन विचलन immobilized ligand के एक अंश के कम बाध्यकारी पहुँच के कारण हैं कि सुझाव देते हैं, यानी एक एफ 1 के लिए बाध्य एक "ε" sterically एक और biotinylated के लिए उपयोग हो सकता है बाधाएक ही streptavidin टेट्रामर पर बाध्य "ε".
चित्रा 5 एंजाइम 1 मिमी एटीपी / EDTA की उपस्थिति में ε सेंसर से स्थिर करने के लिए बाध्य किया गया था जिसमें एक अलग प्रयोग से पता चलता है, यह सबसे एफ 1 / "ε" परिसरों आसानी 8 dissociates जो noninhibitory रचना, कल्पना करने के लिए predisposes. सेंसर तो अलग ligands के साथ परख बफर युक्त कुओं हदबंदी के लिए ले जाया गया. इस ε की रचना पर विभिन्न ligands के प्रभाव को दर्शाता है. उदाहरण के लिए, MgADP / पीआई के लिए जोखिम नाटकीय रूप से ε कसकर बाध्य, निरोधात्मक राज्य के लिए रचना स्थानांतरित कर दिया यह दर्शाता है कि नेट हदबंदी धीमा. विभिन्न ligands एफ 1 के अंश में अलग पारियों के कारण बाद परिसर हदबंदी कैनेटीक्स मनाया गया. सक्रिय (अयुक्त) या निरोधात्मक (nondissociable) रचना में ε साथ ε परिसरों. यह भी संभव है कि बाध्य प्रोटीन की पर्याप्त गठनात्मक परिवर्तन. BLI संकेत में परिवर्तन करने के लिए सीधे योगदान लेकिन, हमारे अध्ययन में, यह (शाह एट अल 8, चित्रा 5D देख बड़े एफ 1 जटिल के बंधन / हदबंदी के लिए संकेत की तुलना में नगण्य प्रतीत होता है, घटता 3 और 6 शो के लिए संक्रमण बहुत समान व्यवहार, उनकी शर्तों बाध्य एफ के विशिष्ट रचना एहसान हालांकि 1). डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस तरह के जटिल हदबंदी कैनेटीक्स के लिए तैयार नहीं था. इस प्रकार, हम अन्य सॉफ्टवेयर के साथ nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण के लिए पाठ फ़ाइलों को डेटा निर्यात किया.
चित्रा 1. जैव परत इंटरफेरोमेट्री के सिद्धांतों. एनिमेशन BLI द्वारा biomolecular बातचीत का पता लगाने के लिए अंतर्निहित भौतिक विज्ञान का सार. जांच के माध्यम से प्रकाश पासिंग सेंसर की आंतरिक सतह से और (द्वितीय) में बाहरी से वापस स्पेक्ट्रो (मैं) करने के लिए दिखाई देता हैनमूना समाधान के साथ सेंसर की terface. यह एक हस्तक्षेप पैटर्न में यह परिणाम है. सेंसर सतह अणुओं के बंधन हस्तक्षेप पैटर्न बदल जाता है. इस तरंग दैर्ध्य बनाम रिश्तेदार तीव्रता का एक नैनोमीटर पारी प्लॉट के रूप में किया जा सकता है. समय के साथ इस नैनोमीटर पारी निगरानी बाध्यकारी और हदबंदी कैनेटीक्स प्रदान करता है. ग्राफिक्स FortéBio 12 से अनुमति के साथ अनुकूलित कर रहे हैं.
चित्रा 2. 96 अच्छी तरह से नमूना थाली में नमूने के योजनाबद्ध व्यवस्था. सेंसर स्तंभ से स्तंभ के समानांतर में ले जाया जाएगा और बाईं या दाईं ओर एक विशेष परख प्रोटोकॉल के रूप में परिभाषित या तो ले जाया जा सकता है. लाल, नीले और हरे रंग के साथी और लिगा बंधन, immobilized प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि ग्रे रंग के साथ कुओं परख बफर का प्रतिनिधित्वक्रमशः एनडीएस,.
एक BLI परख से कच्चे डेटा दिखा चित्रा 3. स्क्रीन पर कब्जा. कार्यक्षेत्र लाल लाइनों प्रोटोकॉल की परख कदम के बीच सेंसर के आंदोलन से संकेत मिलता है. चरण प्रकार छवि पर चिह्नित हैं. बफर और नमूने के स्थान के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया. ग्राफ के शीर्ष के साथ संख्या से बताया गया है, streptavidin लेपित सेंसर ले जाया गया 123454: निम्न क्रम में नमूना थाली के विभिन्न स्तंभों के बीच. ग्राफ नीचे कथा प्रत्येक संवेदक के डेटा का पता लगाने के लिए रंग को इंगित करता है. लोड हो रहा चरण में, एच छोड़कर प्रत्येक संवेदक 50 एनएम biotinylated "ε" सबयूनिट साथ incubated था. 30 (: एसोसिएशन चरण में, सेंसर "ε" समाप्त एफ 1 एन एम सांद्रता के साथ incubated रहे थेए, एच), 20 (बी), 15 (सी), 10 (डी) 5 (ई), 2.5 (एफ), 0 एनएम (जी). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 की BLI परख से डेटा का विश्लेषण की चित्रा 4. स्क्रीन पर कब्जा. डेटा संसाधित और पाठ में वर्णित के रूप में लगाया गया था. केवल एसोसिएशन और हदबंदी कदम एक खड़ी लाल रेखा से विभाजित, दिखाए जाते हैं. संसाधित डेटा घटता नीला कर रहे हैं, nonlinear प्रतिगमन लाल रंग में दिखाया गया हैं 01:01 वैश्विक विश्लेषण से फिट बैठता है. ग्लोबल फिटिंग परिणाम 8: कश्मीर एक = 2 x 10 5 एम -1 एस -1 (0.1% ±), कश्मीर डी = 4.8 x 10 -5 एस -1 कश्मीर डी = 0.24 एनएम उपज ("±" 0.1%),. फिट की भलाई: A= 0.999054 2. अधिक से अधिक बाध्यकारी पैरामीटर (नि. अधिकतम) मतलब मूल्य = 0.813 एनएम ("±" .0803) के साथ, प्रत्येक संवेदक के लिए अलग से फिट था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. Ε की रचना पर ligands की allosteric प्रभाव दिखा एक BLI परख से परिणाम. एफ 1 (ε) 1 मिमी एटीपी / EDTA की उपस्थिति में ε सेंसर से स्थिर करने के लिए बाध्य किया गया था. एसोसिएशन चरण और पृथक्करण चरण के एक हिस्से का अंत दिखाया गया है. हदबंदी चरण के दौरान, (प्रत्येक का पता लगाने के लिए सूचीबद्ध) एफ 1 उत्प्रेरक साइटों के लिए अलग ligands एफ 1 की हदबंदी पर उनके allosteric प्रभाव का पालन करने के लिए शामिल किया गया
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Discussion
BLI के लिए वर्तमान में उपलब्ध उपकरणों biomolecular बातचीत के लिए assays में महत्वपूर्ण throughput और लचीलेपन की अनुमति. विभिन्न समाधान नमूने एक काला microtiter प्लेट के कुओं में तिरस्कृत कर रहे हैं, और समानांतर BLI सेंसर का एक सेट प्लेट पर कुओं के स्तंभों के बीच आगे और पीछे ले जाने के लिए प्रोग्राम कर रहे हैं. नमूने परख भर कक्षीय झटकों से हड़कंप मच गया. यहां इस्तेमाल किया प्रणाली 8 सेंसर है और एक 96 अच्छी तरह से नमूना प्लेट का उपयोग करता है, लेकिन एक और प्रणाली 16 सेंसर और एक 384 अच्छी तरह से नमूना प्लेट का उपयोग करता है. इस प्रकार, एक सेंसर immobilized बायोमोलिक्यूल और समाधान में अपनी बाध्यकारी साथी के बीच बातचीत समानांतर में कई सेंसर के साथ अलग अलग परिस्थितियों में परीक्षण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, immobilized निरोधात्मक ε सबयूनिट साथ यहाँ प्रस्तुत प्रथम परख में, बातचीत समानांतर में एंजाइम (बाध्यकारी साथी) के छह अलग सांद्रता के साथ मापा (आंकड़े 3 और 4) थे. यह एक वैश्विक विश्लेषण determi करने की अनुमति दीपूर्वोत्तर के लिए दर स्थिरांक की एक जोड़ी (एक, कश्मीर डी कश्मीर) शुद्ध बाध्यकारी और पृथक्करण, और इस तरह एक संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (कश्मीर डी = कश्मीर डी / कश्मीर एक), जो निरोधात्मक निरंतर साथ मिलकर इस बात से सहमत (कश्मीर मैं) से निर्धारित ε 8 से एंजाइम अवरोध का समाधान assays. प्रयोग की एक दूसरी प्रकार (चित्रा 5) BLI भी दो प्रोटीन के बीच बातचीत पर छोटे ligands की allosteric प्रभाव की निगरानी कर सकते दिखा दिया कि, विभिन्न ligands के प्रभाव समानांतर में तुलना की गई. BLI संकेत बाध्यकारी अणु की बड़े पैमाने पर निर्भर करता है, और सीधे अनुकूलित स्थितियों 13 के तहत छोटे यौगिकों के बंधन पता लगा सकता है के बाद से allosteric ligands के प्रभाव का पता लगाने के लिए सीमाएं हैं. हालांकि, चित्रा 5 की परख में, बंधन साथी, एफ 1, एक बड़े प्रोटीन जटिल (~ 347 केडीए) था, इसलिए इसकी बाइंडिंग / हदबंदी के लिए BLI संकेत काफी विज्ञापन से प्रभावित नहीं थापारंपरिक एफ 1 जटिल करने के लिए इस तरह के एटीपी (~ 500 दा) के रूप में छोटे ligands के बंधन. यह इन ligands निरोधात्मक CTD 8 कमी ε का एक छोटा फार्म करने के लिए बाध्य एफ 1 के लिए BLI संकेत को प्रभावित नहीं किया है जिसमें assays के साथ तय हुई थी. इस प्रकार, allosteric प्रभाव के assays बातचीत प्रोटीन की जनता को allosteric ligand रिश्तेदार की बड़े पैमाने पर विचार करना चाहिए, और बेहतर ligand के बंधन को प्रत्यक्ष BLI प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण करने के लिए नियंत्रण शामिल हैं.
प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कुछ कदम और संशोधनों के बेहतर परिणाम और अधिक सटीक विश्लेषण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है ध्यान दें. उदाहरण के लिए, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में, बंधन और पृथक्करण दर स्थिरांक की वैश्विक विश्लेषण के लिए इरादा एक परख एक नया स्तंभ में एक अतिरिक्त आधारभूत कदम (कदम 1.2.3 देखें) शामिल होना चाहिए (1.2.3, 1.2.5 कदम देखें) एसोसिएशन कदम है, और सेंसर R होना चाहिए बफर कुओं की (चित्रा 2, स्तंभ 4) से पहलेहदबंदी कदम के लिए बफर कुओं की कि उसी स्तंभ (कदम 1.2.5 देखें) eturned. एसोसिएशन कदम पहले और बाद में (एक ही ऑप्टिकल गुणों के साथ) एक ही कुएं में प्रत्येक संवेदक के बाद एसोसिएशन / पृथक्करण चरणों के लिए अंतर - कदम सुधार (3.4 कदम) में सुधार, और इस रूप में (एकाधिक डेटा निशान के वैश्विक गतिज फिटिंग की सुविधा कर सकते हैं चित्रा 4). इसके अलावा, यहां दिखाया गया है और अधिक से अधिक प्रारंभिक रहे हैं कि assays के लिए, प्रोग्राम (यह सक्रिय कदम है जबकि) को छोटा या परख के दौरान किसी भी कदम का समय देने के लिए एक विकल्प है. अधिक समय हदबंदी दर के लिए एक अच्छी फिट प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हदबंदी की अनुमति की जरूरत है अगर इष्टतम लदान संकेत पहले से ही जाना जाता है, या नहीं है, तो यह, उदाहरण के लिए, उपयोगी है.
सेंसर सतह के लिए बाध्य साथी के बंधन nonspecific ऐसे एसपीआर और BLI के रूप में लेबल से मुक्त तरीकों के लिए एक समस्या हो सकती है. हमारे assays में, यह प्रभावी परख बफर में बीएसए सहित द्वारा कम से कम किया गया था. Immunoblot में के रूप मेंting बीएसए के अलावा अन्य प्रोटीन इस्तेमाल किया जा सकता प्रोटोकॉल, और डिटर्जेंट की कम मात्रा भी कम कर सकते हैं अविशिष्ट (Tween20 आपूर्तिकर्ता से कैनेटीक्स बफर में प्रयोग किया जाता है) बाध्यकारी. बंधन अवशिष्ट अविशिष्ट के घटाव (और उसके क्षय दौरान, यहां तक कि कम से कम अविशिष्ट बंधन के साथ, सबसे assays immobilized प्रोटीन के बिना, लेकिन एसोसिएशन चरण में बाध्यकारी साथी के सर्वोच्च एकाग्रता (चित्रा 3, सेंसर एच देखें) के साथ कम से कम एक नियंत्रण सेंसर शामिल होना चाहिए हदबंदी कदम) काफी गतिज विशिष्ट बंधनकारी / हदबंदी का अध्ययन किया जा रहा है विश्लेषण के लिए सुधार कर सकते हैं. दूसरी ओर, एक बार प्रारंभिक assays biotinylated प्रोटीन (चित्रा 3, सेंसर जी देखें) stably लोड कदम के बाद बाध्य बनी हुई है कि इस बात की पुष्टि, कि नियंत्रण छोड़ा जा सकता है और कहा कि सेंसर एक नमूना हालत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
BLI का उपयोग संघ और पृथक्करण दर स्थिरांक, बी के कई सांद्रता के मजबूत दृढ़ संकल्प के लिएकर्मचारियों INDING साथी इस्तेमाल किया जाना चाहिए और यदि संभव हो तो सभी डेटा निशान, वैश्विक विश्लेषण से फिट होना चाहिए (3 आंकड़े और के रूप में 4). आदर्श रूप में, सांद्रता की रेंज ~ 10 गुना ऊपर और अनुमानित कश्मीर डी नीचे अवधि चाहिए. हमारे मामले में, एक उच्च आत्मीयता बातचीत (कश्मीर डी = 0.25 एनएम) के साथ, संकेत करने वाली शोर उप कश्मीर डी सांद्रता के साथ कैनेटीक्स बाइंडिंग के लिए गरीब था. इस प्रकार, कश्मीर घ ऊपर साथी बंधन की सांद्रता (चित्रा 3 देखें) मनाया दरों और बाध्यकारी के स्तर में महत्वपूर्ण बदलाव प्राप्त किया गया है कि इस तरह इस्तेमाल किया गया. इसके अलावा, एक लंबे हदबंदी कदम धीमी हदबंदी दर फिटिंग में आत्मविश्वास में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. उच्च संबंध में बातचीत के साथ, यह BLI assays बल्कि एसपीआर के लिए के रूप में संवेदक पर जारी रखा प्रवाह, की तुलना में एक उभारा नमूने में किया जाता है के बाद से धीमी हदबंदी, हदबंदी कदम दौरान rebinding से अतिशयोक्तिपूर्ण है कि यह भी संभव है. इस संभावित विरूपण साक्ष्य के रूप में के साथ परीक्षण किया जा सकता हैहदबंदी बफर अलग बाध्यकारी साथी बांध और सेंसर immobilized प्रोटीन से 14 rebinding से रोकता है कि अतिरिक्त प्रतिस्पर्धी प्रोटीन का एक 'सिंक' होता है, जिसमें कहते हैं. हमारी प्रणाली में, यह अच्छी तरह से हदबंदी में साथ और nonbiotinylated (कश्मीर डी ऊपर> 10 गुना) के बिना परिणाम की तुलना द्वारा किया, और हम उस rebinding एक महत्वपूर्ण समस्या 8 नहीं था पुष्टि की गई. गतिज परिणामों के सेट वैश्विक विश्लेषण (उपलब्ध 1:1 या 2:01 मॉडल) द्वारा अच्छी तरह से फिट नहीं हैं, तो अंत में, समस्या निवारण के लिए अन्य विश्लेषण विकल्प हैं. उदाहरण के लिए, बजाय (4.2 कदम में) "(पूर्ण) विश्व" को चुनने का, "स्थानीय" स्वतंत्र रूप से एक सेंसर का पता लगाने के लिए फिट करने के लिए चुना जा सकता है. बाध्यकारी दूसरे क्रम, आंतरिक बंधन दर के बराबर ढलान के साथ भागीदार एक रेखीय निर्भरता दिखाना चाहिए बंधन की सांद्रता बनाम मनाया बंधन दर (कश्मीर OBS) की साजिश रचने के एक सरल 1:01 मॉडल, अनुसरण नहीं करता है. सॉफ्टवेयर का विश्लेषण टैब एक "XY हैइस संबंध में त्वरित दृश्य की अनुमति देता है कि ग्राफ "खिड़की.
हम प्रयोग किया जाता है कि साधन की एक सीमा उपलब्ध तापमान रेंज है. 40 डिग्री सेल्सियस परिवेश के तापमान से 2 डिग्री सेल्सियस की दूरी के साथ, कि रेंज में स्थिर रहे हैं कि केवल अणुओं का उपयोग किया जा सकता है. इसके अलावा, thermodynamic विश्लेषण संकीर्ण तापमान रेंज द्वारा सीमित है. एक और सामान्य सीमा अधिकतम परख समय ~ 4 घंटा है कि है, इस के बाद, कलाकृतियों खुला microtiter प्लेट से नमूने के वाष्पीकरण की वजह से विकसित करना.
BLI एसपीआर की तुलना में एक अपेक्षाकृत सरल व्यवस्था शामिल है. सेंसर बल्कि संवेदक पर नमूना के एक निरंतर प्रवाह से, तय मात्रा के साथ कुओं के स्तंभों के बीच ले जाया जाता है. एसपीआर के रूप में प्रति संवेदनशील नहीं है, BLI कम होने के कारण नमूना संरचना में परिवर्तन करने के लिए अपवर्तक सूचकांक में परिवर्तन से प्रभावित है. कुल मिलाकर, परख की स्थिति के बीच स्थानांतरण में इस्तेमाल करते हैं और साधन के लचीलेपन के इस रिश्तेदार आसानी के साथ, BLI प्रदानSA biomolecular बातचीत की इन विट्रो assays के लिए बहुमुखी उपकरण.
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Disclosures
लेखकों वे ब्याज की कोई संघर्ष है कि घोषणा.
Acknowledgments
हम चित्रा 1 में इस्तेमाल किया ग्राफिक्स प्रदान करने के लिए FortéBio धन्यवाद. इस काम TMD के लिए NIH अनुदान GM083088 द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
References
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