Summary
Этот протокол описан способ извлечения малые РНК из сыворотки крови человека. Мы использовали этот метод, чтобы изолировать микроРНК от рака сыворотки для использования в массивах ДНК, а также однокомпонентных количественной ПЦР. Протокол использует фенола и гуанидиния тиоцианат реагенты с изменениями, и получают высокое качество РНК.
Abstract
Анализ РНК и ее выражения является общей чертой во многих лабораториях. Важное значение имеет появление малых РНК, как микроРНК, которые находятся в клетках млекопитающих. Эти малые РНК являются мощными регуляторами ген, контролирующий жизненные пути, такие как рост, развитие и смерть и большим интересом была направлена на их выражения в жидкостях организма. Это связано с их регуляции в человеческих заболеваний, таких как рак и их потенциального применения в качестве сыворотки биомаркеров. Тем не менее, анализ микроРНК выражения в сыворотке может быть проблематичным. В большинстве случаев количество сыворотки ограничения и сыворотка содержит небольшое количество общей РНК, из которых малые РНК составляют лишь 0,4-0,5% 1. Таким образом, изоляция достаточного количества качественного РНК из сыворотки является основной проблемой для исследователей сегодня. В этом техническом документе, мы демонстрируем метод, который использует только 400 мкл сыворотки крови человека, чтобы получить достаточную РНК или для массивов ДНК или анализа КПЦР.dvantages этого метода являются его простота и способность приносить высокое качество РНК. Она не требует специализированных колонки для очистки малых РНК и использует общие реагенты и оборудование, найденные в общих лабораториях. Наша методика использует блокировки гель фазу для устранения загрязнения фенола в то же время получают высокое качество РНК. Мы также ввести дополнительный шаг для дальнейшего удаления все загрязнения во время стадии выделения. Этот протокол является очень эффективным при выделении выходы общей РНК до 100 нг / мкл из сыворотки, но также могут быть адаптированы для других биологических тканей.
Introduction
В последние годы наблюдается растущий нажим для того чтобы обнаружить новые биомаркеры для раннего выявления заболеваний человека. Большое внимание было сосредоточено на использовании малых РНК, такие как микроРНК 2 (микроРНК или Мирс) в качестве потенциальных маркеров. Эти малые РНК находятся в жидкостях организма, таких как сыворотка и исследования показали, что они устойчивы к деградации и стабильны в широком диапазоне различных условий окружающей среды 3. Учитывая эти особенности, сыворотки или циркулирующие микроРНК являются идеальным биомаркеров 4, 5. В настоящее время существует два основных подхода к выделению малых РНК из биологических жидкостей. Первый подход использует технологию столбца на основе связывать и вымывания малые РНК 6, в то время как второй подход использует давние протокол с фенолом и гуанидиния тиоцианатных реагентов 7. Мы разработали простой и эффективный, колонка без протокола, чтобы изолировать малые РНК из сыворотки крови человека. Выделенный РНК немедленноленно использовать в последующих применений, в том числе олигонуклеотидных ДНК массивов и РНК последовательности.
Этот протокол был разработан, потому что мы столкнулись с несколькими вопросами при использовании на основе фенола методы, чтобы изолировать РНК из сыворотки. Традиционный подход Chomczynski часто используется в большинстве лабораторий с диапазоном реагентов, доступных на большинстве коммерческих поставщиков. Однако, учитывая их широкое применение, строгие правила не были разработаны, чтобы постоянно производить высококачественный РНК из жидкостей организма, в частности, крови или сыворотке.
Общие проблемы, связанные с выделения РНК из сыворотки включают низкие урожаи РНК и загрязнения с реагентов, используемых в процессе выделения, в частности фенола. Наш подход устраняет эти фенольные загрязнений обеспечить высокое качество РНК для последующей анализа, таких как количественной ПЦР (КПЦР) и РНК последовательности. Далее мы тестировалась РНК на массивах микроРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: образцы сыворотки крови человека от здоровых пациентов или пациентов с раком были получены с информированного согласия при утвержденных этических протоколов человека от Королевского больница Принца Альфреда Сиднее (протокол номер X10-0016 и HREC/10/RPAH/24) и Технологическом университете, Сидней. Образцы сыворотки были получены от пациентов до операции из различных больницах Сидней и помещают на хранение при -80 ° С.
1. Малый Выделение РНК из сыворотки
Общую РНК получают из сыворотки крови человека с использованием модифицированной версии протокола LS Tri-Реагент RT.
- Размораживайте образец сыворотки на льду, а затем передать 400 мкл свежей талой сыворотки в меченым микроцентрифужных трубки.
- Развести сыворотку со 100 мкл РНКазы свободной H 2 O и добавить протеиназы К в концентрации 1 мг / мл.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин, чтобы позволить белка пищеварение протеиназой К.
- То обеспечить полное растворение, добавить 1,5-кратном объеме Tri-реагента РТ LS и 100 мкл 4-броманизола.
- Кратко инвертировать гомогената, выполнять повторяющиеся пипетирование в течение 5 сек и передачи в меченым 2 мл Тяжелая Фаза блокировки трубки.
- Спин гомогената при 12000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
- Тщательно слейте по крайней мере 1 мл полученного водного раствора в свежий ДНК LoBind трубки. Органический и межфазного следует ловушке под белым гелем трубки фазовой автоподстройки.
- Добавить 5,0 мкл гликогена (5 мг / мл) и 500 мкл 100% изопропанола в водном растворе, смешивают путем инверсии, и инкубировать O / N при -20 ° С.
- После O / N инкубации, центрифуги образец течение 20 мин при 12000 х г в 4 ° C центрифуге.
- Откажитесь от прозрачного супернатанта и выполнить "Flash" спина в течение 2 мин при 16000 × г в 4 ° C центрифуге.
- Осторожно снимите четкое зольution окружающих гранул с помощью пипетки.
- Промыть гранулу с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин. Слейте промывочного раствора и повторите мыть шаг.
2. РНК Ресуспендирование в раствор
- Ресуспендируют гранул в 10 мкл РНКазы свободной H 2 O, обеспечение осадок полностью не растворится. Чтобы гарантировать, что РНК полной солюбилизации образца может быть нагрета до 55 ° С в течение 5 мин. В течение этого времени смешивания образца с повторным пипетки. Для более высокой общим выходом РНК, бассейн два РНК препараты из того же пациента.
- Количественной оценки РНК ресуспендировали с помощью UV-VIS спектрофотометр и оценки качества РНК с использованием 2100 Bioanalyzer. Храните объединенных образцов РНК при -80 ° С для использования в последующих применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 представляет собой типичный UV / VIS спектр РНК, выделенной из сыворотки. Из этого профиля уже отмечалось загрязнения белка при 280 нм с фенолом и органических загрязнений и при 270 нм и 230 нм, соответственно. Остаток гуанидиния Тиоцианат Было также отмечено, при 260 нм. Для уменьшения загрязнений, ряд шагов по оптимизации были сделаны в стандартный Tri-реагента процедуры RT-LS. Мы добавили 5 мг / мл гликогена, чтобы увеличить как общий выход РНК и уменьшить загрязнение (черные линии, рисунок 1А).
Далее мы обнаружили, что после удаления изопропанола было примерно 100-300 мкл промывочного буфера, окружающего РНК гранул. Дополнительным спин центрифуги был добавлен в протоколе и мыть остаток раствор тщательно удалены. Это привело к профилю перехода от 270 нм до 280 нм (красный трассировки Рисунок 1В). Мы вывели, что это "флэш" спин сократили загрязнение фенолпри 270 нм и пришел к выводу, что пик 280 нм, скорее всего, представлены загрязнения белка.
Для дальнейшего повышения урожайности РНК и снизить белка перенос через мы добавили шаг фазовой автоподстройки гель. Этот шаг позволил полной передачи в водной фазе без органических загрязнений (рис. 1b). Как сыворотка содержит большое обилие белка, мы оценили, если разбавления первоначального объема сыворотки будет иметь никакого значения (рис. 1в). В общем объеме экстракта 500 мкл, мы смешали 400 и 250 мкл сыворотки с немецкой шкале 2 O. Чем больше доходность объем почти в два раза количество общей РНК когда по сравнению с использованием 250 мкл сыворотки. Был также снижение загрязняющих веществ при уменьшении исходного объема (Примечание: Как только переменная в этом шаге оптимизации был объем сыворотки, пик 230 нм напрямую связано с объемами сыворотки и не является артефактом из Tri-реагента изоляции) . Небольшой содержание РНК из этих препаратов, то оценивали с помощью Bioanalyzer в сочетании с малых РНК Kit. От следа Bioanalyzer, есть отчетливый пик примерно в 20 НТС, который представляет собой микроРНК населения (рис. 2A). Используя этот протокол, эта микроРНК компонент представлен 93% от общей популяции небольшой РНК. Это высокий уровень чистоты и общей РНК теперь могут быть использованы для различных молекулярных анализов, таких как массивы и КПЦР реакции. Резюме рабочего процесса представлена на рисунке 2B.
Затем мы измеряли экспрессию микроРНК в четырех различных биологических образцов с использованием либо массив олигонуклеотидную или КПЦР. 3А представляет собой микроРНК тепловую карту этих четырех образцов. Как и в нашем предыдущем исследовании, иерархическая кластеризация был использован для анализа данных выражений и образцы группы в зависимости от их профиля экспрессии микроРНК 8. КоличественныйПЦР (КПЦР) был также использован для оценки уровня микроРНК в этих препаратах. Используя те же четыре образца, мы провели однокомпонентных реакции TaqMan КПЦР для обнаружения микроРНК-21-5P, микроРНК-486-5P, микроРНК-15b-5P, микроРНК-16-5P и пусть-7а. Как показано на амплификации участков (Цифры 3B и 3C) все микроРНК были успешно обнаружены.
Рисунок 1. Спектрофотометрический профиль РНК из сыворотки крови человека. А. Типичный УФ профиль РНК, выделенной из сыворотки крови человека (синяя линия). Различные этапы оптимизации были испытаны для уменьшения загрязнения и увеличить общий выход РНК. B. сравнение использование блокировки гель фазы в нормальном изоляции. C. профиль двух измерений с различных начальных объемов сыворотки. Увеличение громкости ч объявление заметное влияние на урожайность РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. А. Представитель Bioanalyzer след, показывающий один шип примерно в 21 нуклеотидов (ось х). Этот выброс представляет собой долю микроРНК в небольшой популяции РНК из сыворотки. Б. Основная рабочего процесса, чтобы изолировать общей РНК из сыворотки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
hres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Эти микроРНК изолированных с помощью этого метода были использованы для профилирования массива и анализа КПЦР. A. Три рака головы и шеи и один нормальный сыворотки были выделены для тотальной РНК (в том числе микроРНК) и подвергали массива профилирования с использованием X 60K микроРНК чип 8. Это было повторено в технических повторах. После исходные данные Контроль качества (КК) обработки, выражение этих микроРНК были проанализированы с использованием иерархической кластеризации (HCL) и представлены в виде тепловой карты. Красный цвет означает до регулирования, а синий вниз регулирование микроРНК. Кривые усиления Б. представитель КПЦР для обнаружения микроРНК-21, микроРНК-486, Мир-15, Мир-16 и пусть-7а в четырех сывороток человека. С. Все пять микроРНК были обнаружены и сырые значения Ct затем были построены для нормальной сыворотке. Эта модель была подобна обнаружения для других трех образцов (данные не показаны)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Популяция микроРНК составляет примерно 0,4-0,5% от общей РНК, найденного в сыворотке крови. Кроме того есть также высокое содержание белка, обнаруженного в сыворотке крови человека. Для улучшения РНК и снизить как белок и фенола загрязняет мы изменили традиционный подход Chomczynski 9 с добавлением нескольких шагов.
Общую РНК выделяли из сыворотки с использованием стандартного Tri-реагентов RT-LS (Molecular Research Centre), однако, когда выполняется в нашей лаборатории, этот метод дает РНК в небольших количествах с различных загрязнений.
На рисунке 1 показана УФ спектрофотометрического РНК профиль с признаками загрязнения белка при 280 нм, загрязнения фенола при 270 нм и других органических загрязнений при 230 нм. Реагент, гуанидин тиоцианат, также был обнаружен при 260 нм.
Для решения проблемы низкой урожайности РНК в сыворотке крови и уменьшить загрязнение, серию optimizatионные шаги были добавлены к стандартному Tri-реагента процедуры RT-LS. Во-первых, мы обнаружили, что разбавление сыворотки 1 в 5 сниженной загрязнения белка. Этот шаг был в других исследованиях 10 рекомендуется и было показано для снижения загрязнения белка. Кроме того, мы использовали 1 концентрацию мг / мл протеиназы К. Мы протестировали диапазон концентраций от 100, 500 и 1000 мкг. Там не было разницы между концентрациями таким образом мы использовали более высокие концентрации и более короткие периоды инкубации.
Вторая модификация была ввести использование 2,0 мл фазовой автоподстройки труб. Тяжелая фазовой автоподстройки гель поглощает большинство примесей, таких как фенол и белков в органической фазе. Это обеспечивает плотность барьер для максимальной передачи водной фазы без риска контаминации. Применение блокировки гель фазы в виде водного / органического фазы барьерного материала может уменьшить время обработки и дальнейшего улучшения RECOV ДНКEry на целых 30%, в то же время устраняя пользователя от воздействия вредных летучих органических веществ 11. Третья модификация привела к значительному улучшению качества РНК. Введение "Flash" спина центрифугирования при 12000 х г играет важную роль в удалении любого остаточного загрязнения с РНК гранул до этанол стирок.
При сравнении нашего подхода к других опубликованных методик 6, 12, 13, мы ввели использование блокировки гель фазы, чтобы максимизировать восстановление малых некодирующих РНК из водной фазы. Одним из ограничений нашего протокола и других в том, что повторных изоляция могут быть необходимы для получения достаточно РНК для анализа экспрессии. Из нашего опыта, мы предпочитаем, основанные Trizol методы более комплектов колонок на основе и многочисленных исследований сравнили достоинства обеих систем 6, 14-16. Из частности интересбыло недавнее исследование, которое к выводу, что микроРНК с низким содержанием GC, такие как микроРНК-141, микроРНК-29b, Мир-21, Мир-106b, микроРНК-15а, и микроРНК-34а, избирательно потеряны во время подготовки образца с помощью метода тризола 17. Эта проблема была решена путем добавления магния в процессе выделения образца.
Таким образом, наш протокол использует традиционные методы, чтобы изолировать малые РНК из сыворотки. Эти сыворотки микроРНК могут быть получены из микрочастиц, экзосом или умирающих клеток. Этот протокол будет изолировать все эти микроРНК для получения высокого качества РНК, которая может использоваться для различных применений молекулярных ниже по течению. Этот метод извлечения довольно проста, основана на общих аппаратных средств можно найти в большинстве лабораторий, и достаточно прост для большинства новичков, заинтересованных в измерении микроРНК выражение в сыворотке крови человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Саманта Хури и Памела Ajuyah поддерживаются Австралийской последипломного премии. Мы также хотели бы выразить признательность за трансляционных исследований рака Сеть, Лоуи исследования рака центр, Университет Нового Южного Уэльса и исследования рака Unit Северная Поступательное для их дополнительной поддержки Саманта Хури.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
