Abstract
I meccanismi che regolano l'efficacia della selezione timica restano mal definiti. Il metodo qui presentato permette in vivo analisi dello sviluppo e selezione di cellule T specifiche per sé e antigeni estranei. L'approccio prevede l'impianto di innesti timici derivate da diversi topi anziani in riceventi SCID immunodeficienti. Nel corso di un periodo relativamente breve di tempo i destinatari sono completamente ricostituiti con cellule T derivate dal trapianto del timo impiantata. Solo timociti semina timo al momento della selezione subiscono isolamento e svilupparsi in cellule T mature. Come tali, i cambiamenti nella natura e la specificità delle cellule T trapiantate in funzione di eventi timici dipendenti dall'età possono essere valutate. Anche se è richiesta competenza tecnica per il trapianto timica successo, questo metodo fornisce una strategia unica di studiare in vivo una vasta gamma di patologie che sono causa o il risultato di aberrant funzione e / o homeostas timicoè.
Introduction
Il timo è un organo in cui gli eventi critici nello sviluppo delle cellule T si verificano 1. Timociti residente sul riarrangiamento del recettore delle cellule T (TCR) α e β geni, subiscono una serie di interazioni con lymphostromal e cellule presentanti l'antigene (APC) nelle regioni corticali e midollari del timo 2. Thymic selezione positiva è mediata da cellule epiteliali corticali timici (TEC) per produrre timociti che riconoscono peptidi antigenici nell'ambito dell'ospite classe complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) I e II molecole 2-3. Successivamente timica selezione negativa comporta spurgo dei timociti autoreattivi, guidato da un'interazione con TEC midollare o cellule dendritiche (DC) che presentano peptidi derivati da auto-proteine legate da MHC di classe I e II molecole 3. Il risultato finale di questi processi è la creazione di un pool di cellule mature CD4 + e CD8 + T in grado di rispondere ad un ampio spettrodi antigeni estranei mentre esibendo reattività minima auto-proteine 4.
L'efficienza di eventi di selezione timici è influenzata da una serie di fattori, tra cui la maturazione timica, frequenza midollare e TEC corticale, composizione sottoinsieme di timico DC, e la fonte di precursori timici 3. In particolare, la selezione del timo aberranti può provocare autoimmuni 5 o immunodeficienza patologie che derivano da alterazioni selezione negativa o positiva, rispettivamente. Gli eventi molecolari che regolano la selezione del timo, tuttavia, sono poco conosciuti. In vitro approcci come reaggregate colture d'organo del timo (RTOC) 6, hanno dimostrato di essere utile per analizzare gli eventi di base associate con la selezione del timo, ma non riescono a riassumere pienamente le dinamiche del corso negli eventi vivo. Di conseguenza, questo approccio basato trapianto-timico è stato stabilito a migliori eventi di selezione thymocyte studio in vivo 7
Questo protocollo descrive trapianto thymi da topi donatori neonati e per adulti in immunodeficienti topi riceventi SCID. Questa tecnica permette lo studio dei meccanismi che regolano la selezione timica positiva e negativa, nonché uscita timica di vari sottogruppi di cellule T durante l'ontogenesi. Recentemente, questo approccio è stato utilizzato per dimostrare che l'efficienza della selezione timica è limitato subito dopo la nascita in topi con conseguente aumento sviluppo di cellule T autoreattive e una ridotta repertorio cellule T specifiche per antigeni estranei 7.
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Protocol
Gli studi murini sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della University of North Carolina a Chapel Hill e tutte le cure degli animali era in conformità con le linee guida IACUC.
1. Preparazione del neonato e Adult Thymi
- Preparare tutti i reagenti e le attrezzature prima di eutanasia topi donatori.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave o altri metodi appropriati. Tutte le procedure chirurgiche sono svolte sotto una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili ed evitare la contaminazione. Montare gli strumenti necessari per l'estrazione di thymi da topi donatori.
- Riempire piastre da 60 mm sterile 1x PBS (pH 7.4) e disporli sul ghiaccio all'interno della cappa. Questo verrà utilizzato per memorizzare brevemente thymi asportato da topi donatori prima del trapianto.
- Come da orientamenti etici, eutanasia topi donatori neonati per decapitazione e donatori adulti topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale.
- Per removal del timo: Appoggiare il mouse in una posizione reclinata dorsale su un tovagliolo di carta assorbente sterile e spruzzare con il 70% di etanolo prima di effettuare una incisione.
- Esporre la cavità addominale e toracica facendo un'incisione mediana attraverso la pelle. Piegare la pelle sul petto e zampe anteriori per rivelare la cavità toracica.
- Fare due incisioni laterali attraverso il diaframma e gabbia toracica per esporre il mediastino superiore e anteriore cavità toracica. Il timo deve essere visibile come due lobi bianche immediatamente sopra e adiacente al cuore.
- Tease a parte il tessuto connettivo circostante il timo con una pinza sottile, facendo attenzione a non interrompere la capsula. Mentre trattenendo la gabbia toracica con una pinza, utilizzare una seconda coppia di pinze per estrarre i due lobi del timo posizionando pinze curve sotto l'organo e tirando verticalmente. Questo può essere fatto utilizzando un ambito dissezione per estrarre thymi da topi appena nati.
- Posizionare il timo in 60 millimetri dish contenente sterile 1x PBS (pH 7.4) su ghiaccio e lobi del timo separati tagliando attraverso l'istmo connettivo. Rimuovere eventuali detriti dai lobi del timo facendo attenzione a non danneggiare la capsula, e tagliare il timo nel numero appropriato di sezioni per il trapianto.
- Non manipolare il thymi ottenuto da topi appena nati.
NOTA: Utilizzato per un massimo di due topi riceventi (1 lobo per destinatario). - Transplant il thymi ottenuto da topi adulti in un massimo di 4-6 topi riceventi. Utilizzando un paio di pinze, afferrare accuratamente un adulto lobo timico, come mostrato nella Figura 1, tagliare il timo in tre sezioni uguali utilizzando forbici chirurgiche.
- Ripetere i passaggi 1,3-1,4 per ogni mouse donatore. Al fine di limitare il tempo thymi sono esposti, preparare timo 1 donatore alla volta.
2. Timo impianto sotto la capsula renale
- Montare l'apparecchiatura pre-sterilizzato elencati nella Tabella 1. Asettica Propertecnica dovrebbe essere utilizzata nel corso della procedura per evitare l'esposizione trapianto destinatari di strumenti o reagenti contaminati.
- Prima del trapianto, pesare ed etichettare ogni mouse destinatario.
- Impostare il microscopio da dissezione e circuito di anestesia nella cappa a flusso laminare.
- Usando un rasoio elettrico, radere il lato sinistro del mouse destinatario e non assicurano capelli rimangono intorno all'area utilizzata per effettuare l'incisione.
- Accendere vaporizzatore isofluorane e anestetizzare il mouse utilizzando una dose compresa tra 1-2%. Accertare corretta anesthetization prima di avviare la procedura chirurgica verificando l'assenza di riflesso seguente pinch punta.
- Dopo il mouse viene adeguatamente anestetizzato, applicare una pomata veterinaria agli occhi del mouse per prevenire la secchezza e preparare il mouse per il trapianto come segue:
- Posizionare il mouse sotto il microscopio da dissezione in una posizione reclinata laterale destro in modo che il lato rasata è rivolto verso l'alto. Starting nel centro della zona chirurgica, dispensare in un movimento circolare utilizzando una pipetta di trasferimento monouso 70% etanolo, seguito da povidone-iodio (Betadine). Ripetere il trattamento di etanolo / betadine 3 volte prima di effettuare una incisione.
- Con le forbici dissezione fanno un 1-2 cm un'incisione fianco direttamente sopra il rene.
- Utilizzando pinze medie afferrare tessuto connettivo adiacente al rene e sollevare delicatamente il rene in modo che si trova in cima alla muscolatura. Per mantenere il rene esposta e in posizione sopra la muscolatura, inserire un braccio di pinze medie sotto il rene, con particolare attenzione a non disturbare il ileo renale.
- Al fine di prevenire l'essiccamento del tessuto, irrigare il rene con sterile 1x PBS (pH 7.4) durante ogni passaggio finché manipolazione della capsula renale e rene è completo.
- Utilizzando una pinza sottile pizzicare e sollevare la capsula vicino al bordo del rene più distale alle ghiandole surrenali per separarlo dal rene.
- Utilizzare un calibro 18ago per fare una incisione abbastanza grande per inserire il pezzo preparato del timo donatore (Figura 2A). Assicurarsi di mantenere l'incisione capsulare più piccolo possibile per impedire la dislocazione dell'innesto nel tempo.
- Pur mantenendo la capsula tirato via dal rene, utilizzare una seconda coppia di pinza sottile per inserire l'innesto sotto la capsula e spingere il timo il più avanti dall'incisione capsulare possibile (Figura 2B).
- Rimuovere le pinze da sotto il rene, e restituire delicatamente il rene al suo posto attraverso l'incisione.
- Chiudere la muscolatura da sutura alla parete peritoneale e l'applicazione di betadine una volta chiusa. Dopo sutura, applicare la clip ferita per chiudere il derma e applicare betadine alla zona circostante.
- Ritorna il mouse in una gabbia che si è riscaldato con una lampada di calore.
- Monitorare ogni mouse post-operatorio fino a quando non riprende piena consapevolezza e la mobilità e non posizionare i topi that non hanno recuperato dopo anestesia in una gabbia con altri animali.
- Trattare topi con post-operatorie farmaci di gestione del dolore, se necessario. Fornire topi con analgesici post-operatorie, come paracetamolo in acqua potabile ad una concentrazione di 1,6 mg / ml.
- Ripetere i passaggi 2,3-2,9 per ogni mouse destinatario.
- Assicurarsi che il ritorno topi alla normale attività entro post-operatorio 1 ora. Monitorare peso post-operatorio, capacità motorie, nonché l'acqua e mangime attività di ciascuna mouse per determinare complicazioni derivanti della procedura di trapianto.
NOTA: la perdita di peso post-operatorio, rispetto al peso pre-operatoria, nonché la mobilità alterato o mancata mangiare o bere può indicare complicazioni. - Monitorare la ricostituzione delle cellule T del sangue periferico da sanguinamento topi con coda nick seguita dalla separazione dei linfociti che utilizzano mezzi di separazione cellulare Lympholyte secondo le specifiche del costruttore. Realizzare characteriza cellule Tzione mediante colorazione con anticorpi coniugati linfociti fluorescenza specifici per i marcatori di cellule T CD3, CD4, CD8, e così come un discriminatore morti vivono come un estere attivato 8 succinimidile fluorescente. Analisi come mostrato in Figura 3 può essere realizzato mediante gating su singlets, cellule vive e cellule positive CD3.
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Representative Results
Il successo di questa procedura dipende trauma chirurgico minimo nonché il posizionamento accurato del graft sotto la capsula renale. L'innesto timica deve essere tagliato per assicurare dimensioni appropriate sezioni timici per il successivo trapianto, come mostrato in Figura 1. Seguendo lo schema di figura 1, thymi da topi neonati o adulti può essere usato per il trapianto subcapsular successo con risultati costanti e riproducibili attecchimento delle cellule T. Come accennato, adeguato posizionamento dell'innesto sotto la capsula renale è importante per mantenere la sopravvivenza a lungo termine, la funzione e vascolarizzazione dell'innesto. Come si vede nella figura 2, l'innesto timica deve essere posto in cima al rene, più vicino alle ghiandole surrenali (anteriore del rene), sul lato opposto dall'incisione capsulare (posteriore del rene). Un trapianto del timo di successo, quando accoppiato con un ambiente ematopoietiche del caso, può rEmain produttivo di oltre 30 settimane 7.
Dopo il trapianto, l'attecchimento è valutata citometria a flusso analisi delle cellule T ottenute da sangue periferico. Figura 3 e tabella 2 dimostrare il livello tipico di attecchimento delle cellule T osservati in organi e sangue periferico in un ricevente di trapianto sei settimane dopo il trapianto. Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo ha già dimostrato la cinetica di CD4 + e CD8 + T ricostituzione delle cellule del sangue periferico nel corso del tempo in pazienti sottoposti a trapianto di thymi neonati e adulti. In breve, le cellule T circolanti possono essere osservati in periferia entro una settimana dopo l'intervento chirurgico e il numero di cellule CD4 + e CD8 + T continuano ad aumentare fino a quando il vano delle cellule T periferiche è completamente ricostituito a 5-6 settimane dopo il trapianto 7.
Figura 2:. Posizione capsulare incisione e posizionamento dell'innesto timico Una sezione di dimensioni appropriate preparata dal timo donatore viene inserito nello spazio subcapsular creato da una piccola incisione nella capsula renale alla fine posteriore del rene (A). Anteriore al rene, più vicino alle ghiandole surrenali (non raffigurato) e all'estremità opposta dall'incisione capsula, è la posizione ottimale per l'innesto che viene inserito sotto la capsula come mostrato in (B).
Figura 3. Determinazione attecchimento di successo attraverso la ricostituzione delle cellule T in sangue e linfoidi organi periferici. Flusso dati citometria sono rappresentativi di ricostituzione delle cellule T osservata 6 settimane post-trapianto in un ricevente SCID di un innesto timica NB. Simili livelli di attecchimento delle cellule T si osservano nel sangue periferico, milza, linfonodi pancreas (PLN), e il linfonodo mesenterico (MLN) dopo successo il trapianto di un trapianto del timo.
| Pinza sottile dissezione |
| Pinze medie dissezione (2) |
| Dissettore Belle (punta ricurva) |
| Betadine Soluzione |
| 70% etanolo |
| Ago calibro 18 |
| Dissezione microscopio w / sorgente di luce |
| Dipipette di trasferimento sposable (2) |
| Farmaci per la gestione del dolore: acetaminofene |
| Salviette sterili |
| Lampada riscaldante |
| Rasoio elettrico |
| Isoflurano e isoflurano vaporizzatore |
| Suture (veloce assorbimento, budello) |
| Forbici per dissezione |
| 9 clip mm Inox ferite |
| Ferita strumento di rimozione della clip |
| Sterile 1x PBS |
| 60 millimetri Dish |
Tabella 1:. Materiale necessario durante il trapianto chirurgico timica Elenco dei materiali necessari utilizzati per impiantare il timo sotto la capsula renale del mouse destinatario. La quantità di materiali specifici è elencato tra parentesi.
| Total Numero di cellule T CD4 | Numero totale di cellule T CD8 | |
| Sangue | 1.652 cellule / υl | 351 cellule / υl |
| Milza | 11.546.617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364.918 |
| MLN | 2182266 | 532.059 |
Tabella 2. Numero di cellule T presenti nel sangue e linfatici periferici organi di un destinatario trapianto timica. Numero totale di cellule recuperate dagli organi CD4 + e CD8 + T e sangue periferico di un destinatario trapianto timica neonato 6 settimane post trapianto. Questi numeri sono rappresentativi di CD4 + e cellularità cellule T CD8 + che si osserva tipicamente in pazienti trapiantati di successo timo neonati e adulti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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