Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

يصف بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة أساليب لرصد الوقت الحقيقي لتقدم برمجة عن طريق قياس الحركية من علامات الخلايا الجذعية المحفزة الإيجابية والسلبية باستخدام تحليل التدفق الخلوي. ويشمل البروتوكول أيضا على تقييم القائم على التصوير من التشكل، وعلامة أو التعبير مراسل خلال جيل التوجيهية.

Introduction

الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة من المريض (iPSCs) هي أدوات واعدة لعلاج الخلايا وفحص المخدرات. أنها توفر مصدر ذاتي للخلايا لعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تشمل مجموعة واسعة جدا من خلفيات وراثية، مما يتيح لفي المختبر تحليل مفصل للأمراض الوراثية وراء ما الخطوط الحالية الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) سيسمح. وقد أدت التطورات الحديثة في تطوير العديد من الطرق لتوليد iPSCs، بما في ذلك إعادة برمجة مع فيروس سينداي، البلازميدات episomal أو من mRNAs 1،2. والجدير بالذكر أن ترتبط طرق برمجة مختلفة مع مستويات الكفاءة والأمان متفاوتة، ومن المرجح أن تختلف في الطرق الأخرى التي تؤثر في مدى ملاءمتها لمختلف التطبيقات. مع توافر مجموعة متنوعة من تقنيات برمجة، أصبح من المهم وضع أساليب لتقييم عملية إعادة البرمجة. معظم الطرق الحالية تعتمد على التفتيش النوعي للالتشكل أو تلطيخمع الأصباغ والأجسام المضادة خلايا محددة الجذعية. واحد طريقة تم تطويرها مؤخرا يجعل من استخدام للصحفيين مضان lentiviral التي تعتبر حساسة لmiRNAs-PSC معين أو من mRNAs خلية محددة متباينة 3. هذه الطرق مراقبة تسهل اختيار وتعظيم الاستفادة من تقنيات إعادة برمجة لحالات مختلفة. على سبيل المثال، تم استخدام CDy1 باعتباره التحقيق الفلورسنت لiPSCs في وقت مبكر من أجل كشف عن جهري إعادة برمجة 4. القدرة على مراقبة ومقارنة التجارب برمجة مختلفة هو أمر حاسم لاكتساب فهم أفضل لعملية نفسها أيضا. على سبيل المثال، فمن المعروف الآن أن بعض أنواع الخلايا الجسدية هي أسهل لإعادة برمجة من غيرها 5، وأن الخلايا تمر عبر دول وسيطة خلال إعادة برمجة 6-8. وللأسف، فإن الآليات الكامنة وراء عملية إعادة برمجة لا تزال غير مفهومة تماما، وبالتالي، تبقى الاختلافات الدقيقة بين طرق برمجة أيضا أن defined. وبالتالي، فإن أساليب الرصد والتقييم، ومقارنة الأحداث برمجة أن تكون حاسمة لمجال الخلايا الجذعية.

الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول تسمح رصد وتقييم عملية إعادة برمجة وتوضح كيف أن هذه التقنيات يمكن أن تستخدم للمقارنة بين مجموعات مختلفة من الكواشف إعادة برمجة. ينطوي النهج الأول التدفق الخلوي التحليلات باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد الإيجابية والسلبية الخلايا الجذعية المحفزة (PSC) علامات. الثانية الأزواج نهج التصوير في الوقت الحقيقي وقياس مجموع التقاء (منطقة في المئة السطح الخلايا المغطاة) والتقاء إشارات علامة (المنطقة في المئة السطح بواسطة إشارات الفلورسنت المغطاة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.Solution وإعداد المتوسطة

  1. الطابق السفلي غشاء مصفوفة (تنقية من Engelbreth-هولم-سرب ورم)
    1. ببطء ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي (5 مل) على الجليد في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. تمييع الحل الأوراق المالية 1: 1 مع 5 مل من الجليد الباردة، DMEM معقمة / F-12 متوسطة في العقيمة، قبل المبردة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. الاستغناء قسامات إلى ما قبل المبردة، 1.5 مل العقيمة أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وتخزينها على الفور في -20 درجة مئوية.
    3. قبل الاستخدام، وذوبان الجليد المجمدة 1: 1 الغشاء القاعدي مصفوفة قسامة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في وقت الاستخدام، مما يخفف من 1: قسامة 1 50 أضعاف أخرى مع الجليد الباردة، DMEM معقمة / F-12 متوسطة لتخفيف النهائي من 1: 100.
    4. إضافة كمية مناسبة من 1: 100 الطابق السفلي المخفف حل غشاء مصفوفة لزراعة الأنسجة المناسبة (TC) السفن واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. عادة، استخدام 3 مل من الطابق السفلي حل غشاء مصفوفة المخفف إلى معطف طبق TC سو 20 سم 2 مساحة السطح، ومعطف جميع أنواع أخرى من الأطباق TC / لوحات في نسبة 0.15 مل من مصفوفة المخففة سم 2 من مساحة السطح. نضح الحل المتبقية قبل إضافة أي مستنبت والخلايا.
  2. الليفية المتوسطة
    1. ذوبان الجليد في زجاجة 100 مل من ES المؤهلين الجنين مصل بقري (ES-FBS) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إضافة 50 مل من إذابة ES-FBS و 5 مل من MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية الحل (1X) إلى 445 مل من DMEM المتوسطة. تعقيم العناصر مجتمعة من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزين المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  3. iMEF المتوسطة
    1. ذوبان الجليد في زجاجة 100 مل من ES-FBS في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إضافة 50 مل من FBS إذابة، 5 مل من MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية الحل (1X)، و 500 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول إلى 445 مل من DMEM المتوسطة.
    3. تعقيم العناصر مجتمعة من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزين ليdium في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  4. الأساسية الخلايا الليفية عامل النمو الحل (ب-جمعية جيل المستقبل)
    1. إضافة 10 ميكرولتر من استبدال المصل إلى 990 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    2. إضافة 1 مل من محلول المصل استبدال 1٪ (ت / ت) لقنينة واحدة من 10 ميكروغرام مجفف بالتجميد ب-جمعية جيل المستقبل. مزيج دقيق من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
    3. قسامة 10 ميكروغرام / مل-ب جمعية جيل المستقبل الحل في 200 مكل في أنابيب صغيرة أجهزة الطرد المركزي ومخزن في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  5. الجذعية المحفزة البشري الخليوي (hPSC) متوسطة
    1. ذوبان الجليد في زجاجة 100 مل من استبدال المصل عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إضافة 100 مل من استبدال المصل إذابة، 5 مل من MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية الحل (1X)، و 500 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول إلى 395 مل من DMEM / F-12 متوسطة.
    3. تعقيم العناصر مجتمعة من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزين المتوسطة في4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
    4. في وقت الاستخدام، وقبل تسخين المتوسطة hPSC إلى 37 درجة مئوية، وتكملة مع 4 نانوغرام / مل من bFGF.
  6. iMEF مكيفة المتوسطة (CM)
    1. إضافة 18 مل من 0.1٪ الجيلاتين إلى قارورة T-175 الثقافة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. إزالة حل الجيلاتين 0.1٪ بعد ساعة واحدة من الحضانة. إضافة 9.1 × 10 6 الخلايا الليفية الماوس الجنينية ميتوتيكلي-المعطل (iMEF) في 45 مل من المتوسط ​​iMEF واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل.
    3. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، وإزالة المتوسطة iMEF القديم ويغسل مرة واحدة مع 25 مل من مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. نضح قبالة مد PBS غسل وإضافة 90 مل من المتوسط ​​hPSC قبل تحسنت، على أن تستكمل مع 4 نانوغرام / مل من bFGF. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية بالضبط 24 ساعة.
    5. بعد 24 ساعة من الحضانة، جو معقم و مطهر وإزالة المتوسطة hPSC من القارورة iMEF وتعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون. قسامة 50 مل أنابيب مخروطية وتجميد في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. iMEF CM يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية.
    6. إضافة آخر 90 مل من المتوسط ​​hPSC قبل تحسنت تستكمل مع 4 نانوغرام / مل من bFGF إلى قارورة iMEF. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية بالضبط 24 ساعة. كرر حصاد سم لمدة تصل إلى 7 أيام.
    7. في وقت الاستخدام، وقبل تسخين iMEF-CM إلى 37 درجة مئوية، وتكملة مع 4 نانوغرام / مل من bFGF.
  7. E8 المتوسطة
    1. ذوبان الجليد ملحق 10 مل E8 في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إزالة 10 مل من المتوسط ​​القاعدية E8 وجو معقم و مطهر إضافة محتويات الملحق E8 إذابة إلى متوسطة القاعدية المتبقية. تخلط جيدا وتعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تخزين المتوسطة كاملا في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
    3. في وقت الاستخدام، وقبل تدفئة قسامة من متوسطة إلى استخدامها لدرجة حرارة الغرفة. فمن غير المستحسن إلى ما قبل دافئ E8 متوسطة إلى 37 درجة مئوية.
  8. خلية لذلكrting العازلة
    1. إعداد عازلة الفرز الطازج الحق قبل خلية الفرز من خلال إضافة محلول EDTA (1 ملي تركيز النهائي)، HEPES العازلة (تركيز 25 مم النهائي) حل البنسلين / الستربتوميسين (100 وحدة / مل تركيز النهائي) والأبقار مصل الزلال (1٪ تركيز النهائي) إلى Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (الكالسيوم والمغنيسيوم الحرة).
    2. تعقيم المنطقة العازلة من خلال مرشح 0.22 ميكرون قبل استخدام.
  9. خلية الفرز استعادة المتوسطة
    1. تعديل 50 مل من الخلايا الليفية المتوسطة عن طريق إضافة البنسلين / الستربتوميسين (100 وحدة / مل تركيز النهائي) وروك المانع Y-27632 (10 ميكرومتر تركيز النهائي). قبل الدافئة هذه الوسيلة إلى 37 درجة مئوية قبل البذر الخلايا فرزها.

2. سينداي وساطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان

  1. 24 ساعة قبل تنبيغ مع الفيروسات سينداي، البذور في الخلايا الليفية في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية لكل بئر في الآبار المطلوبة من لوحة TC 6 جيدا.
  2. أداء تنبيغ في اليوم 0 كما يلي.
    1. قبل الحارة 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة في 37 ° C حمام الماء. إزالة مجموعة واحدة من أنابيب فيروس سينداي من -80 ° C تخزين وذوبان الجليد كل أنبوب واحد في وقت واحد عن طريق غمر لأول مرة الجزء السفلي من الأنبوب في حمام مائي C 37 درجة ل5-10 ثانية، ثم قم بإزالة أنبوب من الماء الحمام وتمكينه من ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في أنبوب ووضعه مباشرة على الجليد.
    2. استخدام الجيل الثاني تجاريا الفيروسات سينداي بإضافة كميات مناسبة (حسب COA) لكل من الأنابيب من أجل تحقيق تعدد التالية من العدوى (وزارة الداخلية) إلى 1 مل من قبل تحسنت الخلايا الليفية المتوسطة لكل بئر إلى أن transduced على النحو التالي : كوس = 5 × 10 6 CIU، HC-Myc على = 5 × 10 6 CIU، hKlf4 = 3 × 10 6 CIU.
    3. مزيج دقيق الحل الفيروسي قبل pipetting الخليط بلطف صعودا وهبوطا. مجمعاتالشركة المصرية للاتصالات الخطوة التالية ضمن 5 دقائق.
    4. نضح الخلايا الليفية المتوسطة من البئر من الخلايا الليفية إلى إعادة برمجة، وإضافة 1 مل من محلول الفيروسي إلى كل بئر. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.
  3. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، ونضح قبالة المتوسطة التنبيغ والتخلص من القديم المتوسطة بشكل صحيح (10٪ محلول التبييض لمدة 30 دقيقة). استبدال 2 مل من قبل تحسنت الخلايا الليفية المتوسطة والاستمرار في ثقافة الخلايا transduced.
  4. ثقافة الخلايا لمدة 6 أيام أخرى، لتحل محل المتوسطة القديمة مع الطازجة الخلايا الليفية المتوسطة كل يوم.
    ملاحظة: لا مرور الخلايا المعاد برمجتها حتى فترة 7 أيام تنبيغ.
  5. اليوم 6: إعداد أطباق لتوليد IPSC
    1. لتوليد التوجيهية التي تعتمد على التغذية، إضافة 1.5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين في كل بئر من (TC) صحن زراعة الأنسجة 6-جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. إزالة الجيلاتين 0.1٪ حتىlution بعد 1 ساعة من الحضانة. إضافة 3 × 10 5 الخلايا الليفية الماوس الجنينية ميتوتيكلي-المعطل (iMEF) في 2 مل من المتوسط ​​iMEF لكل بئر واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل.
    3. لتوليد IPSC مستقلة التغذية، إضافة 1.5 مل من المخفف الطابق السفلي غشاء المصفوفة (1: 100 تمييع) إلى كل بئر من (TC) صحن زراعة الأنسجة 6-جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  6. بعد سبعة أيام تنبيغ، حصاد الخلايا الليفية transduced وإعادة لوحة لهم على أطباق ثقافة مسبقة الصنع لتوليد مستعمرة التوجيهية.
    1. نضح قبالة مستنبت طبيعي من الخلايا الليفية، وغسل خلايا مرة واحدة مع 2 مل من مد برنامج تلفزيوني.
    2. نضح قبالة مد PBS غسل وإضافة 0.5 مل من قبل تحسنت 0.05٪ التربسين / EDTA. احتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. عندما الخلايا قد اعتقلوا، إضافة 2 مل من قبل حرارة الخلايا الليفية المتوسطة في كل بئر لوقف trypsinization. إزاحة الخلايا من جيد من قبل pipetting بلطف رانه المتوسطة عبر سطح الطبق. جمع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل.
    4. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف، وإعادة تعليق الخلايا في 2 مل جديدة، قبل تحسنت الخلايا الليفية المتوسطة.
    5. عد الخلايا باستخدام الأسلوب المطلوب (عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلية) والبذور الأطباق الثقافة معدة سلفا مع 5 × 10 4 خلايا للشروط التي تعتمد على التغذية و 1 × 10 5 خلايا لظروف مستقلة المغذية، لكل بئر من 6 -well طبق واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
    6. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، تغيير على المديين المتوسط ​​وhPSC المتوسطة، E8 المتوسطة أو وسائل الإعلام مكيفة iMEF، اعتمادا على التطبيق. استبدال المتوسطة القديمة مع المتوسط ​​الطازجة كل يوم بعد ذلك.

3. سينداي إعادة برمجة الخلايا الجذعية BGO1v hOct4-GFP الجنينية مراسل الإنسان (HESC) مشتقة الخلايا الليفية الثانوية

  1. ديرإيف الخلايا الليفية الإنسان الثانوية من BG01v hOct4-GFP خط مراسل HESC وفقا للإجراءات المنصوص عليها في السابق 9.
  2. قبل يومين التنبيغ، لوحة BGO1v / خنزير المستمدة الخلايا الليفية إلى بئرين لوحة 6 جيدا في 2 × 10 5 خلايا لكل بئر، وذلك باستخدام الخلايا الليفية المتوسطة.
    1. في يوم تنبيغ، 2 مل قبل الدافئة من الخلايا الليفية المتوسطة إلى 37 درجة مئوية.
    2. إزالة مجموعة واحدة من أنابيب سينداي من -80 ° C التخزين. إزالة قارورة من الحقيبة وذوبان الجليد كل أنبوب واحد في وقت واحد عن طريق غمر لأول مرة الجزء السفلي من الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5-10 ثانية، وبعد ذلك، والسماح للأنابيب لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في أنبوب ووضعه مباشرة على الجليد.
    3. إضافة الكميات المشار إليها من كل من أنابيب سينداي ثلاثة (انظر لجنة الزراعة لحجم مناسب) إلى 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة، قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، وتخلط جيدا في حل الفيروسي من قبل pipetting صعودا وهبوطا. استكمال الظريف المقبلص ضمن 5 دقائق.
      ملاحظة: للحصول على هذه التجربة، وزارة الداخلية من 5: تم استخدام 6: 5.
    4. نضح الخلايا الليفية المتوسطة من الآبار من الخلايا الليفية إلى أن transduced. إضافة 1 مل من تعليق الفيروسي إلى كل من بئرين أن transduced. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.
    5. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، وإزالة المتوسطة التنبيغ والتخلص منها بشكل صحيح (محلول التبييض 10٪ لمدة 30 دقيقة). استبدال كل جيدا مع 2 مل من قبل تحسنت الخلايا الليفية المتوسطة والاستمرار في ثقافة الخلايا transduced.
  3. ثقافة الخلايا لمدة 6 أيام أخرى، وتغيير المتوسطة القديمة مع الطازجة الخلايا الليفية المتوسطة كل يوم.
    1. سبع آخر أيام تنبيغ، حصاد الخلايا الليفية transduced وإعادة لوحة لهم على أطباق ثقافة مسبقة الصنع لتوليد مستعمرة التوجيهية.
    2. نضح قبالة مستنبت طبيعي من الخلايا الليفية، وغسل خلايا مرة واحدة مع 2 مل من مد برنامج تلفزيوني.
    3. نضح قبالة موانئ دبيBS غسل وإضافة 0.5 مل من قبل تحسنت 0.05٪ التربسين / EDTA. احتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. عندما الخلايا قد اعتقلوا، إضافة 2 مل من قبل حرارة الخلايا الليفية المتوسطة في كل بئر لوقف trypsinization. إزاحة الخلايا من جيد من قبل pipetting بلطف المتوسطة على سطح الطبق. جمع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل.
    5. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 2 دقيقة. نضح طاف، وإعادة تعليق الخلايا في كمية مناسبة من جديد، قبل تحسنت الخلايا الليفية المتوسطة.
    6. عد الخلايا باستخدام الأسلوب المطلوب (عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا).
    7. البذور الخلايا transduced في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 خلايا لكل بئر من مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة لوحة 6 جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
  4. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، تغيير على المديين المتوسط ​​وiMEF مكيفة المتوسطة، على أن تستكمل مع 10 نانوغرام / ملتر من ب-جمعية جيل المستقبل. استبدال المتوسطة القديمة مع الطازجة iMEF سم كل يوم بعد ذلك.
  5. وظيفة في ثلاثة أسابيع التنبيغ، ميكانيكيا تشريح ونقل المستعمرات المطلوب للتوسع نسيلي أو استخدام لتحليلها.

4. يعيش التصوير خلية من الخلايا الليفية إعادة برمجة

  1. رصد في الوقت الحقيقي
    1. 7 آخر أيام تنبيغ مع عدة برمجة سينداي، البذور المبلغ المطلوب من الخلايا على أطباق 6 جيدا مع أنظمة المتوسطة ومصفوفة المطلوب كما هو موضح سابقا. ضع الأطباق المصنفة داخل تصوير، وتقع في حاضنة ترطيب وضعت في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    2. تعيين برامج التصوير لالتقاط الصور بشكل جيد كاملة من كل بئر الفردية في المجموعة الفاصلة (كل 6-8 ساعة) صورة مستمرة التقاط ل 14 يوما المقبلة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يتم اختيار إعدادات الصورة المرحلة المقابل لإعادة البرمجة العادية لتقييم مستعمرة التقدم. في هذا الحال - في هذه القضيةمن BG01v / خنزير المستمدة الليفية برمجة، فمن الأفضل لالتقاط الصور في مرحلة التباين وفي قناة الفلورية الخضراء باعتبارها إعادة تفعيل لالذاتية مراسل OCT4-GFP يمكن تتبع جميع مراحل عملية إعادة البرمجة.
    3. تغيير متوسطة يوميا، يمكن أن يكون hPSC المتوسطة، E8 المتوسطة، أو iMEF-CM، اعتمادا على التجربة، كما هو موضح سابقا من يوم 8-21 بعد تنبيغ. الآبار يمكن تحليلها لتشكيل مستعمرة باستخدام المناعي غير المباشر.
    4. في نهاية التجربة في يوم 19-21، وإزالة مستنبت من كل جانب إلى أن بحث مع الأجسام المضادة لالليفية ووقف علامات خلية في الاختيار.
    5. غسل كل بئر مرة واحدة مع 2 مل من قبل تحسنت DMEM / F-12 متوسطة.
    6. إعداد aliquots من كل سلبية أزواج الأضداد إيجابية / الابتدائية في 1 مل من DMEM / F-12 متوسطة على النحو التالي: مكافحة فأر SSEA4 (1: 200)، ومكافحة فأر CD44 (01:50)، ومكافحة فأر TRA-1- 60 (1: 200)، ومكافحة فأر CD44 (01:50)، والفوسفاتيز القلوية ليلقد وصمة عار (01:50) وCD44 مكافحة الفئران (1:50). إضافة 1 حلول الأجسام المضادة الأولية مل لكل المقابلة بشكل جيد. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    7. نضح قبالة حل الأجسام المضادة الأولية وغسل مرتين مع درجة حرارة ما قبل DMEM / F-12 متوسطة.
    8. إعداد حلول الأجسام المضادة الثانوية (1 مل لكل بئر) باستخدام الماعز لمكافحة فأر اليكسا فلور 488 مترافق الثانوية (1: 500) عن مخضر والماعز المضادة للفأر اليكسا فلور 594 مترافق الثانوية (1: 500) عن مضان أحمر في DMEM / F-12 متوسطة. إضافة إلى كل بئر بعد غسل النهائي. احتضان الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: نظرا لالفوسفاتيز القلوية لايف وصمة عار في (الألغام) إشارة عابرة، والحضانة الأولية لمكافحة CD44 يجب القيام أولا في حد ذاته، وينبغي أضافت الألغام المضادة للأفراد في وقت الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية
    9. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية، ونضح من الحل ويغسل مرتين مع DMEM / F-12 متوسطة. إضافة جديدة قبل تحسنت DMEM / F-12متوسطة إلى كل جيدا قبل التقاط الصورة النهائية.
    10. تعيين برنامج تصوير للحصول على الصور جيدا كاملة من كل بئر باستخدام جميع المعلمات المسح ثلاث: المرحلة النقيض من ذلك، مخضر ومضان أحمر. خلق صور في تكبير مختلفة وإنشاء الوقت الفاصل بين الأفلام مع برنامج لمراقبة نمو والتعبير علامة. استخدام بروتوكول الشركة الصانعة.
    11. الاستفادة من برامج التحليل وتقييم التقاء أكثر من مرة في مرحلة التباين وفي وحدات الفلورسنت الخضراء للBG01v / خنزير إعادة برمجة.
  2. مراقبة إعادة برمجة الوسطيات علامات باستخدام سطح الخلية
    1. رصد الأحداث برمجة عند نقاط زمنية مختلفة قبل التحقيق الأطباق إعادة برمجة عند نقاط زمنية مختلفة مع الأجسام المضادة ضد الخلايا الجذعية مختلفة علامات إيجابية / سلبية من أجل مراقبة عملية إعادة البرمجة. الثقافات تحقيق كل 2-3 أيام اعتمادا على توافر من مكررات. تحقيق في ديس برمجة[هس] في يوم 19-21 باستخدام استراتيجية تلطيخ مزدوجة لتحديد المستعمرات IPSC إعادة برمجة بشكل كامل والمستعمرات إعادة برمجة جزئيا على أساس أنماط تلطيخ.
    2. في نقطة الوقت المطلوب، ونضح قبالة المتوسطة النمو الطبيعي من كل جانب إلى أن بحث مع الأجسام المضادة لعلامات الاختيار.
    3. غسل كل بئر مرة واحدة مع 2 مل من قبل تحسنت DMEM / F-12 متوسطة.
    4. إعداد aliquots من كل سلبية أزواج الأضداد إيجابية / الابتدائية في 1 مل من DMEM / F-12 متوسطة على النحو التالي: SSEA4 مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (1: 200)، هيئة تنظيم الاتصالات 1-60 مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (1: 50)، القلوية لايف وصمة عار (1: 500)، CD24 مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (01:50)، B2M مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (01:50)، EpCAM مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (01:50) ، والماوس CD73 (1: 100) والتي تم بحثها مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (1: 500)، وCD44 الفئران (1:50) الذي بحث معمكافحة الفئران الضد الثانوية مترافق إلى fluorophore أحمر فلوري (1: 500). إضافة 1 حلول الأجسام المضادة الأولية مل لكل المقابلة بشكل جيد. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    5. نضح قبالة حل الأجسام المضادة الأولية وغسل مرتين مع درجة حرارة ما قبل DMEM / F12 المتوسط.
    6. عن الأجسام المضادة اللامقترن، انتقل إلى استخدام أسلوب 2-خطوة إعداد الحلول المناسبة الضد الثانوية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن الأجسام المضادة الثانوية إلى مضيفي الابتدائي ولا تعبر الرد. تنفيذ الخطوات غسل إضافية كما هو موضح سابقا.
    7. بعد كل شيء يغسل المناسبة، إضافة جديدة قبل تحسنت DMEM / F-12 متوسطة إلى كل جيدا قبل التقاط الصورة النهائية.
    8. التقاط الصور الفلورسنت تحت التصفية المناسب في التكبير 100X باستخدام مجهر فلوري وتحليل الصور باستخدام برامج التحليل المتاحة.

5. قياس إعادة برمجة حركية باستخدام التدفق Cytometry

  1. الكمية الحركية قياس إعادة برمجة باستخدام الأجسام المضادة الخلايا السطحية
    1. قبل إعادة برمجة، وإعداد العدد المناسب من التجارب برمجة لل كل نقطة زمنية. لقياس حركية إعادة برمجة لمدة 7 أيام الأولى من إعادة برمجة، يتم تنفيذ transductions الفردية لكل نقطة الوقت المطلوب. للحصول على نقاط وقت بعد يوم واحد 7، البذور الكافية نقطة زمنية مستقلة المغذية لمواصلة قياس الأحداث برمجة. وهناك بئر واحدة من لوحة 6 جيدا تسفر عن كميات كافية من الخلايا لأداء تحليل التدفق الخلوي.
    2. قياس كل نقطة زمنية إعادة برمجة المطلوب من الآبار الفردية، وهذا هو فحص نقطة النهاية. نضح قبالة الخلايا الليفية المتوسطة من المطلوب أيضا. يغسل مرة واحدة مع مد برنامج تلفزيوني.
    3. نضح قبالة يغسل مد برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من 0.05٪ حل التربسين-EDTA إلى البئر لفحصها. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. بعد الحضانة، dissociيأكل من الخلايا في الخلايا واحد من قبل بيغ تعليق خلية 1 مل ضد سطح البئر ونقل تعليق إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام 3 مل من مد PBS ليغسل أي الخلايا المتبقية من البئر وإضافتها إلى مخروطي 15 مل. استخدام 10 مل من إضافية مد برنامج تلفزيوني لمزيد من تمييع الحل الخلية في أنبوب مخروطي الشكل.
    5. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من DMEM / F-12 متوسطة. إجراء تعداد خلايا حسب الحاجة لإنشاء تعليق خلية القياسية التي هي أقل من 1 × 10 6 خلية / مل.
    6. إعداد كل قسامة من السلبية الأجسام المضادة الإيجابية / مباشرة مترافق الاختيار في 1 مل من DMEM / F-12 متوسطة لأقل 1 × 10 6 خلية / مل باستخدام المجموعات التالية: SSEA4 مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء (1: 200) مع CD44 مترافق PE-Cy5، أو CD44 مترافق إلى fluorophore الفلورية الخضراء وSSEA4 مترافق إلى fluorophore المتطرف الاستشعاع الأحمر. احتضانالأجسام المضادة مع تعليق خلية لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. نضح حل الأجسام المضادة الأولية وغسل مرتين مع قبل تحسنت DMEM / F-12 متوسطة.
    8. نضح غسل النهائي، وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من مد برنامج تلفزيوني. الماصة محتوى كل تعليق في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية الفردية.
    9. باستخدام ضوابط السلبية المناسبة (الضوابط غير ملوثين ونمط إسوي)، تأكيد إلى الأمام والجانب مبعثر الشخصي والفولتية المناسبة على الكريات. ضبط الفولتية لfluorophores المقابلة وفقا لمعايير وصمة عار واحدة الأولية، بحيث fluorophores الخضراء وتفعيلها من خلال الليزر الأزرق والإشارات المكتسبة في قناة BL1، في حين يتم تنشيط fluorophore الاستشعاع الحمراء البعيدة وPE-Cy5 fluorophore من الليزر الأحمر و إشارات المكتسبة في قناة RL1. الحصول على السكان المزدوج الملون لكل نقطة زمنية.
    10. تحليل ملفات FCS عن كل نقطة زمنية باستخدام برامج التحليل المناسب واستخدام محرر لالأذربيجانيةالبيانات نجى لمراقبة التحول التعبير السكان مع مرور الوقت.
    11. اتبع الخطوات 5.1.1 إلى 5.1.6، إذا كان المطلوب فرز الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. استخدام تركيبات fluorophore المناسبة وفقا لتكوين ليزر من فارز الخلايا لاستخدامها.
    12. بعد غسل النهائي، وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من المخزن المؤقت فرز الخلايا. إعداد فارز الخلية إلى إعدادات إلى الأمام والجانب مبعثر المناسبة باستخدام عنصر تحكم غير ملوثين. استخدم عناصر التحكم الملون واحدة لإعداد الإعدادات المناسبة لكل fluorophore.
    13. استخدام عينة صغيرة من تعليق خلية ملطخة المزدوج. حدد السكان 2 إلى فرز وتعيين المسؤول المعني لضمان جمع السليم للخلايا فرزها.
    14. إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة انتعاش الخلايا في أنابيب جمع للتأكد من أن تعليق خلية مرتبة وخففت وحمايتها في الوقت الفرز. حصاد عدد رغبة الخلايا ونقل على أطباق iMEF جديدة تحتوي جديدةأعدت لاي المتوسطة الانتعاش.
    15. تغيير المتوسطة بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع المتوسط ​​الانتعاش. الثقافات يجب أن يكون الطعام في وقت لاحق وpassaged بشكل روتيني باستخدام المتوسطة hPSC تحتوي على البنسلين / الستربتوميسين (100 وحدة / مل تركيز النهائي).

6. تحليل نقطة النهاية

  1. محطة الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب) تلطيخ
    1. استخدام محطة مولد اللون ا ف ب تلطيخ لربط الأحداث الحركية والمورفولوجية الملحوظة مع كفاءات إعادة برمجة النهائية.
    2. وبعد 21 يوما من إعادة برمجة، وإزالة مستنبت من البئر لتكون ملطخة مع محطة AP وصمة عار ويغسل مرة واحدة مع 200 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0).
    3. إعداد كمية مناسبة من الحل تلطيخ حسب توجيهات دليل الشركة المصنعة في 200 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك.
    4. نضح غسل وإضافة 2 مل من محلول تلطيخ استعداد لكل بئر. احتضان لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء الإلكترونية.
    5. نضح الحل تلطيخ ويغسل مرة واحدة مع 200 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك. إزالة غسل وإضافة الماء المقطر قبل التصور.
    6. التقاط إشارة اللونية باستخدام كاميرا الصورة العادية. حساب عدد من المستعمرات ملطخة بشكل إيجابي باليد. تصور وصمة عار باستخدام التحليل فلوري في قناة يسحق-C، كما وصمة عار أيضا الفلورسنت في طبيعة وأداء كله جيدا التصوير وتحليلها باستخدام تصوير كامل أيضا. استخدام بروتوكول الشركة الصانعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مراقبة حركية إعادة برمجة باستخدام التدفق الخلوي

CD44 هو علامة الليفية في حين SSEA4 هو علامة PSC 6،10. كما هو متوقع من هذا النمط التعبير، التدفق الخلوي الخلايا الليفية BJ يدل على SSEA4 - CD44 + السكانية التي تسهل إنشاء بوابات رباعي في تركيبة مع عينة غير ملوثين. خلال إعادة برمجة الخلايا الليفية DF1 مع الفيروسات سينداي، يتم فقدان CD44 تدريجيا بينما أعرب SSEA4 ببطء. في يوم 3 بعد تنبيغ مع الفيروسات سينداي، وهناك عدد كبير من SSEA4 - خلايا CD44 + وعدد صغير من السكان SSEA4 + CD44 + الخلايا التي تصبح أكثر وضوحا في يوم 7 (الشكل 1). في يوم 13، التحولات السكان المزدوج إيجابية نحو SSEA4 + CD44 - الدولة. قبل يوم 17، ونسبة كبيرة من مLLS في الثقافة هي بالفعل SSEA4 + CD44 -. هذه المرة يظهر بطبيعة الحال أن التدفق الخلوي مع CD44 وSSEA4 يمكن استخدامها لمراقبة التقدم ومعدل إعادة برمجة.

مقارنة الكمية تؤكد أن إعادة برمجة الخلايا الليفية BJ مع الفيروسات برمجة سينداي يولد SSEA4 + CD44 - خلايا بمعدل مختلفة من إعادة برمجة الخلايا الليفية BJ (الشكل 2A). وتدل البيانات على أن المقارنة في وقت مبكر من نسبة شبيهة PSC SSEA4 + CD44 - خلايا يتتبع تطور برمجة. ومن المثير للاهتمام، في يوم 8 من إعادة برمجة الخلايا الليفية DF1 والفرز وحدة زراعة السكان من الخلايا التي هي في طور upregulating SSEA4 وdownregulating CD44 يولد AP + المستعمرات 11 (الشكل 2B). في المقابل، فإن SSEA4 الأصلية - CD44 + السكان يولد صباحااوك عدد أقل من AP + المستعمرات في يوم 21 من برمجة، الذي هو يوم عادي من تحليل مستعمرة النهائي. وهذا يشير إلى أنه من الممكن لقياس ومقارنة عدد السكان الانتقال من أجل التنبؤ الاختلافات في حركية إعادة برمجة حتى قبل SSEA4 + CD44 - يتم تشكيل السكان. نقطة مهمة أن نلاحظ هنا أن إعادة برمجة هي عملية متغيرة تعتمد على عدة عوامل مثل بدء السكان نواة الخلية الجسدية، وكفاءة ترنسدوكأيشن والمتوسطة، وما إلى ذلك النمط العام والتقدم من علامات سطح صفها أعلاه هو ثابت بين التجارب برمجة مختلفة و تبدأ الخلايا الليفية. يمكن أيضا أن يتم تحليل حركية إعادة برمجة مع علامات مختلفة، مثل العلامات التي تم تشخيصها حديثا السلبية PSC CD73 وB2M 6، فضلا عن علامات PSC أنشئت CD24 12،13 و 14،15 EPCAM. وأعرب مماثلة لCD44، CD73 وB2M في المساواةالليفية ental BJ، ولكن downregulated خلال إعادة برمجة، وأصبحت غير قابلة للكشف في iPSCs برمجتها بالكامل (الشكل 3A). والتدفق الخلوي دوام باستخدام CD44 CD73 و CD44 أو وB2M يظهر أن CD44 و CD73 وdownregulated بمعدل مماثل، في حين downregulated B2M أسرع من CD44 (الشكل 3B). في كلتا الحالتين، فإن معدل إعادة برمجة يمكن ملاحظتها من خلال قياس تراكم السكان سلبي مزدوج. وعلى النقيض من هذه العلامات PSC السلبية، CD24 وEPCAM غائبة في الخلايا الليفية وأعرب في iPSCs (الشكل 3A). في التدفق الخلوي دوام، CD24 - CD44 + وEPCAM - CD44 + الخلايا الليفية تشكل في نهاية المطاف السكان المزدوج سلبية أن الانتقال لاحقا إلى CD24 + CD44 - وEPCAM + CD44 - خلايا تشبه PSC، على التوالي (الشكل 3B). وهكذا، خلال برمجة، على حد سواء علامات PSC إيجابيةوأعرب بعد downregulated CD44. وعلى غرار ما لوحظ مع SSEA4 وCD44، وتكوين وتراكم السكان خلية مختلفة تشير إلى تطور برمجة.

تتبع إعادة برمجة طريق في الوقت الحقيقي تحليل التصوير

التصوير في الوقت الحقيقي من إعادة برمجة الثقافات بعد البذر يظهر تشكيل التدريجي للمستعمرات (الشكل 4A)، وهو ما يعادل زيادة وغاريتمي في التقاء تحت النقيض من المرحلة (الشكل 4B). التقاء في إطار المرحلة على النقيض مما يوفر مقياسا آخر لرصد إعادة برمجة كميا، لكنه يضم كلا من والمستعمرات التي هي ايجابية للعلامات PSC وانتشار المستمر للخلايا unreprogrammed أو برمجتها جزئيا (الشكل 4A، لوحة الماضية). قياس المناطق التي تم الملون للعلامات تعدد القدراتهيئة تنظيم الاتصالات 1-60، SSEA4 وا ف ب 6،10 في يوم 21 يشير إلى أن iPSCs فقط لحساب أقل من نصف مجموع التقاء (الشكل 4B). لقياس التقدم المحرز في إعادة برمجة أكثر صرامة، فمن الممكن استخدام خط مراسل لإعادة البرمجة. هنا، تم إنشاء الخلايا الليفية الثانوية من خط BG01v / خنزير ESC، والتي تم تصميمها مع مراسل OCT4-GFP 16. وأعرب عن GFP كما تم إعادة برمجة الخلايا وكما تتشكل مستعمرات (الشكل 5A). قياس التقاء تحت النقيض من مرحلة وقنوات خضراء يدل على أن التقاء GFP يزيد ببطء أكثر من مجموع التقاء، والتقاء GFP في يوم 19 هو أقل من نصف مجموع التقاء (الشكل 5B)، يذكرنا هيئة تنظيم الاتصالات 1-60، SSEA4 وAP تلطيخ في يوم 21.

شكل 1
الشكل 1. موnitoring التقدم من إعادة برمجة باستخدام التدفق الخلوي. مؤامرات التدفق الخلوي نقطة لDF1 الخلايا الليفية برمجتها مع سينداي الفيروسات تحت ظروف خالية من الطاعم. تم حصاد الخلايا وملطخة SSEA4 وCD44 الأجسام المضادة في فترات مختلفة من اليوم 3 (D3) إلى يوم 19 (D19) من عملية إعادة البرمجة. (D9) وقد تم تحليل الثقافات في يوم 9 فصاعدا بعد أن reseeded الخلايا في يوم 7 (D7). قطع نقطة تظهر 8000 singlets ل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
. الشكل 2. تقييم إعادة برمجة حركية والكفاءة تحت ظروف خالية من الطاعم (A) رسم بياني يبين التغيرات في نسبة SSEA4 + CD44 - برمجتها الخلايا بعد transducing DF1 أكذوبةroblasts والخلايا الليفية BJ مع الفيروسات سينداي. وقد تم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي في يوم 3-19 بعد تنبيغ، مع الثقافات في يوم 9 تمر فصاعدا البذر في يوم 7. (ب) الزائفة لون التدفق الخلوي المؤامرات لخلايا DF1 transduced الفيروسات سينداي وملطخة SSEA4 وCD44 الأجسام المضادة. SSEA4 - CD44 + الخلايا (دائرة سوداء) وSSEA4 + الخلايا (الدائرة الحمراء) تم فرزها في يوم 8 وسمح لتنمو حتى يوم 19 قبل تلطيخ لالفوسفاتيز القلوية (الأحمر) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مراقبة إعادة برمجة حركية الثقافات خالية تغذية عن طريق مختلف علامات PSC الإيجابية والسلبية. (م) تلطيخ لايفمن الثقافات المستمدة DF1 يوم 18 برمجة باستخدام الأجسام المضادة لعلامات PSC إيجابية CD24 وEPCAM وعلامات PSC السلبية CD44، CD73، وB2M. لوحات أعلى دمج القنوات مضان الخضراء والحمراء في حين تتضمن لوحات أسفل أيضا صورة النقيض من المرحلة. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. (E) التدفق الخلوي المؤامرات نقطة للثقافات إعادة برمجة المستمدة DF1 تحصد والملون باستخدام نفس علامات من يوم 9-17 (D9 إلى D17) بعد تنبيغ. قبل التحليل، وreseeded الثقافات في يوم 7. تظهر المؤامرات دوت 8000 singlets ل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تتبع إعادة برمجة حركية عن طريق قياس مجموع التقاء. (A) في الوقت الحقيقي طmaging من BJ الليفية إعادة برمجة مع الفيروسات سينداي في ظل ظروف خالية من التغذية. واتخذت صورة النقيض من المرحلة من نفس المستعمرات في يوم 7-19، ثم في يوم 21 مع تلطيخ إضافي لCD44 وSSEA4، هيئة تنظيم الاتصالات 1-60 أو أب. يتوافق شريط النطاق إلى 400 ميكرون (B) الكمي من إجمالي التقاء (الطوري)، وإعادة برمجة تقدم من البذر في يوم 7 إلى يوم 21. مجموع التقاء في يوم 21 ومقارنة SSEA4، هيئة تنظيم الاتصالات 1-60 وAP إشارة التقاء ( قناة خضراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. تقييم إعادة برمجة حركية عن طريق قياس OCT4-GFP التقاء. (A) التصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الليفية المستمدة HESC-BG01v / خنزير برمجتها معسينداي الفيروسات في ظل ظروف خالية من التغذية. المرحلة النقيض من ذلك، مخضر ودمج وإنشاء الصور من نفس المستعمرات في يوم 7 إلى 19. مقياس شريط يتوافق مع 400 ميكرون (B) الكمي من إجمالي التقاء (الطوري) والتقاء-OCT4 GFP (قناة خضراء) كما تقدم برمجة من إعادة البذر في يوم 7 إلى يوم 21. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين [RHQ، JSTA، KS، و UL] هم موظفون من الحرارية فيشر العلمية، التي تنتج بعض الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Acknowledgments

الكتاب أشكر تشاد ماك آرثر لإجراء مناقشات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 113، إعادة برمجة، والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة، والتصوير في الوقت الحقيقي، التدفق الخلوي، المحفزة علامات الخلايا الجذعية، وقياس الحركية
الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J.,… More

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter