Summary
Het protocol in dit onderzoek beschrijft werkwijzen voor de real-time monitoring herprogrammering progressie via de kinetische meting van positieve en negatieve pluripotente stamcel markers gebruikt flowcytometrie analyse. Het protocol bevat ook de imaging-gebaseerde beoordeling van de morfologie, en merker of reporter expressie tijdens iPSC generatie.
Introduction
-Patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn veelbelovende instrumenten voor celtherapie en drug discovery. Zij een autologe bron van cellen voor de therapie. Bovendien, ze omvatten een zeer brede reeks genetische achtergronden, waardoor een gedetailleerde in vitro analyse van genetische ziekten dan huidige embryonale stamcel (ESC) lijnen mogelijk maken. Recente ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende methoden voor het genereren iPSCs, waaronder herprogrammering met Sendai-virus, episomale plasmiden of mRNA 1,2. Met name worden verschillende herprogrammering methoden in verband met verschillende niveaus van efficiëntie en veiligheid, en zullen waarschijnlijk verschillen op andere manieren hun geschiktheid van invloed zijn voor diverse toepassingen. Met de beschikbaarheid van een verscheidenheid aan technologieën herprogrammering, is het belangrijk geworden om methodologieën voor herprogrammering te ontwikkelen. De meeste bestaande werkwijzen vertrouwen op de kwalitatieve controle van de morfologie of vlekkenmet stamcel-specifieke kleurstoffen en antilichamen. Een recent ontwikkelde methode maakt gebruik van lentivirale fluorescentie reporters die gevoelig PSC-specifieke miRNAs of gedifferentieerde cel-specifieke mRNAs 3 zijn. Dergelijke controlemethoden vergemakkelijken van de selectie en de optimalisering van herprogrammering technieken voor verschillende situaties. Bijvoorbeeld is CDY1 gebruikt als een fluorescente probe te vroeg iPSCs om te screenen op modulators 4 herprogrammering. Het waarnemingsvermogen wensen herprogrammering experimenten is ook essentieel voor een beter begrip van het proces zelf. Zo is nu bekend dat bepaalde somatische celtypen zijn gemakkelijker te herprogrammeren anderen dan 5, en dat cellen doorlopen tussenfasen in herprogrammeren 6-8. Helaas, de onderliggende mechanismen herprogrammeringsproces nog niet volledig begrepen en derhalve de exacte verschillen tussen herprogrammering methoden ook nog worden defined. Zo methoden voor monitoring, evaluatie, en het vergelijken van herprogrammering gebeurtenissen blijven van cruciaal belang voor het veld stamcellen te zijn.
De in dit protocol beschreven werkwijzen maken de controle en beoordeling van de herprogrammeringsproces en laten zien hoe deze technieken kunnen worden gebruikt om verschillende reeksen herprogrammering reagentia vergelijken. De eerste benadering houdt flowcytometrie geanalyseerd met behulp van combinaties van antilichamen tegen positieve en negatieve pluripotente stamcellen (PSC) markers. De tweede benadering koppels real-time beeldvorming en de meting van de totale samenloop (het percentage oppervlak bedekt door de cellen) en de samenvloeiing van marker-signalen (het percentage oppervlak bedekt door de fluorescerende signalen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.Solution en Medium Voorbereiding
- Basement Membrane Matrix (gezuiverd van Engelbreth-Holm-Swarm Tumor)
- Langzaam ontdooien de basaalmembraan matrix (5 ml) op ijs bij 4 ° C overnacht.
- Verdun de voorraadoplossing 1: 1 met 5 ml ijskoud, steriel DMEM / F-12 medium in een steriele, voorgekoeld 15 ml conische buis. Verdeel hoeveelheden in vooraf gekoelde, steriele 1,5 ml microcentrifuge buizen en onmiddellijk opgeslagen bij -20 ° C.
- Voorafgaand aan gebruik, ontdooien de bevroren 1: 1 basaalmembraan matrix monster overnacht bij 4 ° C. Op het moment van gebruik, verdun het 1: 1 aliquot nog 50 maal met ijskoud, steriel DMEM / F-12 medium tot een uiteindelijke verdunning van 1: 100.
- Voeg de juiste hoeveelheid van het 1: 100 verdund basaalmembraan matrix oplossing voor de juiste weefselkweek (TC) schepen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Gewoonlijk gebruikt 3 ml van de verdunde basaalmembraan matrix oplossing voor het bekleden van een schotel TC of 20 cm 2 oppervlakte, laag alle andere soorten TC borden / platen bij een verhouding van 0,15 ml verdund matrix per cm 2 oppervlakte. Zuig de resterende oplossing voor de toevoeging van elke cultuurmedium en cellen.
- fibroblast Medium
- Ontdooi een flesje 100 ml ES gekwalificeerd foetaal runderserum (ES-FBS) bij 4 ° C overnacht.
- Voeg 50 ml van de ontdooide ES-FBS en 5 ml MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (1x) tot 445 ml DMEM medium. Steriliseer de gecombineerde componenten door een 0,22 urn filter en bewaar het medium bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
- iMEF Medium
- Ontdooi een flesje 100 ml ES-FBS bij 4 ° C overnacht.
- Voeg 50 ml van de ontdooide FBS, 5 ml MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (1x) en 500 pl 2-mercaptoethanol tot 445 ml DMEM medium.
- Steriliseer de gecombineerde componenten door een 0,22 pm filter en op te slaan medium bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
- Basische fibroblastgroeifactor oplossing (b-FGF)
- Voeg 10 ul van Serum Vervanging tot 990 gl D-PBS en meng door en neer te pipetteren.
- Voeg 1 ml van de 1% (v / v) oplossing Serum Vervangende een flesje van 10 ug gelyofiliseerd b-FGF. Meng door zachtjes en neer te pipetteren.
- Aliquot de 10 ug / ml b-FGF oplossing in 200 gl aliquots in micro-centrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig tot 4 weken.
- Humane pluripotente stamcellen (HPSC) Medium
- Ontdooi een flesje 100 ml Serum Vervanging bij 4 ° C overnacht.
- Voeg 100 ml van de ontdooide Serum vervanging, 5 ml MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (1x) en 500 pl 2-mercaptoethanol tot 395 ml DMEM / F-12 medium.
- Steriliseer de gecombineerde componenten door een 0,22 urn filter en bewaar het medium4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
- Op het moment van gebruik, pre-warm de HPSC medium tot 37 ° C en aangevuld met 4 ng / ml bFGF.
- iMEF geconditioneerd medium (CM)
- Voeg 18 ml 0,1% gelatine aan een T-175 kweekfles en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Verwijder de 0,1% gelatineoplossing na één uur incubatie. Voeg 9,1 x 10 6 mitotisch geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (iMEF) in 45 ml iMEF medium en incubeer in de 37 ° C incubator gedurende de nacht.
- Na overnacht incubatie, verwijder de oude iMEF medium en eenmaal wassen met 25 ml D-PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireren van de D-PBS te wassen en voeg 90 ml voorverwarmde HPSC medium, gesupplementeerd met 4 ng / ml bFGF. Incubeer in de 37 ° C incubator gedurende exact 24 uur.
- Na 24 uur incubatie, aseptisch verwijder de HPSC medium uit de iMEF kolf en steriliseer door een 0,22 pm filter. Aliquot in 50 ml conische buizen en bevriezen bij -20 ° C totdat het nodig is. iMEF CM kunnen worden bewaard tot 6 maanden bij -20 ° C.
- Voeg nog 90 ml voorverwarmde HPSC medium aangevuld met 4 ng / ml bFGF de iMEF kolf. Incubeer in de 37 ° C incubator gedurende exact 24 uur. Herhaal het oogsten van CM maximaal 7 dagen.
- Op het moment van gebruik, pre-warm de iMEF-CM tot 37 ° C en aangevuld met 4 ng / ml bFGF.
- E8 Medium
- Ontdooi een 10 ml E8 supplement bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Verwijder 10 ml van het E8 basismedium en aseptische wijze de inhoud van de ontdooide E8 aanvulling op de resterende basismedium. Meng goed en steriliseer door een 0,22 pm filter. Bewaar de compleet medium bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
- Op het moment van gebruik, pre-warm de hoeveelheid van het te gebruiken medium tot kamertemperatuur. Het is niet aan te raden om vooraf warm E8 Medium tot 37 ° C.
- Cell Zorting Buffer
- Vers bereid sortering buffer vlak voor celsortering door het toevoegen van EDTA (1 mM eindconcentratie), HEPES buffer (25 mM eindconcentratie) penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml eindconcentratie) en runderserumalbumine (1% eindconcentratie) in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (Calcium en magnesium vrij).
- Steriliseer het buffer door een 0,22 urn filter vóór gebruik.
- Celsortering Recovery Medium
- Wijzigen 50 ml van fibroblast Medium door toevoeging penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml uiteindelijke concentratie) en Rock Inhibitor Y-27632 (10 uM uiteindelijke concentratie). Voorverwarmen dit medium tot 37 ° C vóór de gesorteerde cellen zaaien.
2. Sendai Mediated herprogrammeren van menselijke fibroblasten
- 24 uur voorafgaand aan transductie met het Sendai virus, zaad fibroblasten bij een dichtheid van 2 x 10 5 cells per putje in de gewenste putjes van een 6-well TC plaat.
- Voer de transductie op dag 0 als volgt.
- Pre-warm 2 ml van fibroblast Medium in een 37 ° C waterbad. Verwijder een set van Sendai virus buizen van -80 ° C opslag en ontdooien elke buis een voor een door eerst de bodem van de buis onder te dompelen in een 37 ° C waterbad gedurende 5-10 sec, en verwijder vervolgens de buis uit het water bad en laat het ontdooien bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, centrifuge kort de buis en plaats het meteen op ijs.
- Commercieel tweede generatie Sendaivirussen door toevoeging van de juiste hoeveelheden (volgens de COA) voor elk van de buizen om de volgende multipliciteit van infectie (MOI) bereiken 1 ml voorverwarmde fibroblast medium per putje worden getransduceerd als volgt : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
- Meng de virale oplossing door pipetteren het mengsel zachtjes op en neer. compleTÉ de volgende stap binnen 5 min.
- Zuig het Fibroblast medium uit de bron van de fibroblasten te herprogrammeren, en voeg 1 ml van de virale oplossing in elk putje. Plaats de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en incubeer overnacht.
- Na incubatie gedurende de nacht, te zuigen uit de transductie medium en gooi de oude medium behoren (10% bleekwater oplossing voor 30 min). Vervangen door 2 ml voorverwarmde fibroblast medium en verder kweken de getransduceerde cellen.
- Kweken van de cellen gedurende nog 6 dagen, ter vervanging van de oude medium met verse fibroblast medium elke andere dag.
Let op: Niet passage van de cellen geherprogrammeerd tot 7 dagen na de transductie. - Dag 6: Bereid Gerechten voor iPSC Generation
- Voor feeder-afhankelijke iPSC generatie, voeg 1,5 ml 0,1% gelatine-oplossing in elk putje van een 6-well weefselkweek (TC) schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Verwijder de 0,1% gelatine zolutie na 1 uur incubatie. Voeg 3 x 10 5-mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (iMEF) in 2 ml iMEF medium per putje en incubeer in de 37 ° C incubator gedurende de nacht.
- Voor feeder-onafhankelijke iPSC generatie, voeg 1,5 ml verdunde basaalmembraan matrix (1: 100 verdunning) aan elk putje van een 6-well weefselkweek (TC) schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Zeven dagen na transductie, de oogst van de getransduceerde fibroblasten en re-plaat ze op de pre-en-klare gerechten voor cultuur iPSC kolonie generatie.
- Aspireren van de normale kweekmedium van de fibroblasten en was de cellen eenmaal met 2 ml D-PBS.
- Aspireren van de D-PBS te wassen en voeg 0,5 ml voorverwarmde 0,05% trypsine / EDTA. Incubeer de cellen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.
- Wanneer de cellen op afgeronde, voeg 2 ml voorverwarmde fibroblast medium in elk putje om trypsine te stoppen. Los van de cellen uit de put door voorzichtig pipetteren tHij medium over het oppervlak van de schaal. Verzamel de celsuspensie in een 15 ml conische centrifugebuis.
- Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml vers voorverwarmde Fibroblast Medium.
- Tel de cellen met behulp van de gewenste methode (hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter) en het zaad van de pre-bereide gerechten met 5 x 10 4 cellen voor feeder-afhankelijke omstandigheden en 1 x 10 5 cellen voor de feeder-onafhankelijke omstandigheden, per putje van een 6 -well schotel en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende de nacht.
- Na de incubatie overnacht, verander de middellange tot HPSC medium, E8 medium of iMEF-geconditioneerde media, afhankelijk van de toepassing. Vervang de oude medium met vers medium elke dag daarna.
3. Sendai herprogrammeren van BGO1v hOct4-GFP Reporter menselijke embryonale stamcellen (hESC) Afgeleid Secondary fibroblasten
- derive secundaire humane fibroblasten uit de BG01v hOct4-GFP reporter hESC lijn volgens de eerder beschreven procedure 9.
- Twee dagen voor transductie, plaat BGO1v / HOG afgeleid fibroblasten in twee putjes van een 6-well plaat bij 2 x 10 5 cellen per putje, met behulp van Fibroblast Medium.
- Op de dag van transductie, voorverwarmen 2 ml Fibroblasten medium tot 37 ° C.
- Verwijder een set van Sendai buizen uit de -80 ° C opslag. Verwijder de flesjes uit de zak en ontdooien elke buis een voor een door eerst de bodem van de buis ondergedompeld in een 37 ° C waterbad gedurende 5-10 seconden, waarna de buizen mogelijk te ontdooien bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, centrifuge kort de buis en plaats het meteen op ijs.
- Voeg de aangegeven hoeveelheden van elk van de drie buizen Sendai (zie CoA voor het juiste volume) tot 2 ml fibroblast medium, voorverwarmd tot 37 ° C en de virale oplossing goed te mengen door en neer te pipetteren. Voltooi de volgende step binnen 5 min.
Noot: Voor dit experiment een MOI van 5: 5: 6 werd gebruikt. - Zuig het medium van de Fibroblast putjes van fibroblasten worden getransduceerd. Voeg 1 ml van de virale suspensie overgebracht in twee putten worden getransduceerd. Plaats de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en incubeer overnacht.
- Na overnacht incubatie, verwijder de transductie medium en gooi het naar behoren (10% bleekwater oplossing voor 30 min). Elk putje vervangen met 2 ml voorverwarmde fibroblast medium en verder kweken de getransduceerde cellen.
- Kweken van de cellen gedurende nog 6 dagen, het veranderen van de oude medium met verse fibroblast medium elke andere dag.
- Zeven dagen na transductie, de oogst van de getransduceerde fibroblasten en re-plaat ze op de pre-en-klare gerechten voor cultuur iPSC kolonie generatie.
- Aspireren van de normale kweekmedium van de fibroblasten en was de cellen eenmaal met 2 ml D-PBS.
- Aspireren van de DPBS wassen en voeg 0,5 ml voorverwarmde 0,05% trypsine / EDTA. Incubeer de cellen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.
- Wanneer de cellen op afgeronde, voeg 2 ml voorverwarmde fibroblast medium in elk putje om trypsine te stoppen. De cellen los van de put door voorzichtig pipetteren het medium over het oppervlak van de schaal. Verzamel de celsuspensie in een 15 ml conische centrifugebuis.
- Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 2 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid verse, voorverwarmde Fibroblasten Medium.
- Tel de cellen met behulp van de gewenste methode (hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen).
- Zaad de getransduceerde cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen per putje van een basaalmembraan matrix gecoate 6-well plaat en geïncubeerd in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende de nacht.
- Na de incubatie overnacht, wijzigt de middellange tot geconditioneerd medium iMEF, aangevuld met 10 ng / ml b-FGF. Vervang de oude medium met verse iMEF CM elke dag daarna.
- Drie weken na de transductie, mechanisch ontleden en de gewenste kolonies overdragen voor klonale uitbreiding of te gebruiken voor analyse.
4. Live-cell imaging van fibroblast herprogrammeren
- Real-time monitoring
- 7 dagen na transductie met het Sendai herprogrammering kit, zaden de gewenste hoeveelheid cellen op 6-putjes met het gewenste medium matrixsystemen zoals eerder beschreven. Plaats de geënte schotelsbinnenkant de imager, in een bevochtigde incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2.
- Stel de imaging software om hele goede foto's van elk individu en op een vast interval vast te leggen (elke 6-8 uur) ononderbroken vastleggen van het beeld voor de komende 14 dagen volgens het protocol van de fabrikant van.
Opmerking: Het beeld van Phase contrast instellingen zijn geselecteerd voor de normale herprogrammering om kolonie progressie te evalueren. In het gevalvan BG01v / Hog afgeleid fibroblast herprogrammering, is het het beste om afbeeldingen in fase contrast en in het groen fluorescerend kanaal als de reactivering van de endogene OCT4-GFP reporter gehele herprogrammeringsproces kan worden gevolgd vangen. - Verander het medium dagelijks kan HPSC medium, E8 medium of iMEF-CM, afhankelijk van het experiment zoals eerder beschreven vanaf dag 8-21 na transductie. De putjes kunnen verder worden geanalyseerd op kolonievorming middels indirecte immunofluorescentie.
- Na afloop van het experiment op dag 19 tot 21, verwijdert het kweekmedium uit elk putje worden onderzocht met antilichamen voor fibroblast en stamcel markers keuze.
- Was elke well eenmaal met 2 ml voorverwarmde DMEM / F-12 medium.
- Aliquots van elk positief / negatief primair antilichaam paren in 1 ml DMEM / F-12 medium als volgt: anti-muis SSEA4 (1: 200) en anti-rat CD44 (01:50), anti-muis-TRA 1- 60 (1: 200) en anti-rat CD44 (01:50) en alkalisch fosfatase Live Stain (01:50) en anti-rat CD44 (01:50). Voeg 1 ml primaire antilichaam oplossingen voor elke overeenkomstige put. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten.
- Aspireren van de primaire antilichaamoplossing en tweemaal wassen met voorverwarmd DMEM / F-12 medium.
- Bereid secundair antilichaam-oplossingen (1 ml voor elk putje) met behulp van geit-anti-muis Alexa Fluor 488 geconjugeerde secundaire (1: 500) voor groene fluorescentie en geiten-anti-rat Alexa Fluor 594 geconjugeerde secundaire (1: 500) voor rode fluorescentie in DMEM / F-12 medium. Voeg toe aan elk putje na de laatste wasbeurt. Incubeer de secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: Door alkalische fosfatase live Stain's (APLS) voorbijgaand signaal moet de eerste incubatie anti-CD44 eerst uitgevoerd op zichzelf en de APLS worden toegevoegd op het moment van incubatie met de secundaire antilichamen - Na de tweede antilichaam incubatie zuigen uit de oplossing en tweemaal wassen met DMEM / F-12 medium. Voeg frisse voorverwarmde DMEM / F-12medium aan elk putje voorafgaand aan de definitieve beeld vast te leggen.
- Zet de imager software om hele goede afbeeldingen van elk putje met behulp van alle drie de scanparameters te verwerven: fase contrast, groene fluorescentie en rode fluorescentie. Maak foto's bij diverse vergrotingen en creëren time-lapse filmpjes met de software om de groei en de marker expressie te controleren. Gebruik protocol van de fabrikant.
- Gebruik makend van de analyse software, evalueren samenvloeiing van de put na verloop van tijd in fase contrast en groen fluorescerend eenheden voor BG01v / HOG herprogrammering.
- Monitoring herprogrammeren Intermediates behulp celoppervlaktemerkers
- Monitor herprogrammering evenementen op verschillende tijdstippen door sonderen van de herprogrammering gerechten op verschillende tijdstippen met antilichamen tegen verschillende stamcel positieve / negatieve markers om de herprogrammering te monitoren. Probe culturen om de 2 tot 3 dagen afhankelijk van de beschikbaarheid van duplo's. Probe de herprogrammering dishes op dag 19 tot 21 met de duale kleuring strategie volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies en gedeeltelijk reprogrammed kolonies basis van de kleurpatronen identificeren.
- Op het gewenste tijdstip, zuigen op de normale kweekmedium uit elk putje worden onderzocht met antilichamen voor merkers van keuze.
- Was elke well eenmaal met 2 ml voorverwarmde DMEM / F-12 medium.
- Aliquots van elk positief / negatief primair antilichaam paren in 1 ml DMEM / F-12 medium als volgt: SSEA4 geconjugeerd aan de groene fluorescerende fluorofoor (1: 200), TRA-1-60 geconjugeerd aan de groene fluorescerende fluorofoor (1: 50), alkaline Levende Stain (1: 500), CD24 geconjugeerd aan een groen fluorescerend fluorofoor (01:50), B2M geconjugeerd aan een groen fluorescerend fluorofoor (01:50), EpCAM geconjugeerd aan een groen fluorescerend fluorofoor (01:50) , muis CD73 (1: 100), die werd onderzocht met anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd aan een groen fluorescerend fluorofoor (1: 500), en rat CD44 (01:50) dat geprobed metanti-rat secundair antilichaam geconjugeerd aan de fluorescerende fluorofoor (1: 500). Voeg 1 ml primaire antilichaam oplossingen voor elke overeenkomstige put. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten.
- Aspireren van de primaire antilichaamoplossing en tweemaal wassen met voorverwarmd DMEM / F12 medium.
- Voor niet-geconjugeerde antilichamen, gaat het gebruik van een 2-staps werkwijze van het bereiden van het geschikte secundaire antilichaam oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Controleer of secundaire antilichamen zijn aan de primaire gastheren en niet oversteken reageren. Voer extra wasstappen zoals eerder beschreven.
- Na de nodige wast, voeg verse voorverwarmde DMEM / F-12 medium aan elk putje voorafgaand aan de definitieve beeld vast te leggen.
- Vastleggen van de tl-beelden onder de juiste filter bij 100X vergroting met behulp van een fluorescentiemicroscoop en analyseren van de beelden met behulp van beschikbare analysesoftware.
5. Meting van herprogrammeren Kinetics gebruik van Flow Cytometry
- Kwantitatieve Kinetic Meting van herprogrammeren gebruik van celoppervlak Antilichamen
- Voorafgaand aan de herprogrammering, het opzetten van de juiste aantal herprogrammering experimenten voor elk tijdstip. Voor het meten van kinetiek van herprogrammering van de eerste 7 dagen van herprogrammering, worden individuele transductie uitgevoerd voor elk gewenst tijdstip. Voor tijdstippen na dag 7, zaad voldoende feeder-onafhankelijke tijd punten te gaan met de herprogrammering gebeurtenissen te meten. Een enkel putje van een 6-wells plaat voldoende hoeveelheden cellen verkregen voor het uitvoeren van flowcytometrie analyse.
- Meet de gewenste herprogrammering tijdstippen van afzonderlijke putjes, aangezien dit een eindpunt assay. Zuig uit de fibroblast Medium uit de put gewenst. Was eenmaal met D-PBS.
- Aspireren van de D-PBS wassen. Voeg 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA-oplossing om de put te testen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Na de incubatie dissociat de cellen in enkele cellen door het spoelen van de 1 ml celsuspensie tegen het oppervlak van de put en breng de suspensie in een 15 ml conische buis. Gebruik 3 ml D-PBS om alle resterende cellen af te wassen uit de put en voeg ze toe aan de 15 ml conische. Gebruik 10 ml extra D-PBS de cel oplossing in de conische buis verder te verdunnen.
- Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml DMEM / F-12 medium. Voer een celtelling zolang tot een standaard celsuspensie die kleiner is dan 1 x 10 6 cellen / ml te maken.
- Bereid een aliquot van positieve / negatieve direct geconjugeerde antilichamen keuze in 1 ml DMEM / F-12 medium voor minder 1 x 10 6 cellen / ml met de volgende combinaties: SSEA4 geconjugeerd aan een groen fluorescerend fluorofoor (1: 200) met CD44 geconjugeerd aan PE-Cy5 of CD44 geconjugeerd aan een groen fluorescerend fluorofoor en SSEA4 geconjugeerd aan een ver-rode fluorescerende fluorofoor. Incuberende antilichamen met de celsuspensie gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het primaire antilichaamoplossing en tweemaal wassen met voorverwarmd DMEM / F-12 medium.
- Zuig het uiteindelijke wassen en resuspendeer de celpellet in 1 ml D-PBS. Pipet de inhoud van elk suspensie in afzonderlijke FACS buizen.
- Met behulp van de juiste negatieve controles (ongekleurd en isotype controles), bevestigen de juiste voorwaartse en zijwaartse verstrooiing profiel en spanningen op de cytometer. Stel de spanningen voor de overeenkomstige fluoroforen volgens de eerste enkele vlek parameters, zodat de groene fluoroforen worden geactiveerd door de blauwe laser en signalen verkregen in de BL1 kanaal, terwijl veel rode fluorescerende fluorofoor en PE-Cy5 fluorofoor worden geactiveerd door de rode laser en signalen verworven in de RL1 kanaal. Het verwerven van de dual-gekleurde populatie voor elk tijdstip.
- Analyseer de FCS bestanden voor elk tijdstip met de juiste analysesoftware en gebruik de editor ARRANSE gegevens aan de bevolking uitdrukking verschuiving in de tijd te observeren.
- Volg de stappen 5.1.1 tot 5.1.6, indien celsortering gewenst is op verschillende tijdstippen. Met de geschikte fluorofoor combinaties volgens de configuratie van de laser celsorteerinrichting te gebruiken.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cel pellet in 1 ml van de cel sortering buffer. Stel de cel sorter om de juiste voorwaartse en zijwaartse verstrooiing instellingen met behulp van een onbevlekte controle. Gebruik de enkele-lood controles om het opzetten van de juiste instellingen voor elke fluorofoor.
- Gebruik een kleine steekproef van de dubbel-gekleurde celsuspensie; selecteer de 2 bevolking te sorteren en wijs de desbetreffende kosten voor de inning van de gesorteerde cellen te waarborgen.
- Voeg 200 ul van de cel herstel medium in de verzamelbuizen zodat de gesorteerde celsuspensie wordt opgevangen en beschermd op het moment van het sorteren. Oogst de wens aantal cellen en overzetten naar nieuwe iMEF gerechten met versly bereid herstel medium.
- Verander het medium volgende nacht incubatie met het herstel medium. De kweken moet vervolgens worden gevoed en routinematig gepasseerd behulp HPSC medium met penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml uiteindelijke concentratie).
6. Endpoint Analyse
- Terminal alkalisch fosfatase (AP) kleuring
- Gebruik terminal chromogene AP vlekken te correleren waargenomen kinetische en morfologische evenementen met uiteindelijke herprogrammering efficiëntie.
- Na 21 dagen herprogrammering, verwijder het kweekmedium uit de put te worden gemerkt met terminale AP vlek en eenmaal wassen met 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
- Bereid de geschikte hoeveelheid kleuroplossing zoals aangegeven door handleiding van de fabrikant in 200 mM Tris-HCl.
- Zuig het wassen en voeg 2 ml van de bereide kleurstofoplossing aan elk putje. Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur en weg van the licht.
- Zuig het kleuroplossing en eenmaal wassen met 200 mM Tris HCl. Verwijder het wassen en voeg gedistilleerd water voorafgaand aan de visualisatie.
- Leg de colorimetrische signaal met behulp van een normaal beeld camera. Tel het aantal positief gekleurde kolonies met de hand. Visualiseer de vlek met fluorescerende analyse in het Trit-C-kanaal, als de vlek is ook fluorescerende in de natuur en het uitvoeren van hele en imaging en geanalyseerd met behulp van de hele goed imager. Gebruik protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monitoring herprogrammeren Kinetics Met behulp van flowcytometrie
CD44 is een fibroblast marker terwijl SSEA4 is een PSC marker 6,10. Zoals verwacht van dit expressiepatroon flowcytometrie BJ fibroblasten toont een SSEA4 - CD44 + populatie die de creatie van kwadrant poorten maakt in combinatie met de ongekleurde monster. Tijdens de herprogrammering van DF1 fibroblasten met de Sendai virussen, wordt CD44 verloor terwijl SSEA4 langzaam wordt uitgedrukt. Op dag 3 na transductie met Sendaivirussen, is er een grote populatie van SSEA4 - CD44 + cellen en een kleine populatie van SSEA4 + CD44 + cellen die duidelijker op dag 7 (Figuur 1) wordt. Op dag 13, de dubbel-positieve populatie overgangen naar de SSEA4 + CD44 - staat. Op dag 17, een groot percentage van het ceLLS in cultuur zijn al SSEA4 + CD44 -. Dit tijdsverloop toont dat flowcytometrie met CD44 en SSEA4 kan worden gebruikt om de voortgang en snelheid van herprogrammering controleren.
Een kwantitatieve vergelijking bevestigt dat herprogrammering BJ fibroblasten met Sendai virus herprogrammering genereert SSEA4 + CD44 - cellen bij een andere snelheid dan herprogrammering van BJ fibroblasten (Figuur 2A). De gegevens tonen dat een vroegtijdige vergelijking van het percentage PSC-achtige SSEA4 + CD44 - cellen volgt de progressie van herprogrammering. Interessant op dag 8 van DF1 fibroblast herprogrammering, sorteren en afzonderlijk kweken van de populatie van cellen die in het proces van het opwaarts reguleren SSEA4 en neerwaarts reguleren CD44 genereert AP + kolonies 11 (figuur 2B). In tegenstelling, de oorspronkelijke SSEA4 - CD44 + populatie genereert amuch kleiner aantal AP + kolonies op dag 21 van herprogrammering, die de typische dag van kolonie uiteindelijke analyse. Dit suggereert dat het mogelijk is te kwantificeren en vergelijk de overgang populatie om verschillen in kinetiek herprogrammering nog voordat de SSEA4 + CD44 voorspellen - populatie wordt gevormd. Een belangrijk punt hier op te merken dat herprogrammering een variabel proces afhankelijk van verschillende factoren zoals het starten somatische celpopulatie transductie efficiëntie, medium, etc. Echter het algemene patroon en de progressie van het hierboven beschreven oppervlaktemarkers consistent tussen verschillende herprogrammering experimenten en vanaf fibroblasten. De analyse van herprogrammering kinetiek kan ook gedaan worden met verschillende markers, zoals de nieuw geïdentificeerde negatieve PSC markers CD73 en B2M 6, alsmede de vastgestelde PVC markers CD24 en EpCAM 12,13 14,15. Net als bij CD44, CD73 en B2M worden uitgedrukt in parentele BJ fibroblasten, maar zijn downregulated in de loop van de herprogrammering, worden niet op te sporen in een volledig opnieuw geprogrammeerd iPSCs (figuur 3A). Een flowcytometrie tijdsverloop met behulp van CD44 en CD73 of CD44 en B2M toont aan dat CD44 en CD73 worden neerwaarts gereguleerd met een vergelijkbaar percentage, terwijl B2M sneller wordt neerwaarts gereguleerd dan CD44 (Figuur 3B). In beide gevallen, kan de snelheid van herprogrammering worden waargenomen door het meten van de accumulatie van dubbele negatieve populatie. In tegenstelling tot deze negatieve PSC markers, CD24 en EpCAM afwezig in fibroblasten en worden uitgedrukt in iPSCs (figuur 3A). In een flowcytometrie tijdsverloop, CD24 - CD44 + en EpCAM - CD44 + fibroblasten vormen uiteindelijk dubbel-negatieve populaties die later de overgang naar CD24 + CD44 - en EpCAM + CD44 - PSC-achtige cellen, respectievelijk (Figuur 3B). Zo werden, tijdens het herprogrammeren, zowel positieve PSC markersworden uitgedrukt na CD44 wordt neerwaarts gereguleerd. Vergelijkbaar met wat werd waargenomen met SSEA4 en CD44, de vorming en accumulatie van de verschillende celpopulaties geven de progressie van herprogrammering.
Tracking herprogrammeren behulp van real-time beeldvorming Analyse
Real-time imaging herprogrammeren kweken na inzaaiing toont de geleidelijke vorming van kolonies (Figuur 4A), wat overeenkomt met een logaritmische toename confluentie onder fasecontrast (figuur 4B). Confluence onder fase contrast geeft dus een andere maatstaf voor het toezicht op herprogrammering kwantitatief, maar het omvat zowel de kolonies die positief voor PSC markers en de voortdurende toename van het aantal unreprogrammed of gedeeltelijk geherprogrammeerd cellen (Figuur 4A, laatste paneel) zijn. Kwantificeren van de gebieden die zijn gekleurd voor pluripotentie markersTRA-1-60, SSEA4 en AP 6,10 op dag 21 aan dat iPSCs vertegenwoordigen slechts minder dan de helft van de totale samenvloeiing (figuur 4B). Om de voortgang van herprogrammering stringenter te meten, is het mogelijk om een reporter telefoonlijn voor herprogrammering. Hier werden secundaire fibroblasten gegenereerd uit de BG01v / hog ESC lijn, die is ontworpen met een OCT4-GFP reporter 16. GFP wordt uitgedrukt als de cellen worden geprogrammeerd en als kolonies gevormd (Figuur 5A). Meten confluentie onder fasecontrast en groene kanalen aantoont dat het GFP samenvloeiing langzamer toeneemt dan de totale samenvloeiing, en de GFP confluentie op dag 19 minder dan de helft van de totale samenvloeiing (figuur 5B), die doet denken aan TRA-1-60, SSEA4 en AP vlekken op dag 21.
Figuur 1. Monitoring van de voortgang van herprogrammeren Met behulp van flowcytometrie. Flowcytometrie Dot Plots voor DF1 fibroblasten geprogrammeerd met Sendai Virussen onder Feeder-vrij voorwaarden. De cellen werden geoogst en gekleurd met SSEA4 en CD44-antilichamen op verschillende tijdstippen van de dag 3 (D3) op Dag 19 (D19) van de herprogrammering proces. Culturen op dag 9 (D9) verder werden geanalyseerd nadat de cellen op dag 7 (D7) werden reseeded. Dot plots tonen 8.000 singlets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2. Het evalueren herprogrammeren Kinetics en efficiëntie in het kader van Feeder-vrij Voorwaarden (A) Grafiek met veranderingen in het percentage van SSEA4 + CD44 - geherprogrammeerd cellen na transducerende DF1 fibroblasts en BJ fibroblasten met Sendai virus. Cellen werden geanalyseerd met stroomcytometrie op dag 3-19 na transductie met kweken op dag 9 vanaf ondergaan inzaaiing op dag 7 (B) Pseudo-color flowcytometrie percelen voor DF1 getransduceerde cellen Sendai virus en gekleurd met SSEA4 en CD44 antilichamen. SSEA4 -. CD44 + cellen (zwarte cirkel) en SSEA4 + cellen (rode cirkel) werden gesorteerd op dag 8 en mag groeien tot Dag 19 voor kleuring voor alkalische fosfatase (rood) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Observing herprogrammeren Kinetics van Feeder-vrije culturen gebruik van verschillende positieve en negatieve PSC Markers. (AD) Levende kleuringDag-18 DF1-afgeleide herprogrammering culturen met behulp van antilichamen voor de positieve PSC markers CD24 en EpCAM en negatieve PSC markers CD44, CD73 en B2M. De bovenste panelen samenvoegen van de groene en rode fluorescentie kanalen, terwijl de onderste panelen ook beeld van de fase contrast bevatten. De schaal bar vertegenwoordigt 200 urn. (E) Flowcytometrie dot percelen voor DF1-afgeleide herprogrammering culturen geoogst en gekleurd met behulp van dezelfde markers van dag 9-17 (D9 tot D17) post-transductie. Voorafgaand aan de analyse werden de kweken opnieuw uitgezet op dag 7. Dot plots tonen 8.000 singlets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Tracking herprogrammeren Kinetics door het meten van Total Confluence. (A) Real-time imaging van BJ fibroblasten geprogrammeerd met Sendai virussen onder feeder-vrije omstandigheden. Fasecontrastbeelden van dezelfde kolonies werden op dag 7 tot 19, dan op dag 21 met extra kleuring voor CD44 en SSEA4, TRA-1-60 of AP. Schaal balk komt overeen met 400 pm. (B) Kwantificering van de totale samenloop (fase contrast) als herprogrammering vordert van inzaaiing op dag 7 tot dag 21. Totaal samenloop op dag 21 wordt vergeleken met SSEA4, TRA-1-60 en AP signaal samenvloeiing ( groene kanaal). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Het beoordelen herprogrammeren Kinetics door het meten van OCT4-GFP Confluence. (A) Real-time beeldvorming van BG01v / HOG hESC-afgeleide fibroblasten geherprogrammeerd metSendai virussen onder feeder-vrije omstandigheden. Fasecontrast, groene fluorescentie en samengevoegd beelden van dezelfde kolonies werden gegenereerd op dag 7 tot 19. Schaalbalk komt overeen met 400 pm. (B) Kwantificering van de totale confluentie (fasecontrast) en OCT4 GFP-confluentie (groene kanaal) als herprogrammering vordert van re-zaaien op dag 7 tot dag 21. klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs [RHQ, JSTA, KS, en UL] zijn medewerkers van Thermo Fisher Scientific, die enkele van de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.
Acknowledgments
De auteurs danken Chad MacArthur voor nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
- Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
- Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
- Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
- Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
- Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
- Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
- Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
- Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).
