हम एक मजबूत जीन प्रतिस्थापन रणनीति का वर्णन आनुवंशिक रूप से मैल कवक Ustilago maydis हेरफेर करने के लिए। इस प्रोटोकॉल कैसे विलोपन म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए संक्रमण phenotypes जांच करने के लिए बताते हैं। यह एक दृश्य एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग एन्कोडिंग जोड़कर, किसी भी वांछित तरह, जैसे जीन संशोधित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
जीन विलोपन जीन समारोह का विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सबसे कारगर तरीकों एक लक्षित तरीके में जीन को बाधित करने का एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से एक चयन मार्कर के साथ पूरे जीन के प्रतिस्थापन है। मुताबिक़ पुनर्संयोजन के दौरान, डीएनए के आदान प्रदान के उच्च समानता के साथ दृश्यों के बीच जगह लेता है। इसलिए, रैखिक जीनोमिक लक्ष्य जीन flanking दृश्यों विशेष रूप से वांछित एकीकरण साइट के लिए एक चयन मार्कर को निर्देशित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विलोपन निर्माण के कुंद समाप्त होता सेल के डीएनए की मरम्मत सिस्टम को सक्रिय करने और जिससे या तो मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से या गैर मुताबिक़ के अंत में शामिल होने से निर्माण के एकीकरण को बढ़ावा देने। कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के साथ जीवों में सफल जीन विलोपन की दर 50% से अधिक इस रणनीति के लिए एक मूल्यवान जीन व्यवधान प्रणाली बनाने तक पहुँच सकते हैं। मैल कवक Ustilago maydis एक यूकेरियोटिक मॉडल ऐसे कुशल मुताबिक़ recombinat दिखा सूक्ष्मजीव हैआयन। इसकी 6,900 के बारे में जीनों में से कई कार्यात्मक विलोपन म्यूटेंट की मदद से विशेषता किया गया है, और जीन के आवश्यक कार्य पर जीन प्रतिस्थापन के प्रयास अंक की विफलता को दोहराया। फ्लोरोसेंट मार्करों या भविष्यवाणी डोमेन के परिवर्तन के साथ टैगिंग द्वारा जीन समारोह के बाद के लक्षण वर्णन भी मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से डीएनए एक्सचेंज पर निर्भर करता है। यहाँ, हम यू पेश विस्तार से maydis तनाव पीढ़ी रणनीति सरल उदाहरण, जीन विलोपन का उपयोग कर।
Ustilago maydis एक phytopathogenic मॉडल कवक है कि दशकों से 1,2 के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। यह दो morphologies, एक खमीर की तरह, गैर रोगजनक मंच और एक filamentous, संक्रामक फार्म 3 में मौजूद है। इस तरह के मुताबिक़ पुनर्संयोजन और डीएनए की मरम्मत तंत्र के रूप में यूनिवर्सल सफलता खोजों इस कवक 4 के खमीर की तरह विकास के चरण में किए गए थे। इसके अलावा, संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण संक्रामक रेशा और डाह कारकों के रूपात्मक स्विच अच्छी तरह से विशेषता रहे हैं 5,6। जीव विज्ञान और इस मैल कवक की डाह के बारे में बढ़ती आणविक ज्ञान एक सीधा जीन प्रतिस्थापन रणनीति 7-9 एक उत्कृष्ट जीनोम एनोटेशन 10 और का उपयोग कर रिवर्स आनुवंशिकी में आसानी, जैसे, हमारे संस्थान में अच्छी तरह से संगठित प्लाज्मिड संग्रह (http द्वारा समर्थित पर निर्भर करता है : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html)। मानकीकृत, मक्का रों में तेजी से संक्रमण assayseedlings pathogenicity का विस्तृत अध्ययन कारकों 11 अनुमति देते हैं।
यू के जीनोम maydis 6,900 के बारे में जीन 10 में शामिल है। उनके कार्य का अध्ययन करने के लिए, वे व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में एक कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन सिस्टम की वजह से हटाया जा सकता। पूरी तरह से समाप्त होता है मुताबिक़ युक्त बारे में 1 केबी का flanking क्षेत्रों में 50% से अधिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दरों के लिए आदर्श होते हैं, लेकिन गैर मुताबिक़ साथ समाप्त होता है पहले से ही 250 बीपी का निर्माण 9 का सही एकीकरण के कुछ डिग्री की अनुमति है। वर्तमान में, पाँच अलग अलग प्रतिरोध कैसेट, hygR, cbxR, NATR, G418R, और phleoR मध्यस्थता hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 और phleomycin के खिलाफ प्रतिरोध, transformants 7.9 के लिए चयन करने के लिए कार्यरत हैं। इसके अलावा, hygromycin प्रतिरोध एक recyclable कैसेट (FRT-hygR) है कि एक heterologous FLP recombinase 12 के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा हटाया जा सकता है के रूप में विकसित किया गया है। यह प्रतिरोध कैसेट की और इस तरह के सिद्धांत के असीमित आनुवंशिक संशोधन में हटाने की अनुमति देता है। Phleomycin mutagenic 13 ताकि नई कैसेट के साथ, विशेष रूप से recyclable hygR कैसेट में, phleoR के उपयोग को कम किया जाता है। चौगुनी म्यूटेंट इस प्रकार अन्य चार कैसेट का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन पचगुना म्यूटेंट के लिए, FRT-hygR प्रणाली 14 की सिफारिश की है।
यह सामान्य जीन विलोपन रणनीति सफलतापूर्वक ऐसी Sporisorium reilianum 15, यू के रूप में अन्य मैल कवक के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है hordei 16, या यू esculenta 17 और इसलिए एक कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रणाली के साथ अभी तक आनुवांशिक रूप से असभ्य जीवों में आगे अनुप्रयोगों के लिए क्षमता प्रदान करता है। इसके अलावा, मुताबिक़ पुनर्संयोजन कमी जीवों के रूप में शामिल जीन का विलोपन द्वारा उदाहरण जेनेटिक इंजीनियरिंग में सुधार करने के लिए संशोधित किया जा सकता गैर मुताबिक़-enडी-में शामिल होने Neurospora घोर 18,19 में।
यहाँ हम यू के लिए प्रकाशित जीन विलोपन रणनीति का वर्णन उम्मीदवारों के तेजी से और सही सत्यापन पर ध्यान देने के साथ प्रयोगात्मक विस्तार से 7.9 maydis। एक उदाहरण के रूप में, हम फंगल chitinases का उपयोग करें और दर्शाती एकल म्यूटेंट की पीढ़ी के साथ ही कई विलोपन तनाव 20,21। क्योंकि वे कठोर कोशिका दीवार में काइटिन पर कार्रवाई Chitinases, दिलचस्प उदाहरण हैं। सेल की दीवार remodeling कोशिका विभाजन के दौरान morphological परिवर्तन के लिए आवश्यक है, filamentous विकास, और बीजाणु गठन के लिए स्विच। इसलिए, विलोपन म्यूटेंट में जीवन चक्र के दौरान phenotypes की उम्मीद की जा सकती है।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे यू में रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन के लिए विलोपन म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए maydis। शुरुआती बिंदु एक विलोपन का निर्माण है कि जीन के हित के बारे में 1 केबी स्टार्ट नदी के ऊपर औ?…
The authors have nothing to disclose.
पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ बेनेडिक्ट Steuten लिए विशेष धन्यवाद। chitinases पर मूल काम डॉ Thorsten Langner से बाहर किया गया था। वी.जी. की प्रयोगशाला संयंत्र विज्ञान में उत्कृष्टता (CEPLAS, DFG EXC 1028) और BioSC के क्लस्टर के द्वारा समर्थित है, के एस की प्रयोगशाला BioSC द्वारा समर्थित है। KB BioSC द्वारा समर्थित है। Bioeconomy विज्ञान केंद्र (BioSC) की वैज्ञानिक गतिविधियों को आर्थिक रूप से NRW Strategieprojekt BioSC (नं 313 / 323-400-00213) के ढांचे के भीतर अभिनव, विज्ञान और अनुसंधान के मंत्रालय द्वारा समर्थित थे। वामो DFG अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान प्रशिक्षण समूह 1525 iGRADplant की एक डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है।
Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
Casamino acids | BD | 223050 | |
Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |