플랜트 병원체의 유전자 조작<em> Ustilago maydis</em> 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Summary

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

Abstract

유전자 결실은 유전자 기능 분석에 중요한 역할을한다. 타겟 방식으로 유전자를 방해하는 가장 효율적인 방법 중 하나는 상동 재조합을 통해 선택 마커 전체 유전자의 교체이다. 상동 재조합 동안 DNA의 교환은 유사도가 높은 순서 사이에 발생한다. 따라서, 표적 유전자를 플 랭킹 선형 게놈 서열은 특히 원하는 통합 사이트에 선별 마커를 지시하는데 사용될 수있다. 삭제 구조의 무딘 끝은 세포의 DNA 복구 시스템을 활성화하여 상동 재조합을 통해 또는 비 – 상동 – 최종 가입하여 어느 구조의 통합을 촉진한다. 효율적인 상동 재조합 유기체에서, 성공적인 유전자 결실의 비율은 50 % 이상이 전략에 유용한 유전자 파쇄 시스템하게 도달 할 수있다. Ustilago가 maydis 검댕 곰팡이는 효율적인 상동 recombinat을 나타내는 진핵 모델 미생물이다이온. 그 약 6,900 유전자 가운데 많은 기능 삭제 돌연변이의 도움으로 특징되었고, 유전자의 필수 기능에 유전자 교체 시도 포인트의 실패를 반복했다. 형광 마커 또는 예측 도메인의 돌연변이 태그에 의해 유전자 기능의 후속 특성은 상동 재조합을 통해 DNA 교환에 의존합니다. 여기, 우리는 미국이 제시 가장 간단한 예를 들어, 유전자 결실을 이용하여 상세히 maydis 변형 생성 전략.

Introduction

Ustilago maydis는 수십 년 ^{1, 2에} 대해 광범위하게 연구 된 식물 병원성 모델 균류이다. 그것은 두 모폴로지, 효모와 같은 비 병원성 단계와 사상, 전염성 형태 ^3에 존재합니다. 이러한 상동 재조합 DNA 복구 메커니즘으로서 보편적 인 획기적인 발견이 균 ⁴ 효모 유사 성장 단계에서 이루어졌다. 또한, 감염에 대한 중요한 감염 필라멘트 및 독성 요인에 대한 형태 학적 스위치 ^5,6를 잘 특징이다. 이 검댕 곰팡이의 생물학 및 독성에 대한 증가하는 분자 지식은 훌륭한 게놈 주석 ^(10)와 사용 역 유전학의 용이성, 예를 들면, 우리 연구소에서 잘 조직 된 플라스미드 컬렉션 (HTTP가 지원하는 간단한 유전자 교체 전략 ^7-9에 의존 : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). 옥수수의 표준화, 신속한 감염 분석eedlings는 병원성의 상세한 연구 ^{(11) 요인을} 감안.

미국의 게놈 maydis는 약 6,900 유전자 ^{(10)를 포함한다.} 그 기능을 연구하기 위해, 그들은 인해 효율적인 상동 재조합 시스템에 개별적으로 또는 조합으로 삭제 될 수있다. 완벽 상동 끝을 포함 약 1킬로바이트의 측면 영역은 50 % 이상 상동 재조합의 속도에 적합하지만, 비 동종 끝 이미 250 bp의이 구조물 ^(9)의 올바른 통합을 어느 정도 할 수 있습니다. 현재, 다섯 가지 저항 카세트, 하이 그로 마이신, carboxin, nourseothricin, G418 및 phleomycin에 대한 저항을 매개 hygR, cbxR, natR, G418R, 및 phleoR는 형질 전환 ^7,9에 대한 선택 사용된다. 또한, 하이 그로 마이신 내성 이종 FLP 재조합 효소 ^(12)의 일시적인 발현에 의해 제거 될 수있는 재활용 카세트 (FRT-hygR)로 개발되어왔다. 이 저항 카세트하여 이론 무제한 유전자 변형에 제거 할 수 있습니다. Phleomycin 새로운 카세트와 재활용 hygR 카세트 특히 phleoR의 사용이 감소되도록 ¹³ 돌연변이이다. 콰 드러 돌연변이 따라서 다른 네 카세트를 사용하여 생성 될 수 있으나, 배의 변이체를 들어, FRT-hygR 시스템 ^(14)을 추천한다.

이 일반적인 유전자 결실 전략은 성공적 Sporisorium의 reilianum ^15, 미국 등의 다른 검댕 곰팡이로 전송 된 hordei ^(16), 또는 U. 라 esculenta ¹⁷ 때문에 효율적인 상동 재조합 시스템 아직 유전자 어려운 유기체에서 상기 애플리케이션에 대한 가능성을 제공한다. 관련된 유전자의 결실에 의해 예시 된 바와 같이 또한, 상동 재조합이 결여 생물 유전 공학을 개선하기 위해 수정 될 수 비 동성 엉D-가입 뉴로 crassa의 ^{18, 19에.}

여기에서 우리는 미국에 대한 게시 된 유전자 삭제 전략을 설명 후보자의 신속하고 정확한 검증에 초점을 맞춘 실험 자세히 ^7,9를 maydis. 예를 들어, 우리는 진균 chitinases를 사용하여 단일 돌연변이의 발생뿐 아니라 다수의 삭제 ^{20,21 종자} 도시한다. 그들은 강성 세포벽 키틴에 작용하기 때문에 Chitinases은 흥미로운 예이다. 세포벽 리모델링이 세포 분열시 형태 변화 필요, 사상 성장과 포자 형성에 전환합니다. 따라서, 결실 돌연변이 체의 수명주기 동안 표현형을 기대할 수있다.

Protocol

삭제를 구축 1. 생성 각각 1킬로바이트 상류 측면 (UF)과 하류 측면 (DF) 각각 평활 절삭 제한 부위에 의해 측면 적절한 저항성 카세트를 포함하는 결실 구조체 (도 1)를 포함하는 플라스미드를 생성한다. 참고 : 모든 복제 전략을 우리는 플라스미드 9 골든 게이트 복제를 권장합니다 (복제에 대한 참조 22 참조)를 사용할 수 있습니다. 삭제 (9)를</sup…

Representative Results

미국으로 인코딩 네 chitinolytic 유전자의 삭제 구조 maydis 게놈 cts1의 삭제에 대한 hygR 카세트를 사용하여 골든 게이트 복제에 의해 생성 된의 natR cts2의 삭제, cts3의 삭제 및 cts4 (20)의 삭제를위한 cbxR에 대한 G418R 카세트. 유전자 치환 전략의 일반적인 개요는 cts3의 삭제 (도 1)에 의…

Discussion

이 프로토콜은 미국에서 역 유전 연구에 대한 결실 돌연변이 체를 생성하는 방법에 대해 설명 maydis. 시작점은 나란히 ^{7,9 최적화되었을} 유전자의 관심에 대한 1 시작 상류 및 정지 코돈의 하류 KB뿐만 아니라 적절한 저항성 카세트의 서열을 함유 플 랭킹 서열을 포함하는 결실 구조체이며 . 구조는 개별적으로 각각의 유전자에 대해 생성 조심스럽게 유전자를 삭제하기 전에 시…

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	A-9878
Bacto Agar	BD	214010	alternatively use local supplier
Bacto Peptone	BD	211677	alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract	BD	212750	alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O	Grüssing GmbH	10234	alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt)	Sigma Aldrich	P-2250
Carboxin	Sigma Aldrich	45371
Casamino acids	BD	223050
Cholinchlorid	Sigma Aldrich	C-1879
Citric acid	ChemSolute	24,321,000	alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O	Fluka	61240	alternatively use local supplier
D(+)Sucrose	Roth	4621.1	alternatively use local supplier
DNA degr. free acid	Sigma-Aldrich	D-3159
EDTA	Sigma Aldrich	E4378
FeCl3*6H2O	Grüssing GmbH	10288	alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Trichoderma lysing enzymes	Sigma Aldrich	L1412
Glucose	Caelo	2580	alternatively use local supplier
Glycerin	Fisher Chemical	G065015	alternatively use local supplier
H3BO3	AppliChem	A2940	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-50KU
Hygromycin B-solution	Roth	1287.2	Dangerous substance.
KCl	VWR	26764298	alternatively use local supplier
KH2PO4	AppliChem	A3620	alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree	Merck	7487-88-9	Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O	AppliChem	A2087	alternatively use local supplier
myo-Inositol	Sigma Aldrich	I-5125
Na2-EDTA*2H2O	AppliChem	A2937	alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O	Roth	0274.2	alternatively use local supplier
Na2SO4	Grüssing GmbH	12174	alternatively use local supplier
NaCl	Fisher Chemical	S316060	alternatively use local supplier
NaOH	ChemSolute	13,751,000	alternatively use local supplier
NH4NO3	Roth	K299.1	alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate	Werner BioAgents	5,001,000
Nutrient broth	Difco		local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7	Sigma Aldrich	P3803	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)	Sigma Aldrich	P-3640
Potassium acetate	AppliChem	121479	alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid)	Sigma Aldrich	P-9755
Riboflavin	Sigma Aldrich	R4500
RNaseA	Sigma Aldrich	R5503
SDS	Roth	Cn30.3	alternatively use local supplier
small syringe	BD	300300	alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm	VWR	28145-477	alternatively use local supplier
Sorbitol	Roth	6213.1	alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride	Serva	36020.02	alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate	Fisher Chemical	S332060	alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane	VWR	103156X	alternatively use local supplier
Tris hydrochloride	Roth	9090.4	alternatively use local supplier
Triton X-100	Serva	37240	alternatively use local supplier
ZnCl2	Fluka	96470	alternatively use local supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Composition of solutions/preparation of material			Composition of solutions
Carboxin			Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates			0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose
Geneticin (G418)			Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm)			Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal.
Heparin			Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution			16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution			0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin			Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin			Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium			0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%)
RegLight			1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8			Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8			1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG			40 % (v/v) PEG in STC-buffer
TE buffer, pH 8			1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase			10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements			0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution			12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5			806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8			10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter.
Usti-lysis buffer 2			mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium			1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar