La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em> Ustilago maydis</em> Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni
Summary
Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.
Abstract
Gene delezione gioca un ruolo importante nell'analisi della funzione del gene. Uno dei metodi più efficaci per interrompere geni in modo mirato è la sostituzione dell'intero gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Durante la ricombinazione omologa, lo scambio di DNA avviene tra sequenze con alta affinità. Pertanto, le sequenze genomiche lineari fiancheggianti un gene bersaglio possono essere utilizzati per indirizzare specificamente un marcatore selezionabile al sito di integrazione desiderato. estremità smussata della delezione costrutto attivano sistemi di riparazione del DNA della cellula e, quindi, promuovere l'integrazione del costrutto sia tramite ricombinazione omologa o non omologa-end-adesione. Negli organismi con efficiente ricombinazione omologa, il tasso di successo delezione del gene può raggiungere più del 50% rendendo questa strategia un sistema gene distruzione di valore. Il fungo fuliggine Ustilago maydis è un modello microorganismo eucariote che mostra come ricombinante omologo efficienteionico. Fuori suoi circa 6.900 geni, molti sono stati funzionalmente caratterizzati con l'aiuto di mutanti di delezione, e ripetuta di pezzi gene tentativi punti in funzione essenziale del gene. caratterizzazione successiva della funzione del gene per codifica con marcatori fluorescenti o mutazioni di domini previsti si basa anche sullo scambio di DNA mediante ricombinazione omologa. Qui, vi presentiamo il U. maydis strategia di generazione ceppo in dettaglio utilizzando l'esempio più semplice, la delezione del gene.
Introduction
Ustilago maydis è un fungo modello di fitopatogeni che è stato ampiamente studiato per decenni 1,2. Esiste in due morfologie, una fase non patogeno di lievito-simili e una filamentosa, forma infettiva 3. Scoperte rivoluzionarie universali come i meccanismi di ricombinazione e riparazione del DNA omologhe sono state fatte in fase di crescita del lievito-simile di questo fungo 4. Inoltre, l'interruttore morfologica al filamento e di virulenza fattori infettivi importanti per l'infezione sono ben caratterizzati 5,6. La conoscenza molecolare crescente sulla biologia e la virulenza di questo fungo fuliggine si basa su una strategia di sostituzione genica semplice 7-9 supportato da un ottimo annotazione del genoma 10 e la facilità di genetica inversa utilizzando, ad esempio, la raccolta plasmide ben organizzata presso il nostro Istituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardizzati, saggi di infezione rapidi nel mais seedlings consentono studi dettagliati di patogenicità fattori 11.
Il genoma di U. maydis contiene circa 6.900 geni 10. Per studiare la loro funzione, possono essere eliminati singolarmente o in combinazione a causa di un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Regioni fiancheggianti di circa 1 kb contenenti estremità perfettamente omologhe sono ideali per i tassi di ricombinazione omologa superiore al 50%, ma già 250 bp con estremità non omologhe consentono un certo grado di corretta integrazione del costrutto 9. Attualmente, cinque diverse cassette di resistenza, HYGR, cbxR, NATR, G418R, e phleoR mediare resistenza contro Hygromycin, carbossina, nourseothricin, G418 e phleomycin, sono impiegati per selezionare per trasformanti 7,9. Inoltre, la resistenza igromicina è stata sviluppata in una cassetta riciclabile (FRT-HYGR) che può essere rimosso mediante l'espressione transiente di un eterologa ricombinasi FLP 12. Questo permette la rimozione della cassetta di resistenza e quindi in teoria illimitato modificazioni genetiche. Phleomycin è mutageno 13, in modo che con le nuove cassette, in particolare riciclabile cassette HYGR, l'uso di phleoR sta diminuendo. Mutanti quadruple possono così essere generati utilizzando gli altri quattro cassette, ma per mutanti quintuple, il sistema FRT-HYGR è consigliato 14.
Questa strategia generale gene delezione è stato trasferito con successo ad altri funghi Smut come Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, o U. esculenta 17 e offre quindi la possibilità di ulteriori applicazioni in organismi geneticamente ancora intrattabili con un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Inoltre, gli organismi privi ricombinazione omologa possono essere modificati per migliorare l'ingegneria genetica come esemplificato dalla delezione di geni coinvolti nella non-omologa-itd-entrare in Neurospora crassa 18,19.
Qui si descrive la strategia di eliminazione del gene pubblicato per U. Maydis 7,9 in dettaglio sperimentale con un focus sulla verifica rapida e accurata dei candidati. A titolo di esempio, usiamo le chitinasi fungine e rappresentare la generazione dei singoli mutanti, nonché l'eliminazione più ceppi 20,21. Chitinasi sono esempi interessanti, perché agiscono sulla chitina nella parete cellulare rigida. è richiesto il rimodellamento della parete cellulare di cambiamenti morfologici durante la divisione cellulare, passare alla crescita filamentosa, e formazione di spore. Quindi, in mutanti di delezione può aspettare fenotipi in tutto il ciclo di vita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come generare mutanti di delezione per studi di genetica inversa a U. maydis. Il punto di partenza è un costrutto delezione che contiene sequenze fiancheggianti del gene di interessi contenente sequenze di circa 1 kb a monte dell'inizio e valle del codone di stop, nonché una cassetta di resistenza appropriata come è stato precedentemente ottimizzato 7,9 . I costrutti devono essere generate singolarmente per ogni gene e controllate con cura per errori di sequenza prim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un ringraziamento particolare al Dr. Benedikt Steuten per la lettura critica del manoscritto. L'opera originale sulle chitinasi è stato effettuato dal Dr. Thorsten Langner. Il laboratorio di VG è supportato dal Cluster di Eccellenza in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, il laboratorio di KS è supportato da BioSC. KB è supportato da BioSC. Le attività scientifiche del bioeconomia Science Center (BioSC) sono stati sostenuti finanziariamente dal Ministero per l'Innovazione, la Scienza e la ricerca nell'ambito del NRW Strategieprojekt BioSC (n ° 313 / 323-400-00213). LF è sostenuto da una borsa di studio di dottorato del 1525 iGRADplant DFG International Group formazione alla ricerca.
Materials
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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