Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em> Ustilago maydis</em> Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie
Summary
Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen – Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein – Tag kodiert.
Abstract
Gendeletion spielt eine wichtige Rolle bei der Analyse der Genfunktion. Eine der effizientesten Methoden Gene gezielt zu unterbrechen ist der Ersatz des gesamten Gens mit einem selektierbaren Marker durch homologe Rekombination. Während der homologen Rekombination, den Austausch von DNA erfolgt zwischen Sequenzen mit hoher Ähnlichkeit. Daher linearen genomischen Sequenzen ein Zielgen flankieren können gezielt eingesetzt werden, um einen selektierbaren Marker in die gewünschte Integrationsstelle lenken. Blunt Enden des Deletionskonstrukt aktivieren die DNA-Reparatursysteme der Zelle und damit Integration des Konstrukts zu fördern, entweder durch homologe Rekombination oder durch nicht-homologe-end-joining. In Organismen mit effizienten homologe Rekombination, kann die Rate der erfolgreichen Gen-Deletion erreichen mehr als 50% machen diese Strategie zu einem wertvollen Genin System. Der Brandpilz Ustilago maydis ist ein eukaryotischen Modell Mikroorganismus so effiziente homologe recombinat zeigtIon. Aus seiner etwa 6.900 Gene, wurden viele haben funktionell mit Hilfe von Deletionsmutanten gekennzeichnet, und Versagen des Genaustausches Versuche Punkte an wesentlichen Funktion des Gens wiederholt. Die anschließende Charakterisierung der Genfunktion durch auch auf DNA-Austausch beruht über homologe Rekombination mit Fluoreszenzmarkern oder Mutationen der vorhergesagten Domänen-Tagging. Hier präsentieren wir die U. maydis Stamm Generation Strategie im Detail das einfachste Beispiel verwenden, die Gen – Deletion.
Introduction
Ustilago maydis ist ein phytopathogener Modell Pilz, der in großem Umfang für Jahrzehnte 1,2 untersucht wurde. Es existiert in zwei Morphologien, eine Hefe-like, nicht pathogen Stufe und einem fädigen, infektiöse Form 3. Universal – Durchbruch Entdeckungen wie homologe Rekombination und DNA – Reparaturmechanismen wurden in der Hefe-ähnliche Wachstumsphase des Pilzes 4 gemacht. Darüber hinaus sind die morphologischen Schalter auf den infektiöse Glühfaden und Virulenzfaktoren wichtig für Infektions 5,6 gut charakterisierten. Die zunehmende molekulare Wissen über Biologie und Virulenz dieser Brandpilz beruht auf einem einfachen Gen – Ersetzungsstrategie 7-9 durch eine hervorragende Genomannotation unterstützt 10 und die Leichtigkeit der reversen Genetik, zB die gut organisierte Plasmid Sammlung an unserem Institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardisierte, schnelle Infektionstests in Mais seedlings ermöglichen detaillierte Studien der Pathogenität 11 Faktoren.
Das Genom von U. maydis enthält etwa 6900 Gene 10. Um ihre Funktion zu studieren, können sie einzeln oder in Kombination gelöscht werden aufgrund einer effizienten homologe Rekombinationssystem. Flankierende Regionen von etwa 1 kb perfekt homologe Enden enthalten , sind ideal für die Preise der homologen Rekombination von mehr als 50%, aber bereits 250 bp mit nicht-homologe Enden ermöglichen einen gewissen Grad an korrekte Integration des Konstrukts 9. Derzeit sind fünf verschiedene Widerstandskassetten, HYGR, cbxR, NATR, G418R und phleoR vermittelnde Widerstand gegen Hygromycin, Car-, Nourseothricin, G418 und Phleomycin, eingesetzt für Trans auszuwählen 7,9. Darüber hinaus hat der Hygromycinresistenz in eine wiederverwertbare Kassette (FRT-HYGR) entwickelt worden, die durch die transiente Expression einer heterologen FLP Rekombinase entfernt werden kann 12. Dies ermöglicht die Entfernung der Resistenzkassette und damit theoretisch unbegrenzt genetische Veränderungen. Phleomycin ist mutagenen 13, so daß mit den neuen Kassetten, insbesondere das recycelbar HYGR Kassette, die Verwendung von phleoR abnimmt. Quadruple – Mutanten können so erzeugt werden , um die anderen vier Kassetten verwenden, aber für verfünffachen Mutanten, die FRT-HYGR System wird 14 empfohlen.
Diese allgemeine Gen – Deletion Strategie wurde auf andere Brandpilze wie Sporisorium reilianum erfolgreich übertragen 15, U. hordei 16 oder U. esculenta 17 und bietet somit das Potenzial für weitere Anwendungen in noch genetisch hartnäckigen Organismen mit einem effizienten homologe Rekombination System. Außerdem Organismen die homologe Rekombination fehlt modifiziert werden können Gentechnik zu verbessern, wie durch die Deletion von Genen beteiligt exemplifiziert in nicht-homologe-end-Beitritt in Neurospora crassa 18,19.
Hier beschreiben wir die veröffentlichten Gen – Deletion Strategie für U. maydis 7,9 in experimentellen Detail mit einem Fokus auf die schnelle und genaue Überprüfung der Kandidaten. Als Beispiel verwenden wir die Pilz Chitinasen und zeigen die Erzeugung von Einzelmutanten sowie mehrere Lösch 20,21 Stämme. Chitinasen sind interessante Beispiele, weil sie in der starren Zellwand auf Chitin wirken. Zellwand Umbau für morphologische Veränderungen während der Zellteilung benötigt wird, wechseln Sie in das filamentöse Wachstum und die Sporenbildung. Daher kann in Deletionsmutanten Phänotypen während der Lebensdauer zu erwarten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt , wie Deletionsmutanten für Reverse genetische Studien in U. zu erzeugen maydis. Der Ausgangspunkt ist ein Deletionskonstrukt , die flankierenden Sequenzen des Gens von Interesse enthält Sequenzen von etwa 1 kb stromaufwärts des Starts und stromabwärts des Stop-Codons sowie eine geeignete Resistenz – Kassette enthält , wie es zuvor 7,9 optimiert . Die Konstrukte sind individuell werden für jedes Gen erzeugt und sorgfältig für Folgefehler vor dem Löschen d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Besonderer Dank geht an Dr. Benedikt Steuten für das kritische Lesen des Manuskripts. Die ursprüngliche Arbeit an den Chitinasen wurde von Dr. Thorsten Langner durchgeführt. Das Labor von VG wird durch die Exzellenzcluster in Pflanzenwissenschaften (CEPLAS, DFG EXC 1028) und BioSC unterstützt wird das Labor von KS von BioSC unterstützt. KB wird von BioSC unterstützt. Die wissenschaftlichen Aktivitäten der Bioökonomie Science Center (BioSC) wurden vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung im Rahmen des NRW-Strategieprojekt BioSC (Nr 313 / 323-400-00213) finanziell unterstützt. LF wird durch ein Promotionsstipendium der DFG Graduiertenkolleg 1525 iGRADplant unterstützt.
Materials
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
- Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
- Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
- Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
- Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
- Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
- Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
- Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
- Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
- van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
- Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
- Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
- Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
- Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
- Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
- Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
- Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
- Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
- Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
- Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
- Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
- Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
- Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
- Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
- Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).
