Manipulação genética do patógeno de planta<em> Ustilago maydis</em> Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions
Summary
Descrevemos uma estratégia de substituição de genes robusta para manipular geneticamente o fungo Ustilago maydis smut. Este protocolo explica como gerar mutantes de deleção para investigar fenótipos de infecção. Ele pode ser estendido para modificar os genes de qualquer forma desejada, por exemplo, através da adição de uma sequência que codifica uma etiqueta de proteína fluorescente.
Abstract
Deleção do gene desempenha um papel importante na análise da função dos genes. Um dos métodos mais eficazes para interromper genes de forma direcionada, é a substituição de todo o gene com um marcador seleccionável através de recombinação homóloga. Durante a recombinação homóloga, a troca de DNA ocorre entre sequências com alta similaridade. Portanto, sequências genómicas flanqueadoras lineares um gene alvo podem ser utilizados para dirigir especificamente um marcador seleccionável para o local de integração desejada. extremidades rombas do construto eliminação activar sistemas de reparação do ADN da célula e, assim, promover a integração da construção, quer através de recombinação homóloga ou por não-homóloga-fim de aderir. Em organismos com recombinação homóloga eficiente, a taxa de supressão de gene bem sucedida pode chegar a mais de 50%, tornando esta estratégia de um sistema de interrupção de genes valioso. O fungo smut Ustilago maydis é um microorganismo modelo eucariótica mostrando como recombinat homóloga eficienteíon. Fora dos seus cerca de 6900 genes, muitos foram funcionalmente caracterizados com a ajuda dos mutantes de deleção, e repetiu falha de pontos de tentativas de substituição de genes em função essencial do gene. posterior caracterização da função gênica por marcação com marcadores fluorescentes ou mutações de domínios previstos também se baseia na troca de ADN através de recombinação homóloga. Aqui, apresentamos o U. maydis estratégia de geração de tensão em detalhe utilizando o exemplo mais simples, a deleção do gene.
Introduction
Ustilago maydis é um fungo fitopatogénico modelo que tem sido estudada extensivamente durante décadas 1,2. Ela existe em duas morfologias,, um estágio não-patogênica do tipo levedura e uma filamentosos, forma infecciosa 3. Descobertas revolucionárias universais, tais como mecanismos de recombinação e reparo de DNA homólogas foram feitas na fase de crescimento do tipo levedura do fungo 4. Além disso, o interruptor morfológico ao filamento e virulência infecciosas factores importantes para a infecção são bem caracterizado 5,6. O conhecimento molecular crescente sobre a biologia e virulência do fungo ferrugem se baseia em uma estratégia de substituição de genes simples 7-9 apoiado por uma excelente genoma anotação 10 e a facilidade de genética reversa usando, por exemplo, a coleção plasmídeo bem organizado pelo nosso instituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Padronizados, ensaios de infecção rápidas no milho seedlings permitem estudos detalhados de patogenicidade Fatores de 11.
O genoma de U. maydis contém cerca de 6900 genes 10. Para estudar a sua função, eles podem ser suprimidos individualmente ou em combinação, devido a um sistema de recombinação homóloga eficiente. Regiões de f lanqueamento de cerca de 1 kb contendo extremidades perfeitamente homólogas são ideais para as taxas de recombinação homóloga maior do que 50%, mas já de 250 pb com extremidades não homólogas permitir um certo grau de integração correcta da construção 9. Atualmente, cinco cassetes de resistência diferentes, hygR, cbxR, NATR, G418R, e phleor mediar resistência contra higromicina, carboxin, nourseothricin, G418 e fleomicina, são utilizados para seleccionar os transformantes 7,9. Além disso, a resistência à higromicina foi desenvolvido em uma cassete reciclável (FRT-hygR) que pode ser removido por a expressão transiente de uma recombinase FLP heterólogo 12. Isto permite a remoção da cassete de resistência e, portanto, em teoria modificações genéticas ilimitadas. Fleomicina é mutagénica 13, de modo que, com as novas cassetes, em particular, a cassete hygR reciclável, o uso de phleor está a diminuir. Quádruplos mutantes podem, portanto, ser geradas utilizando as outras quatro cassetes, mas para os mutantes quíntuplo, o sistema de DRF-hygR é recomendado 14.
Esta estratégia geral deleção do gene foi transferido com sucesso para outros fungos obscenidade como Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 e, portanto, oferece o potencial para futuras aplicações em organismos geneticamente ainda intratáveis com um sistema de recombinação homóloga eficiente. Além disso, os organismos que carecem de recombinação homóloga pode ser modificado para melhorar a engenharia genética, tal como exemplificado pela deleção de genes envolvidos em não-homóloga-end-unindo em Neurospora crassa 18,19.
Aqui nós descrevemos a estratégia de deleção do gene publicada por U. maydis 7,9 em detalhe experimental com foco na verificação rápida e precisa dos candidatos. Como um exemplo, usamos as quitinases de fungos e descrevem a geração de mutantes individuais, bem como a eliminação múltiplas estirpes 20,21. Quitinases são exemplos interessantes, porque actuam sobre quitina na parede celular rígida. remodelação da parede celular é necessária para modificações morfológicas durante a divisão celular, mudar para o crescimento filamentoso, e a formação de esporos. Assim, em fenótipos mutantes de deleção em todo o ciclo de vida pode ser esperado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve como gerar mutantes de deleção para estudos de genética inversa em U. maydis. O ponto de partida é uma construção de deleção que contém sequências que flanqueiam o gene de interesse que contém sequências de cerca de 1 kb a montante do início e a jusante do codão stop, assim como uma cassete de resistência adequada, tal como foi previamente optimizado 7,9 . As construções têm que ser gerados individualmente para cada gene e cuidadosamente verificada por erros …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Um agradecimento especial ao Dr. Benedikt Steuten para a leitura crítica do manuscrito. O trabalho original sobre as quitinases foi realizada pelo Dr. Thorsten Langner. O laboratório de VG é suportado pelo Cluster de Excelência em Ciências Vegetais (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, o laboratório de KS é suportado por BioSC. KB é suportado por BioSC. As atividades científicas do Science Center Bioeconomy (BioSC) foram apoiadas financeiramente pelo Ministério da Inovação, Ciência e Investigação no âmbito do NRW Strategieprojekt BioSC (No. 313 / 323-400-00213). LF é apoiado por uma bolsa de doutoramento da DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.
Materials
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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