Manipulation génétique de l'agent pathogène des plantes<em> Ustilago maydis</em> Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions
Summary
Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.
Abstract
Délétion du gène joue un rôle important dans l'analyse de la fonction génique. L'une des méthodes les plus efficaces pour perturber les gènes de manière ciblée est le remplacement de la totalité du gène avec un marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison homologue, l'échange d'ADN a lieu entre les séquences avec une grande similitude. Par conséquent, des séquences génomiques linéaires flanquant un gène cible peuvent être utilisés pour diriger spécifiquement un marqueur sélectionnable sur le site d'intégration souhaité. Des extrémités franches de la construction de deletion activent les systèmes de réparation d'ADN de la cellule et ainsi favoriser l'intégration de la construction, soit par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue ou non homologue jonction bout. Dans les organismes avec efficacité la recombinaison homologue, le taux de délétion du gène réussi peut atteindre plus de 50%, ce qui cette stratégie, un système de dissociation génétique précieux. Le champignon Ustilago maydis est un modèle micro-organisme eucaryote montrant tel recombinat homologue efficaceion. Sur ses environ 6.900 gènes, beaucoup ont été caractérisé fonctionnellement avec l'aide de mutants de deletion, et répété échec des tentatives de remplacement de gènes points fonction essentielle du gène. Caractérisation ultérieure de la fonction du gène par le marquage avec des marqueurs ou des mutations des domaines prédits fluorescents repose également sur l'échange d'ADN par recombinaison homologue. Ici, nous présentons le U. maydis stratégie de génération de contrainte en détail en utilisant l'exemple le plus simple, la suppression du gène.
Introduction
Ustilago maydis est un champignon modèle phytopathogènes qui a été largement étudié depuis des décennies 1,2. Il existe en deux morphologies, une étape non pathogène type levure et une filamenteux, forme infectieuse 3. Découvertes révolutionnaires universelles telles que les mécanismes de recombinaison et de réparation de l' ADN homologues ont été faites à l'étape de ce champignon 4 croissance type levure. En outre, le commutateur morphologique des facteurs de filaments et de virulence infectieuses importantes pour l' infection sont bien caractérisés 5,6. La connaissance moléculaire de plus en plus sur la biologie et de la virulence de ce champignon du charbon repose sur une stratégie de remplacement de gène simple 7-9 soutenu par une excellente annotation du génome 10 et la facilité de génétique inverse en utilisant, par exemple, la collecte de plasmide bien organisé dans notre institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Normalisés, tests d'infection rapide dans le maïs seedlings permettent des études détaillées de pathogénicité facteurs 11.
Le génome de U. maydis contient environ 6.900 gènes 10. Pour étudier leur fonction, ils peuvent être supprimés individuellement ou en combinaison grâce à un système de recombinaison homologue efficace. Régions flanquantes d'environ 1 kb contenant des extrémités parfaitement homologues sont idéales pour les taux de recombinaison homologue supérieure à 50%, mais déjà 250 pb avec des extrémités non homologues permettent un certain degré d'intégration correcte de la construction 9. À l' heure actuelle, cinq cassettes de résistance différentes, Hygr, CBXR, NATR, G418R, et la médiation de la résistance contre phleoR hygromycine, la carboxine, la nourséothricine, G418 et phléomycine, sont utilisés pour sélectionner les transformants 7,9. En outre, la résistance à l'hygromycine a été développé dans une cassette recyclable (TRAF-Hygr) qui peut être éliminé par l'expression transitoire d'une recombinase FLP hétérologue 12. Ceci permet le retrait de la cassette de résistance et donc en théorie illimité des modifications génétiques. Phléomycine est mutagène 13, de sorte que les nouvelles cassettes, en particulier , la cassette Hygr recyclable, l'utilisation de phleoR diminue. Mutants quadruples peuvent ainsi être générés en utilisant les quatre autres cassettes, mais pour les mutants quintuples, le système FRT-Hygr est recommandé 14.
Cette stratégie générale de délétion du gène a été transféré avec succès à d' autres champignons du charbon tels que Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 et donc offre la possibilité de nouvelles applications dans les organismes génétiquement encore intraitables avec un système de recombinaison homologue efficace. En outre, les organismes dépourvus de recombinaison homologue peuvent être modifiées pour améliorer le génie génétique comme en témoigne la suppression de gènes impliqués dans la non-homologue-end-assemblage dans Neurospora crassa 18,19.
Nous décrivons ici la stratégie de délétion du gène publié pour U. maydis 7,9 en détail expérimental avec un accent sur la vérification rapide et précise des candidats. A titre d'exemple, nous utilisons les chitinases fongiques et représentent la génération de mutants simples, ainsi que la suppression de multiples souches 20,21. Chitinases sont des exemples intéressants, car ils agissent sur chitine dans la paroi cellulaire rigide. le remodelage de la paroi cellulaire est nécessaire pour les changements morphologiques au cours de la division cellulaire, le commutateur de croissance filamenteuse et la formation de spores. Par conséquent, dans les mutants de deletion phénotypes au long du cycle peuvent être attendus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit comment générer des mutants de délétion pour les études de génétique inverse en U. maydis. Le point de départ est une construction de deletion qui contient des séquences flanquantes du gène d'intérêt contenant des séquences d'environ 1 kb en amont du début et en aval du codon d' arrêt ainsi que d' une cassette de résistance approprié , car il a déjà été optimisé 7,9 . Les constructions doivent être générées individuellement pour chaque g?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Remerciements particuliers à Dr. Benedikt Steuten pour la lecture critique du manuscrit. Le travail original sur les chitinases a été réalisée par le Dr Thorsten Langner. Le laboratoire du VG est pris en charge par le Pôle d'excellence en sciences végétales (CEPLAS, DFG EXC 1028) et ICSOB, le laboratoire de KS est soutenu par ICSOB. KB est soutenu par ICSOB. Les activités scientifiques du Centre des sciences de la bioéconomie (ICSOB) ont été soutenus financièrement par le Ministère de l'innovation, des sciences et de la recherche dans le cadre de la NRW Strategieprojekt ICSOB (n ° 313 / 323-400-00213). LF est soutenu par une bourse de doctorat du DFG Groupe international de formation de recherche 1525 iGRADplant.
Materials
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (Monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-Hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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