نحن تصف استراتيجية استبدال الجينات قوية لمعالجة وراثيا فطر التفحم السوادية الذروية. يشرح هذا البروتوكول كيفية توليد المسوخ الحذف للتحقيق في الظواهر العدوى. ويمكن أن تمتد إلى تعديل الجينات بأي شكل من الأشكال المطلوبة، على سبيل المثال، عن طريق إضافة تسلسل ترميز علامة بروتين فلوري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجينات الحذف يلعب دورا هاما في تحليل وظيفة الجين. واحدة من أكثر الوسائل فعالية لتعطيل الجينات بطريقة هادفة هو استبدال الجينات كامل مع علامة اختيار عبر إعادة التركيب مثلي. خلال إعادة التركيب مثلي، وتبادل الحمض النووي يحدث بين متواليات مع تشابه عالية. لذلك، تسلسل الجينوم الخطية المحيطة الجينات المستهدفة يمكن استخدامها لوجه التحديد توجيه علامة اختيار إلى الموقع التكامل المنشود. نهايات حادة للبناء حذف تفعيل نظم إصلاح الحمض النووي للخلية، وبالتالي تعزيز التكامل بين بناء إما عن طريق إعادة التركيب مثلي أو من خلال الانضمام إلى غير المتجانسة نهاية. في الكائنات الحية مع إعادة التركيب مثلي كفاءة، يمكن أن معدل حذف الجينات نجاح تصل إلى أكثر من 50٪ صنع هذه الاستراتيجية قيما نظام تعطيل الجين. فطر التفحم السوادية الذروية هو الكائنات الحية الدقيقة نموذج حقيقية النواة تظهر مثل recombinat مثلي كفاءةأيون. من إزاء 6،900 الجينات، وكثير اتسمت ظيفيا مع مساعدة من المسوخ الحذف، وتكرار فشل محاولات استبدال الجينات نقاط في وظيفة أساسية من الجين. توصيف لاحق من وظيفة الجين عن طريق وضع علامات مع علامات الفلورسنت أو طفرات من المجالات توقع يعتمد أيضا على تبادل الحمض النووي عبر إعادة التركيب مثلي. هنا، نقدم U. الذروية استراتيجية الجيل سلالة بالتفصيل باستخدام أبسط مثال، حذف الجينات.
المقدمة
السوادية الذروية هو نموذج الفطريات الممرضة للنبات التي تمت دراستها على نطاق واسع لعقود 1،2. ويوجد في اثنين الأشكال التضاريسية، لذلك، مرحلة تشبه الخميرة غير المسببة للأمراض والخيطية، شكل المعدية 3. وقدمت الاكتشافات اختراق عالمية مثل آليات إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي المتجانسة في مرحلة النمو تشبه الخميرة من هذه الفطريات 4. وعلاوة على ذلك، والتحول المورفولوجي للخيوط والفوعة العوامل المعدية الهامة للعدوى وجيدا تتميز 5،6. المعرفة الجزيئية زيادة عن علم الأحياء والفوعة من هذه الفطريات التفحم تعتمد على استراتيجية استبدال الجينات مباشر 7-9 بدعم من الجينوم الشرح ممتاز ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد حذف التركيبات
- توليد البلازميد التي تحتوي على بناء الحذف (الشكل 1) يتألف من 1 كيلوبايت الجناح منها المنبع (UF) والمصب الجناح (DF) كل والكاسيت المقاومة المناسب يحيط بها تقييد مواقع قطع حادة.
ملاحظة: أي استراتيجية الاستنساخ يمكن استخدامها (لاستنساخ أنظر المرجع 22) نوصي جولدن جيت استنساخ لهذه البلازميدات 9. - استئصال الحذف بناء من البلازميد باستخدام قطع حادة للحصول على 1 ميكروغرام الحمض النووي للحذف بناء 9. تنقية بناء الحذف للقضاء....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بنيات الحذف لجميع الجينات chitinolytic أربعة المشفرة في U. تم إنشاؤها الذروية الجينوم عن طريق الاستنساخ جولدن جيت باستخدام كاسيت hygR للحذف من cts1، وnatR للحذف من cts2، الكاسيت G418R للحذف من cts3 وcbxR للحذف من cts4 20. ويتمثل لمحة عامة عن استراتيجية استبدال الجينات التي حذف cts3 (الشكل 1). تم إنشاء المسوخ مفردة ومزدوجة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول وكيفية توليد المسوخ الحذف للدراسات الوراثية العكسية في U. الذروية. نقطة البداية هي بنية الحذف الذي يحتوي تسلسل المرافقة لهذا الجين في المصالح التي تحتوي على تسلسل حوالي 1 كيلو بايت المنبع من بداية والمصب لوقف كودون وكذلك كاسيت المقاومة المناسب كما كان عليه في السابق الأمثل 7،9 . وإلى أن يتم إنشاء بنيات بشكل فردي لكل الجينات والتحقق منها بعناية عن الأخطاء تسلسل السابقة لحذف هذا الجين. الطفرات نقطة في جنباته يمكن أن تسبب تغيرات غير مرغوبة في تس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
شكر خاص للدكتور بينيديكت Steuten لقراءة نقدية للمخطوطة. تم تنفيذ العمل الأصلي على chitinases بها الدكتور تورستن انغنر. يتم اعتماد مختبر VG التي كتبها عنقود التميز في علوم النبات (CEPLAS، DFG EXC 1028) وBioSC، يتم اعتماد مختبر KS التي كتبها BioSC. ويدعم KB من BioSC. الأنشطة العلمية لمركز العلوم الاقتصاد الحيوي (BioSC) ودعما ماليا من وزارة الابتكار والعلوم والبحوث في إطار من NRW Strategieprojekt BioSC (رقم 313 / 323-400-00213). ويدعم LF من قبل زمالة الدكتوراه من DFG المجموعة الدولية والبحوث والتدريب 1525 iGRADplant.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حمض أمينوبنزويك (حمض حر) | سيجما ألدريتش | A-9878 | |
| باكتو أجار ؛ | 214010 | دينار بحريني | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| باكتو الببتون | BD | 211677 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| مستخلص الخميرة باكتو | 212750 | دينار | بحريني بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| CaCl2*2H2O | Grü ssing GmbH | 10234 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. ملح) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | سيجما ألدريتش | 45371 | |
| أحماض الكازامين | دينار | بحريني 223050 | |
| كولين كلوريد | سيجما ألدريتش | C-1879 | |
| حامض الستريك | ChemSolute | 24،321،000 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| CuSO4< / sub> * 5H2< / sub> | O Fluka | 61240 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| D (+) السكروز ؛ | Roth | 4621.1 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| degr. حمض خال | سيجما ألدريتش | D-3159 | |
| EDTA | سيجما ألدريتش | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grü ssing GmbH | 10288 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Geneticin (G418) ملح ثاني كبريتات | Sigma Aldrich | A1720 | |
| إنزيمات التحلل Trichoderma | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D (+) Glucose | Caelo | 2580 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Glycerin ؛ | G065015 | فيشر كيماويات | بدلا من ذلك المورد المحلي |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | مادة خطرة. يرجى التحقق من تعليمات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة. |
| ملح الصوديوم الهيبارين | سيجما ألدريتش | H3393-50KU | |
| هيجروميسين ب محلول | روث | 1287.2 | مادة خطرة. |
| 26764298 | KCl | VWR | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| KH2< / sub>PO4 | AppliChem | A3620 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| MgSO4< / sub> الخالي من الماء | Merck | 7487-88-9 | المياه الحرة أمر بالغ الأهمية. بدلا من ذلك ، استخدم المورد المحلي |
| MnCl2< / sub> * 4H2< / sub>O | AppliChem | A2087 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA * 2H2O | AppliChem | A2937 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Na2SO4 | Grü بدلا من ذلك ، استخدم ssing GmbH | 12174 | المورد المحلي |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| NaOH | ChemSolute | 13،751،000 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| NH4< / sub>NO3< / sub> | Roth | K299.1 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| حمض النيكوتينيك (الحمض الحر) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| نورسيوثريسين ثنائي كبريتات الهيدروجين | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| مرق المغذيات | الموردون المحليون | Difco | |
| الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25:24: 1) الرقم الهيدروجيني 6.7 | سيجما ألدريتش | P3803 | مادة خطرة. يرجى التحقق من تعليمات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة. |
| البولي إيثيلين جلايكول (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| أسيتات البوتاسيوم | AppliChem | 121479 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Pyridoxin (أحادي هيدروكلورىد) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | بدلا من ذلك استخدام حقنة صغيرة للمورد المحلي |
| BD | 300300 | بدلا من ذلك استخدام | |
| مرشح معقم للمورد المحلي ، 22 & micro ؛ m | VWR | 28145-477 | بدلا من ذلك استخدم المورد المحلي |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Tris- (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان | VWR | 103156X | بدلا من ذلك ، استخدم المورد المحلي |
| تريس هيدروكلوريد | روث | 9090.4 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| Triton X-100 & nbsp ؛ | Serva | 37240 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| ZnCl2< / sub> | Fluka | 96470 | بدلا من ذلك استخدام المورد المحلي |
| تكوين الحلول / تحضير المواد | تكوين المحاليل | ||
| مخزون الكربوكسين | : 5 مجم / مل في الميثانول ، التركيز النهائي: 2 & جم / مل | ||
| أطباق | 0.25٪ (وزن / حجم) أحماض الكازامين, 0.1٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة, 1.0٪ (حجم / حجم) محلول فيتامين هوليداي, 6.25٪ (حجم / حجم); محلول ملح هوليداي ، 0.05٪ (وزن / حجم) DNA degr. حمض حر ، 0.15٪ (وزن / حجم) NH 4< / sub>NO3< / sub> ، 2.0٪ (وزن / حجم) باكتو أجار. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.0 باستخدام 5 M هيدروكسيد الصوديوم ؛ بعد التعقيم إضافة 1٪ جلوكوز | ||
| الوراثة (G418) | المخزون: 50 ملغ / مل في H2< / sub>O ، التركيز النهائي: 500 & ميكرو; جم / مل | ||
| حبات زجاجية مغسولة ب HCl (0.35-0.45 مم) | قم بتغطية الخرز الزجاجي بحمض الهيدروكلوريك المركز (25٪ ، 7.8 م) واحتضانه لمدة 60 دقيقة. صب حمض الهيدروكلوريك (احتفظ بالسائل المصبوب) واغسل الخرز الزجاجي ب 3 M HCl (احتفظ بالسائل المصبوب). اغسل الخرزات الزجاجية عدة مرات باستخدام H2< / sub>O المقطر المزدوج حتى يصبح الرقم الهيدروجيني 7 (يجب ألا يكون السائل أصفر-أخضر بعد الآن). قم بتقطيع الخرز الزجاجي وجففه عند 180 درجة مئوية. يجب تحييد حمض الهيدروكلوريك المصبوب قبل التخلص منه. | ||
| الهيبارين | : 15 مجم / مل | ||
| محلول | 16.0 & permil ؛ (وزن / حجم) KH2PO4, 4.0 & permil; (وزن / حجم) Na2SO4, 8.0 & permil; (وزن / حجم) KCl ، 1.32 & permil ؛ (وزن / حجم) CaCl2*2H2O, 8.0 & permil; (V / V) العناصر النزرة ، 2.0 & permil ؛ (وزن / حجم) MgSO4; محلول فيتامين هوليداي المعقم للترشيح | ||
| 0.1 & (وزن / حجم) الثيامين ، 0.05 & permil ؛ (وزن / حجم) ريبوفلافين ، 0.05 & permil ؛ (وزن / حجم) بيريدوكسين ، 0.2 & permil ؛ (وزن / حجم) Ca-Pantothenat ، (0.05 & permil ؛ (وزن / حجم) حمض أمينوبنزويك ، 0.2 & permil ؛ (وزن / حجم) حمض النيكوتينيك ، 0.2 & permil ؛ (وزن / حجم) كولينكلوريد ، 1.0 & permil ؛ (ث / الخامس) ميو الإينوزيتول ؛ يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة ؛ C | |||
| Hygromycin | : 50 مجم / مل في PBS ، التركيز النهائي: 200 & ميكرو ؛ جم / مل | ||
| مخزون نورسيوثريسين | : 200 مجم / مل في H2< / sub>O ، التركيز النهائي: 150 & ميكرو ؛ جم / مل | ||
| NSY-glycerol-متوسط | 0.8٪ (وزن / حجم) مرق المغذيات ، 0.1٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، 0.5٪ (وزن / حجم) السكروز ، ؛ 80.0٪ (حجم / حجم) 87٪ جلسرين (f.c. 69.6٪) ؛ | ||
| RegLight | 1.0٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ؛ 0.4٪ (وزن / حجم) باكتو بيبتون ، 0.4٪ (وزن / حجم) السكروز ، 18.22٪ (وزن / حجم) السوربيتول ، 1.5٪ (وزن / حجم) أجار | ||
| SCS ، درجة الحموضة 5.8 | الحل 1: 20 ملي مولار ثلاثي Na-citrate ، 1 م سوربيتول ؛ كولوشن 2: 20 ملي حامض الستريك ، 1 م سوربيتول ، أضف المحلول 2 إلى المحلول 1 حتى الوصول إلى الرقم الهيدروجيني 5.8 ؛ الأوتوكلاف | ||
| STC ، درجة الحموضة 8 | 1 م سوربيتول ، 10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 100 ملي كلوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / الفرعي > ؛ مرشح | ||
| STC / PEG | 40٪ (v / v) PEG في STC-buffer ؛ | ||
| المخزن المؤقت TE ، درجة الحموضة 8 | 1.31 ملي تريس بيس ، 8.69 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك ، 10 ملي Na 2< / sub>-EDTA * 2H 2< / sub>O | ||
| TE / RNase | 10 & micro ؛ جم / مل RNaseA في العناصر النزرة للمخزن المؤقت | ||
| 0.06 & permil ؛ (وزن / حجم) H3BO3, 0.14‰ (وزن / حجم) MnCl * 4H 2 < / sub >O ، 0.4 & permil ؛ (وزن / حجم) ZnCl2< / sub> ، 0.4 & permil ؛ (وزن / حجم) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 & permil; (وزن / حجم) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (وزن / حجم) CuSO4< / sub> * 5H2< / sub>O | |||
| إنزيمات تحلل Trichoderma | 12.5 مجم / مل SCS ؛ مرشح معقم ؛ تحضير قبل وقت قصير من استخدام | ||
| Tris-HCl درجة الحموضة 7.5 | 806 ملي مولار Tris-HCl ، 194 ملي Tris-Base ؛ تحقق من الرقم الهيدروجيني وإذا لزم الأمر اضبطه باستخدام حمض الهيدروكلوريك ؛ | ||
| العازلة لتحلل الأوتوكلاف 1 ، الرقم الهيدروجيني 8 | 10 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ (وزن / حجم) SDS ، 2٪ (حجم / حجم) TritonX-100 ، 1 ملي EDTA. لا تقيس الأس الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. | ||
| مخزن التحلل Usti-lysis 2 | مزيج Usti تحلل المخزن المؤقت 1 مع 1x TE بنسبة 1: 1 | ||
| YEPS-Light medium | 1.0٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، 0.4٪ (وزن / حجم) باكتو بيبتون ، 0.4٪ (وزن / حجم) السكروز ، لللوحات: 1.5٪ (وزن / حجم) باكتو أجار |
المراجع
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (201....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
