Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em> Ustilago maydis</em> Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Summary

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Abstract

Gendeletie speelt een belangrijke rol bij de analyse van genfunctie. Een van de meest efficiënte werkwijzen om genen doelgericht verstoren is de vervanging van het gehele gen met een selecteerbare merker via homologe recombinatie. Tijdens homologe recombinatie, uitwisseling van DNA vindt plaats tussen sequenties met hoge gelijkenis. Daarom kan lineair genomische sequenties die een doelgen worden gebruikt om specifiek richten een selecteerbare marker om de gewenste integratieplaats. Stompe uiteinden van het deletieconstruct activeren DNA herstel systemen van de cel en daarmee integratie van het construct bevorderen hetzij via homologe recombinatie of door niet-homologe-uiteinden. In organismen met een efficiënte homologe recombinatie, kan de snelheid van succesvolle gendeletie oplopen tot meer dan 50% waardoor deze strategie een waardevolle gendisruptie systeem. De vuiligheid schimmel Ustilago maydis is een eukaryotisch micro-organisme model toont een dergelijke efficiënte homologe recombination. Van de ongeveer 6900 genen, vele zijn functioneel gekarakteriseerd met behulp van deletiemutanten en herhaalde niet van genvervanging pogingen wijst op wezenlijke functie van het gen. Daaropvolgende karakterisering van het gen functie door tagging met fluorescerende markers of mutaties van de voorspelde domeinen beroept zich ook op DNA-uitwisseling via homologe recombinatie. Hier presenteren we de U. maydis generatie strategie stam in detail met behulp van de eenvoudigste voorbeeld, het gen deletie.

Introduction

Ustilago maydis is een model fytopathogene schimmel die uitvoerig is onderzocht voor tientallen jaren ^1,2. Het bestaat in twee morfologieën, een gistachtige, niet-pathogene fase en een filamenteuze infectieuze vorm ^3. Universal baanbrekende ontdekkingen zoals homologe recombinatie en DNA-herstelmechanismen werden gemaakt in de gist-achtige groeifase van deze schimmel ^4. Bovendien is de morfologische schakelaar om de besmettelijke filament en virulentie factoren die van belang zijn voor infectie zijn goed gekarakteriseerd ^5,6. De toenemende kennis over moleculaire biologie en de virulentie van deze vuiligheid schimmel is gebaseerd op een eenvoudige gen vervangende strategie ^7-9 ondersteund door een uitstekende genoomannotatie ¹⁰ en het gemak van het reverse genetics met gebruikmaking van bijvoorbeeld de goed georganiseerde plasmide collectie van ons instituut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Gestandaardiseerde, snelle infectie assays in maïs seedlings mogelijk gedetailleerde studies van pathogene factoren ^11.

Het genoom van U. maydis bevat ongeveer 6900 genen ^10. Om hun functie te bestuderen, kunnen zij afzonderlijk of in combinatie worden verwijderd door een efficiënte homologe recombinatie systeem. Flankerende gebieden van ongeveer 1 kb dat perfect homologe uiteinden zijn ideaal voor snelheden van homologe recombinatie meer dan 50%, maar reeds 250 bp met niet-homologe uiteinden zodat een zekere correcte integratie van het construct ^9. Op dit moment, vijf verschillende weerstand cassettes, hygR, cbxR, natR, G418R en phleoR bemiddelen weerstand tegen hygromycine, carboxin, nourseothricin, G418 en fleomycine, worden gebruikt om te selecteren op transformanten ^7,9. Bovendien heeft de hygromycine resistentie ontwikkeld tot een recycleerbare cassette (FRT-hygR) die kan worden verwijderd door de tijdelijke expressie van een heteroloog FLP recombinase ¹². Dit maakt verwijdering van het resistentiecassette en daarmee in principe onbeperkte genetische modificaties. Phleomycine mutageen ^13, zodat de nieuwe cassettes, met name de recyclebare hygR cassette, het gebruik van phleoR afneemt. Viervoudige mutanten kunnen dus worden gegenereerd via de andere vier cassettes, maar vijfvoudige mutanten, is de FRT-systeem hygR ¹⁴ aanbevolen.

Deze algemene strategie gendeletie met succes overgedragen aan andere smut schimmels zoals Sporisorium reilianum ^15, U. hordei ¹⁶ of U. esculenta ¹⁷ en derhalve biedt het potentieel voor verdere toepassingen nog genetisch hardnekkige organismen met een efficiënte homologe recombinatie systeem. Bovendien kunnen organismen ontbreekt homologe recombinatie worden gemodificeerd gentechnologie verbeteren geïllustreerd door de deletie van genen die betrokken zijn bij niet-homologe end-aansluiting in Neurospora crassa ^18,19.

Hier beschrijven we de gepubliceerde gendeletie strategie voor U. maydis ^7,9 in experimentele detail met een focus op de snelle en nauwkeurige controle van de kandidaten. Als voorbeeld, gebruiken we de schimmel chitinasen en tonen de vorming van enkele mutanten alsmede verschillende deletiestammen ^20,21. Chitinasen zijn interessante voorbeelden, omdat zij optreden in chitine in de starre celwand. Celwand verbouwing is nodig voor morfologische veranderingen tijdens de celdeling, overschakelen naar draadvormige groei, en de vorming spore. Derhalve zijn voor deletiemutanten fenotypes gehele levenscyclus te verwachten.

Protocol

1. Generatie van deletieconstructen Genereren van een plasmide dat de deletie construct (Figuur 1) omvattende een respectievelijk 1 kb stroomopwaartse flank (UF) en stroomafwaartse flank (DF) elk en de juiste weerstand geflankeerd door bot snijden restrictieplaatsen. OPMERKING: klonen strategie kan worden gebruikt (voor het klonen zie referentie 22) bevelen wij Golden Gate klonen voor dergelijke plasmiden 9. Accijnzen de schrapping te construeren van het…

Representative Results

De schrapping constructies voor alle vier chitinolytische genen gecodeerd in het U. maydis genoom werden gegenereerd door Golden Gate klonen met behulp van de hygR cassette voor het verwijderen van CTS1, de natR voor verwijdering van CTS2, de G418R cassette voor het verwijderen van cts3 en de cbxR voor het verwijderen van cts4 20. Een algemeen overzicht van de vervangingsstrategie gen wordt geïll…

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe deletiemutanten voor reverse genetische studies in U. genereren maydis. Uitgangspunt is een deletie construct dat flankerende sequenties van het gen-van-belang bevattende sequenties van ongeveer 1 kb stroomopwaarts van de start en na het stopcodon en een voldoende weerstand cassette bevat zoals eerder geoptimaliseerd ^7,9 . De constructen afzonderlijk worden gegenereerd voor elk gen en zorgvuldig gecontroleerd voor sequentiefouten vóór het gen te verwijderen. Pun…

Materials

Aminobenzoeic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	A-9878
Bacto Agar	BD	214010	alternatively use local supplier
Bacto Peptone	BD	211677	alternatively use local supplier
Bacto Yeast Extract	BD	212750	alternatively use local supplier
CaCl2*2H2O	Grüssing GmbH	10234	alternatively use local supplier
Ca-pantothenat (Hemi-Ca. salt)	Sigma Aldrich	P-2250
Carboxin	Sigma Aldrich	45371
Casamino acids	BD	223050
Cholinchlorid	Sigma Aldrich	C-1879
Citric acid	ChemSolute	24,321,000	alternatively use local supplier
CuSO4*5H2O	Fluka	61240	alternatively use local supplier
D(+)Sucrose	Roth	4621.1	alternatively use local supplier
DNA degr. free acid	Sigma-Aldrich	D-3159
EDTA	Sigma Aldrich	E4378
FeCl3*6H2O	Grüssing GmbH	10288	alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Trichoderma lysing enzymes	Sigma Aldrich	L1412
Glucose	Caelo	2580	alternatively use local supplier
Glycerin	Fisher Chemical	G065015	alternatively use local supplier
H3BO3	AppliChem	A2940	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-50KU
Hygromycin B-solution	Roth	1287.2	Dangerous substance.
KCl	VWR	26764298	alternatively use local supplier
KH2PO4	AppliChem	A3620	alternatively use local supplier
MgSO4 waterfree	Merck	7487-88-9	Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2O	AppliChem	A2087	alternatively use local supplier
myo-Inositol	Sigma Aldrich	I-5125
Na2-EDTA*2H2O	AppliChem	A2937	alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2O	Roth	0274.2	alternatively use local supplier
Na2SO4	Grüssing GmbH	12174	alternatively use local supplier
NaCl	Fisher Chemical	S316060	alternatively use local supplier
NaOH	ChemSolute	13,751,000	alternatively use local supplier
NH4NO3	Roth	K299.1	alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free Acid)	Sigma Aldrich	N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate	Werner BioAgents	5,001,000
Nutrient broth	Difco		local suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) pH 6.7	Sigma Aldrich	P3803	Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)	Sigma Aldrich	P-3640
Potassium acetate	AppliChem	121479	alternatively use local supplier
Pyridoxin (Monohydrochlorid)	Sigma Aldrich	P-9755
Riboflavin	Sigma Aldrich	R4500
RNaseA	Sigma Aldrich	R5503
SDS	Roth	Cn30.3	alternatively use local supplier
small syringe	BD	300300	alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µm	VWR	28145-477	alternatively use local supplier
Sorbitol	Roth	6213.1	alternatively use local supplier
Thiamin-Hydrochloride	Serva	36020.02	alternatively use local supplier
tri-Na-Citrate	Fisher Chemical	S332060	alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethane	VWR	103156X	alternatively use local supplier
Tris hydrochloride	Roth	9090.4	alternatively use local supplier
Triton X-100	Serva	37240	alternatively use local supplier
ZnCl2	Fluka	96470	alternatively use local supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Composition of solutions/preparation of material			Composition of solutions
Carboxin			Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates			0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose
Geneticin (G418)			Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0,35-0,45 mm)			Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal.
Heparin			Stock: 15 mg/ml
Holliday salt solution			16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution			0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
Hygromycin			Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
Nourseothricin			Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium			0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%)
RegLight			1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8			Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 8			1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG			40 % (v/v) PEG in STC-buffer
TE buffer, pH 8			1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase			10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements			0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*2H2O, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution			12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5			806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 8			10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 % (w/v) SDS, 2 % (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter.
Usti-lysis buffer 2			mix Usti lysis buffer 1 with 1 x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium			1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar