Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

وسرطان الخلايا مسانج ماوس نموذج الإنتقالية الكلوي لتقييم الكمي وطولية من قبل السريرية العلاج

Published: April 12, 2017 doi: 10.3791/55080
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4,5, 1,2,3
1Department of Urology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota, 3Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, 4Department of Medical Microbiology, Immunology and Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 5Simmons Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

تنفيذ نموذج مثلي من سرطان الخلايا الكلوية في الفئران مناعيا يتيح للمحقق نظام سريريا ذات الصلة التي تحددها وجود الورم والرئة الكلى الأولية الانبثاث في نفس الحيوان. هذا النظام يمكن استخدامها لاختبار preclinically مجموعة متنوعة من العلاجات في الجسم الحي.

Abstract

سرطان الخلايا الكلوية (RCC) يؤثر> 60000 شخص في الولايات المتحدة سنويا، و~ 30٪ من المرضى لديهم RCC الانبثاث متعددة في وقت التشخيص. النقيلي RCC (مركز تنسيق الانقاذ البحري) هو غير قابل للشفاء، مع فترة بقاء متوسط ​​18 شهرا فقط. التدخلات المناعية المستندة إلى (على سبيل المثال، انترفيرون (IFN) وانترلوكين (IL) -2) لحث على ردود دائمة في جزء من مرضى مركز تنسيق الانقاذ البحري، ومثبطات multikinase (على سبيل المثال، السونيتينيب sunitinib أو سورافينيب) أو مكافحة VEGF مستقبلات الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) ل المهدئة إلى حد كبير، والهجوع كاملة نادرة. هذه النقائص في العلاجات الحالية للمرضى مركز تنسيق الانقاذ البحري توفر الأساس المنطقي لوضع بروتوكولات العلاج الرواية. ومن المكونات الرئيسية في اختبار قبل السريرية لعلاجات جديدة لمركز تنسيق الانقاذ البحري هو نموذج حيواني مناسبة. الميزات المفيدة التي تلخص حالة الإنسان تشمل الورم الرئيسي الكلوي، الانبثاث ورم الكلى، والجهاز المناعي سليمة للتحقيق في أي effecto مأمن يحركها العلاجردود r وتشكيل من العوامل المثبطة للمناعة التي يسببها الورم. يصف هذا التقرير على نموذج الفأر مركز تنسيق الانقاذ البحري مثلي أن لديه كل هذه الميزات. نحن تصف تقنية زرع داخل الكلية باستخدام الماوس الكلوي خط خلية غدية رينكا، تليها تقييم نمو الورم في (الموقع الرئيسي) في الكلى والرئتين (الموقع المتنقل).

Introduction

الكلوي سرطان الخلايا (RCC) يمثل غالبية الأورام الخبيثة الكلى وحوالي 3٪ من جميع الأورام الخبيثة الكبار في جميع أنحاء العالم 1، 2. نظرا لعدم وجود أعراض، خطأ في التشخيص، وأدوات الفحص كافية لمجلس قيادة الثورة، وتقريبا 30٪ من المرضى الحالي مع RCC المنتشر (مركز تنسيق الانقاذ البحري) في وقت التشخيص، مع 20-30٪ إضافية من المرضى تتقدم إلى مرحلة النقيلي 2. هذه الحالات تؤدي إلى ~ 13،500 حالة وفاة سنويا 1 و 3. على الرغم من اكتشاف وعلاج RCC الأساسي في وقت سابق قد تحسنت، لا يزال معدل الوفيات المرتبطة RCC لزيادة، مما يدل على أن المرض المنتشر هي المسؤولة إلى حد كبير عن الوفيات 3. وقد أحرز تقدم في تطوير علاج لمجلس قيادة الثورة على مدى العقد الماضي مع اكتشاف وتنفيذ العلاجات المناعية والمستهدفة. للأسف، surviv خالية من التقدمالقاعدة والبقاء على قيد الحياة الإجمالي للحالات المتقدمة لا تزال أقل بكثير من 2 سنوات بالنسبة لغالبية المرضى 4 و 5 و 6. تستدعي هذه الإحصاءات الحاجة إلى مزيد من البحث في تحديد وتطوير علاجات فعالة لقيادة الثورة. للمضي قدما نحو كاف التدخلات العلاجية لمركز تنسيق الانقاذ البحري، وهناك حاجة لأول مرة نماذج ما قبل السريرية translationally ذات الصلة من هذا المرض.

تطوير نموذج ذات الصلة ومتسق لألخص الوضع البشري من RCC المتقدمة ينبغي أن تعالج عدة أسئلة أساسية: 1) هل نموذج ذات الصلة تشريحيا. 2) هل تقدم الورم على نحو مماثل لعلم الأمراض البشري؛ 3) هل الانبثاث تنشأ من الورم الرئيسي. و4) هل يمكن أن ترصد الابتدائي والمنتشر تطور الورم على مر الزمن؟ اعتمادا على نوع من العلاج يجري التحقيق فيها، خطوط الماوس RCC ورم الخلايا، RCC خطوط الخلايا السرطانية البشرية، والإنسان RCC xenog المستمدة من المريضويمكن استخدام الطوافات في مناعيا أو العوز المناعي الفئران. مطلوب المضيف مع الجهاز المناعي سليمة وظيفية لهذه الدراسات تقييم بعض جوانب العلاج المناعي، مما يستلزم استخدام خط الخلية رينكا موصوفة وصفا جيدا مستمدة من غدية الكلى عفوية من BALB / ج الفئران 7. معظم الدراسات حقن خلايا رينكا تحت الجلد (الشوري)، الذي يشكل الورم المحلي سهلة التدبير، أو عن طريق الوريد (IV) في الفئران BALB / ج لإنتاج التجريبية الرئة "الانبثاث" 8، 9، 10، 11، 12. استخدام وسيلة رينكا ورم زرع الشوري لنموذج RCC البشري لديه عدد من القيود، بما في ذلك تعصيب دقيقة من الأوعية الدموية 13، والاختلافات في المكروية 14 و 15، وعدم وجود الجهاز / ورم COMMUNIC الخلويأوجه 13 و 16. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأورام الشوري (لا سيما رينكا) لا metastasize إلى أجهزة البعيدة، مما يعوق دراسة حدث هو شائع السريرية المميزة 17. لدراسة مركز تنسيق الانقاذ البحري، وخلايا رينكا يمكن حقن الرابع لتأسيس عبء الورم في-الرئتين الموقع الأساسي الانبثاث في مرضى RCC. طريقة حقن الرابع من بدء أورام النقيلي، ومع ذلك، لا يسمح التحقيق في كيف ومتى، أو لماذا هاجرت الخلايا من الجهاز الرئيسي (أي الكلى) إلى موقع بعيد. نموذج مع كل من المرض الأساسي والمنتشر واضحا في نفس الحيوان أمر بالغ الأهمية لدراسة التقدم والعلاج من المرض المتقدمة، ولا سيما بالنظر إلى أن الانبثاث وعادة ما تكون سبب للوفيات في هؤلاء المرضى.

وقد وضعت مختبرنا نموذج الفئران من مركز تنسيق الانقاذ البحري الذي يشتمل على كافة الميزات المذكورة أعلاه. لتأسيس العلاقات العامةimary والأورام مثلي، يتم زرع خلايا رينكا مباشرة في الكلى الحيوان من خلال الصفاق شفافة. شق صغير في الجهة اليسرى يسمح لرؤية الطحال (كمعلم) والكلية اليسرى. باستخدام إبرة عيار صغير، يتم حقن الخلايا السرطانية رينكا مباشرة في الكلى من خلال الغشاء البريتوني لزرع مثلي. بالمقارنة مع غيرها من أساليب زرع خلايا رينكا تحت كبسولة الكلى 18، وهذه الطريقة من زرع يسمح للإنتاجية أعلى، كما هو إلى حد ما غير الغازية، لا يحتاج إلى خياطة، هو من فئة ألم منخفضة، وعندما كفاءة في استهلاك للوقت تمارس.

هذا جيدا اتسم نتائج النموذج في عبء استنساخه الأساسي الورم (~ 99٪ معدل اتخاذ) في الكلى حقن فضلا عن تحميل الورم النقيلي في الرئتين. وتشمل المزايا الهامة لهذا النموذج طبيعته مسانج، والسماح لالتحقيقات المناعي. الانبثاث عفوية، وذلك لدراسة ومرض dvanced. وزرع مثلي، وذلك لنمذجة تأثير التشريحية على تطور المرض والعلاج. أن العلاجات التي تهدف إلى استهداف RCC تستفيد كثيرا من الاستفادة من هذا النموذج خلال تجربة غير سريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يصف البروتوكول بعد إجراء التجارب لإحداث ورصد نمو الأورام الكلوية مثلي التجريبية وأي الانبثاث عفوية المحتملة. تتم جميع الإجراءات التالية وفقا للسياسات المؤسسية والإجراءات المعتمدة فيما يتعلق باستخدام إنسانية من حيوانات التجارب.

1. صيانة خطوط الخلية

  1. الحفاظ على الفئران خط خلية غدية الكلوي، رينكا، في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين ستربتومايسين، و 1 ملي كل من غير الضروري من الأحماض الأمينية، L-الجلوتامين والبيروفات الصوديوم (المشار إليها باسم كامل RPMI). خلايا الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: كما هو الحال مع أي خط الخلية المعمول بها، فمن المستحسن استخدام منخفض مرور-عدد الخلايا رينكا لترنسفكأيشن وغرس لاحقة للحد من أي المظهرية أو وراثية التغييرات التي يمكن أن تحدث بعد عبادة طويلة الأجللدى عودتهم.
    1. استخدام نظام ينقول لهندسة الخلايا رينكا للتعبير ثابت البروتين الأخضر الفلورسنت (GFP) ويراعة luciferase.
      1. باستخدام الموجبة القائم على الحويصلية ترنسفكأيشن الكاشف، وشارك في transfect خلايا رينكا مع ناقلات التعبير ترانسبوزاز (pPGK-SB11) والترميز ناقلات ينقول للتعبير عن يراعة luciferase، فضلا عن الترميز الانصهار جين GFP والجينات المقاومة zeocin ، سواء تحت سيطرة النسخي المروج ثنائية الاتجاه (pKT2 / LuBiG) 19.
      2. وبعد يومين، لوحة الخلايا transfected في التخفيف والحد من السماح للخلايا للتوسع في كامل RPMI تستكمل مع zeocin (300 ميكروغرام / مل). تأكيد التعبير GFP في كل نسخة من التدفق الخلوي. وتسمى هذه الخلايا رينكا-GL.
        ملاحظة: سوف الحد، تخفيف الاستنساخ تسمح الخلايا المحددة التي يمكن جنيها من خلية واحدة.
  2. زرع خلايا رينكا intrarenally، وإعداد الخلايا رينكا طn لتعليق وحيدة الخلية في 2 × 10 6 خلية / مل في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS).
    1. إزالة الخلايا الملتصقة رينكا من قارورة زراعة الأنسجة باستخدام التربسين 0.25٪ في HBSS. بعد ~ 5 دقائق، إضافة RPMI الكامل إلى القارورة لتحييد التربسين ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي للغسيل. الطرد المركزي الخلايا في 300 النسبية قوة الطرد المركزي ز (x ج إطار التعاون الإقليمي) لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    2. صب وطاف و resuspend الخلايا في HBSS. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وضبط مستوى الصوت مع HBSS لانتاج 2 × 10 6 خلية / مل.
    3. رسم الخلايا في حقنة 1 مل مزودة إبرة قياس 18 لمنع إجهاد القص على الخلايا. استبدال إبرة قياس 18 بإبرة 28 عيار قبل حقن الخلايا السرطانية. حقنة من 0.1 مل يسلم 2 × 10 5 خلايا في الكلى.

2. إعداد منطقة الجراحي

  1. إعداد الجراحية المعقمةمنطقة في خزانة السلامة البيولوجية عن طريق وضع ثنى الجراحية المعقمة على وسادة التدفئة. جمع كل اللوازم، بما في ذلك ملقط، مشرط، مقص، وقطرات العين، و 5٪ بوفيدون اليود مطهر، ومعقم شاش. الأوتوكلاف جميع الصكوك قبل استخدامها.
  2. إجراء الجراحة باستخدام تقنية طرف العقيم. أدوات Resterilize بين الحيوانات مع حبة تعقيم. ارتداء القفازات المعقمة، معطف المختبر، وقناع الوجه.

3. إعداد الحيوان

  1. تخدير الفئران مع الكيتامين / زيلازين (87.5 ملغ / كغ و 12.5 ملغم / كغم، على التوالي، والملكية الفكرية) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تحديد عمق التخدير عن طريق إجراء أخمص القدمين قرصة.
  2. عندما يعتبر الحيوان غير مستجيبة، وإعداد موقع الحقن (على سبيل المثال، الجناح الأيسر) على الفئران BALB / ج من نتف (بالأصابع) أو الحلاقة (باستخدام كليبرز) الفراء.
  3. نقل الفئران من منطقة الإعدادية جراحة (على سبيل المثال، القفص الإسكان) إلى منطقة العمليات الجراحية وتطبيق البيطري مرهم لعيون لمنع جفاف. تحرري مسحة موقع شق استعداد مع 5٪ بوفيدون اليود مطهر.
  4. حقن هيدروكلوريد بوبيفاكايين (0.1 مل من 2.5 ملغ / مل حل، الشوري) في المنطقة حيث سيتم إجراء شق بمثابة تسكين قبل العملية.
  5. جعل شق واحد (~ 1،0-1،5 سم) في الجهة اليسرى للحيوان باستخدام مشرط معقم أو مقص، وبعناية حتى لا تخترق الغشاء البريتوني. فصل الأدمة من الصفاق مع مقص العقيمة. ربت موقع شق مع الشاش القطن المعقم لإزالة أي دم.
  6. عقد الماوس بكلتا يديه، وذلك باستخدام اليد اليسرى لعقد الرأس واليد اليمنى لدعم الجناح.
  7. تحديد الطحال من خلال الغشاء البريتوني و، مع إصبع واحد من اليد اليمنى، جس الماوس من الأسفل. الآن يجب أن يكون الكلى وضوحا من خلال الغشاء البريتوني. الحفاظ على عقد الشركة من الحيوان إلى توفير التوتر عبر الصفاق والكلى.
  8. وشخص ثان حقن الورم مLLS (المعد في القسم 1.2.) من خلال الصفاق سليمة في مركز الكلى باستخدام حقنة 1 مل مزودة إبرة 28 عيار. ببطء تقديم 0.1 مل (2 × 10 5) من الخلايا. مرة واحدة يتم حقن الخلايا، وعقد الإبرة في مكان 5-10 الصورة للحد من ارتجاعي من الخلايا. ومن المهم أن نشير إلى ضرورة توخي الحذر الشديد خلال هذه الخطوة، والشخص حقن الخلايا سوف تجلب الإبرة في مقربة من أصابع الشخص الذي يمسك الماوس.
  9. إزالة الإبرة وإغلاق شق بطبقة رقيقة من مادة لاصقة الأنسجة غراء سريع.
  10. وضع الحيوان مرة أخرى في قفص نظيفة مع منشفة ورقية معقمة. السماح للحيوانات لاسترداد على وسادة التدفئة. لا تترك الحيوانات غير المراقب خلال فترة النقاهة. لا عودة الحيوانات لظروف السكن القياسية حتى أنها تستقيم والقصية. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية في جميع الإجراءات باستخدام حيوانات المختبر.

4. الحيويةالتصوير الانارة

  1. مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير إضاءة الحيوية.
    ملاحظة: يمكن الحصول على التفاصيل الإجرائية لأداء التصوير إضاءة الحيوية من ليم وآخرون. 20 إشارة وسيفيراز يمكن الكشف عنها في أقرب وقت 24 ساعة بعد زرع الخلايا السرطانية. حيث لا يوجد ورم من الخارج وضوحا في هذا النموذج، لا بد من مراقبة نمو الورم بشكل دوري. اعتمادا على تجربة تصميم، يمكن للنمو الورم مثلي المضي قدما لفترات زمنية مختلفة. واحد الاستفادة من استخدام الخلايا رينكا، معربا عن وسيفيراز هي أن نمو الورم يمكن رصدها بشكل متكرر في نفس الحيوان على فترات منتظمة لمدة التجربة، ويمكن أن يتم استجواب معين من الورم الحاملة والأجهزة خالية من الورم في نقطة النهاية المحددة.
    1. حقن وسيفيرين (0.1 مل من محلول 15 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة) الملكية الفكرية والسماح لها أن تعمم لمدة 10 دقيقة قبل وضع الماوس في نظام التصوير تلألؤ بيولوجي. ضع مو استخدام مع ما يصل الجانب الظهري، وتوالت قليلا على جانبها، من أجل الحصول على الكلى حقن مواجهة.
    2. قياس عبء الورم في فوتونات الضوء المنبعث في الثانية (الفوتون تدفق) داخل منطقة محددة من الفائدة (ROI) باستخدام برمجيات تحليل الصور.
  2. الكميات من عبء الورم في أجهزة الفردية.
    ملاحظة: الكميات لا يمكن أن يؤديها في نقاط زمنية محددة في الأجهزة الفردية بعد إزالتها من الفئران الموت الرحيم.
    1. حقن الفئران مع وسيفيرين، كما في الخطوة 4.1.
    2. بعد 10 دقيقة، الموت ببطء الفئران باستخدام إجراء المعتمدة.
    3. تشريح خارج أجهزة الفائدة (على سبيل المثال، والكلى والرئتين، وانظر القسم 5 أدناه). نقل الأنسجة إلى أطباق بتري 35 × 10 ملم ووضعها في نظام التصوير تلألؤ بيولوجي.
    4. قياس عبء الورم في فوتونات الضوء المنبعث في الثانية (الفوتون تدفق) داخل دوروا محددة باستخدام برمجيات تحليل الصور.
e_title "> 5. الجهاز الحصاد

  1. في نقطة النهاية المحددة للتجربة الفردية، الموت ببطء الفئران الحاملة للورم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المفضلة (على سبيل المثال، CO 2، خلع عنق الرحم، والتخدير جرعة زائدة). ومع ذلك، تجنب التفكك عنق الرحم إذا الرئتين والتي سيتم جمعها بعد التضخم الحبر الهند.
  2. إجراء تقييم الإجمالي من نمو الورم الكلوي الرئيسي في الكلى حقن عن طريق قياس الوزن الرطب الجهاز.
    1. لتحديد كتلة الورم (في ز)، عزل 21 وتزن الكلى الحاملة للورم والكلى المقابل من نفس الماوس، حيث الفرق في وزن الكلوة يحدد كتلة الورم. تشريح بعناية بعيدا أي نوع من الأنسجة الضامة غريبة من الكلى رفعه قبل قياس أوزانها.
  3. تقييم درجة الورم خبيث إلى الرئتين من خلال تضخيم الرئتين مع الهند الحبر قبل الختان وتحديد فورا الرئتين في حل فيكيت لمعشوقة = "XREF"> 22. الحساب اليدوي من الآفات المنتشر على سطح الرئة ويمكن بعد ذلك أن يؤديها.
    1. جعل شق خط الوسط باستخدام مقص بدءا من منتصف البطن، من خلال القفص الصدري، وحتى من خلال الغدد العنق / اللعابية. إزالة بعناية القفص الصدري باستخدام مقص وملقط، دون المساس أنسجة الرئة.
    2. فضح القصبة الهوائية عن طريق إزالة النسيج الضام.
    3. إعداد مل حقنة 3 مع إبرة عيار 18 مليئة 10٪ الهند حل الحبر في HBSS.
    4. باستخدام ملقط، والخيط بعناية خياطة الحرير تحت القصبة الهوائية. وسوف تستخدم هذه لادراك التعادل خارج القصبة الهوائية مرة واحدة تضخم.
    5. إدراج بعناية الإبرة أسفل القصبة الهوائية وخفض ببطء الحقنة لتضخيم الرئتين مع الحل الحبر الهند. ما يقرب من 1-1،5 مل من الهند حل الحبر سوف تنتفخ بالكامل الرئتين.
    6. قرصة القصبة الهوائية اغلاق طريق ربط عدة عقدة، مع خياطة تحت إبرة لمنع ارتجاعي من الحبر.
    7. ازالتهاالبريد الإبرة وبعناية قطع بعيدا النسيج الضام لإزالة الرئتين مبالغ فيها.
    8. في غطاء الدخان الكيميائية، ووضع الرئتين في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل من محلول فيكيت في (35 مل من 95٪ ETOH، 15 مل من درهم 2 O، 5 مل من الفورمالديهايد، و 2.5 مل من حمض الحمضية الجليدية في زجاجة 100 مل) 23.
    9. السماح الرئتين لإصلاح / يزيل اللون ل24 - 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل العد العقيدات الورم destained يدويا.
    10. إزالة الرئتين سليمة بعد destaining وتشريح بعناية الرئتين الثابتة التي كتبها الفص في 35 × 10 مم طبق بيتري. حساب عدد من عقيدات الورم (عقيدات بيضاء) على كل فص تحت المجهر تشريح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وزرع ناجحة من خلايا رينكا يؤدي إلى تطوير ورم في الكلى والانبثاث إلى الرئتين من الفئران. بعد استئصال الورم الحاملة والكلى المقابل، تم قياس الأوزان النسيج الرطب (ز) للتدليل على عبء الورم استنادا إلى زيادة الوزن (الشكل 1). الأورام رينكا يمكن تحديدها من قبل المناعية من خلال cytokeratin 8 و 18 تلطيخ (الشكل 2). للدراسات طولية، كان مزروع خط خلية رينكا، معربا عن وسيفيراز. تم إجراء تصوير للإضاءة الحيوية باستخدام المجراة نظام التصوير (IVIS) لتتبع عبء الورم واستجابة للعلاج على مر الزمن (الشكل 3A). وأكد ورم خبيث في الرئتين عن طريق التصوير إضاءة الحيوية (الشكل 3B) والهند التضخم الحبر الرئة (الشكل 3C).

ق / ftp_upload / 55080 / 55080fig1.jpg "/>
الشكل 1. مثلي زرع الخلايا السرطانية رينكا يشكل كتلة الكلى كبيرة. خلايا رينكا-GL (2 × 10 5 في 0.1 مل) تم حقن intrarenally، وتم تحديد أوزان الكلى الحاملة للورم رفعه والكلى المقابل خالية من الورم في غرام (+ SEM) في يوم 24. ن = 15 tumor- حرة والورم الحاملة الكلى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مناعي صورة مجهرية من الكلى المقابل والحاملة للورم خالية من الورم. خلايا رينكا-GL (2 × 10 5 في 0.1 مل) تم حقن intrarenally، وكان حصاد الكلى الورم الحاملة وخالية من الورم في يوم 12. وكانت الكلى الإضافية المجمدة والمجهزة للimmunofالتصوير luorescence لتصور موقع الكولاجين، cytokeratin 8 و 18، وCD31. اتخذت 10X الصور ومخيط معا لعرض كامل الكلى الحاملة للورم. الحانات النطاق = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مثلي زرع الخلايا السرطانية رينكا يؤدي إلى الانبثاث الرئة عفوية. تم حقن الخلايا A. رينكا-GL (2 × 10 5 في 0.1 مل) intrarenally في الفئران BALB / ج. وقد أخذت صور للإضاءة الحيوية في الأيام المشار إليها. B. في يوم 23، تم رفعه الرئتين من الفئران خالية من الورم والورم الحاملة وأخذت صور للإضاءة الحيوية. قد C. مجموعات متوازية من الفئران في يوم 23 رئاتهم تضخم مع الحبر الهند لتصور العقيدات الورم في الرئة.الحانات النطاق = 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم بروتوكول لنموذج الفأر RCC مثلي. زرع خلايا غدية الماوس ورم الكلى في الكلى الماوس يوفر نموذجا سريريا ذات الصلة من مركز تنسيق الانقاذ البحري. النتائج هذا النموذج في الورم الرئيسي داخل الكلى والانبثاث البعيد في الرئتين، وكلاهما بصمات RCC المتقدمة. وصف المقدمة في هذه الوثيقة هو محدد لخط الخلية رينكا في مناعيا الفئران BALB / ج. باستخدام هذا النموذج مثلي، لقد أظهرنا أن الأورام رينكا تستجيب إلى العلاج المناعي، مما يدل على جدوى هذا النموذج لاختبار العلاجي 17 و 24 و 25 و 26 و 27. القدرة على استخدام خط الخلايا السرطانية مسانج لزرع توفر ميزة لدراسة تطور الورم في حيوان سليمة مناعيا. ومسانج، مثلي، وشخصيت سريريا ذات الصلةristics من هذا النظام توفر نموذج متفوق التي تسمح لاختبار العلاجات في نموذج ما قبل السريرية ذات الصلة. لا يمكن نسخ هذا عندما يتم زرعها تحت الجلد والأورام. ومن المهم الإشارة إلى أن مثل هذا النظام النمذجة لا يقتصر على تقييم المضادة للورم الاستجابات المناعية أو النهج immunotherapeutic المختلفة لعلاج RCC. وسيكون من الممكن استخدام الخلايا السرطانية البشرية مزروع intrarenally في الفئران العوز المناعي، وهذا يتوقف على نوع من التجريب يجري. توافر خطوط الخلايا RCC الراسخة التي يمكن تربيتها في المختبر يحسن من استنساخ هذا النموذج في الجسم الحي مثلي، وجميع الحيوانات يمكن زرعها مع عدد متساو من الخلايا السرطانية في نفس الوقت. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا السرطانية يمكن التلاعب في المختبر قبل الزرع ضمن الكلية تقدم إمكانية للسيطرة على كيفية نمو الخلايا و / أو الاستجابة لإشارات البيئية. قيود واحد مع هذا (ومعظم) implanنماذج الجدول الورم هو أنها التفاف على الأحداث في وقت مبكر المسؤولة عن تشكيل الورم، والمخصصات التي تم توفرها باستخدام نموذج الفأر وراثيا لتشكيل أورام الأصليين.

عيب واحد من طراز مثلي هو عدم القدرة العامة لتصور نمو الورم، وهي الميزة التي تم رصدها بسهولة لورم الشوري طريق قياس الفرجار. التكنولوجيا الحالية باستخدام الخلايا السرطانية وراثيا والتصوير إضاءة الحيوية تسمح لقياس طولية من الأورام الداخلية. لقد أثبتت القدرة على تحديد الورم الكلوي الابتدائي والعبء المنتشر في نقاط زمنية مختلفة استنادا إلى التصوير إضاءة الحيوية و / أو استخراج الجهاز 17 و 24 و 25. وقوة نموذج لدينا هو توافر GFP وخط خلية رينكا، معربا عن وسيفيراز، ولكن النموذج لا تتطلب هذه الميزة للنجاح. لقد اتسمت بها أونموذج RCC thotopic مع خلايا كلا رينكا الوالدين ورينكا-GL. وبعد زرع الخلايا رينكا-GL، الأورام الأولية يمكن قياسها بسهولة عن طريق التصوير إضاءة الحيوية. ويمكن أن يكون من الصعب مراقبة الانبثاث في الحيوان كله، ولكن، وكما الورم الرئيسي يمكن أن تنتج إشارة إلى أن تسيطر على إشارات الدنيا التي يمكن أن تنبعث من موقع النقيلي. استئصال والتصوير أجهزة الفردية من الحيوان كله يسمح التصور النوعي والكمي لالانبثاث في تلك الأجهزة. في النموذج مثلي رينكا، وأورام الكلى الأولية تثير عفوية الانبثاث الصغيرة في الرئتين من الحيوانات في وقت مبكر من 7 أيام بعد الزرع، كما يراها التألق في أنسجة الرئة رفعه 17.

في حين أن استخدام خط الخلايا السرطانية، معربا عن وسيفيراز في هذا النظام يوفر للمستخدم القدرة على تتبع تطور الورم طوليا في نفس الحيوان، كما يوفر للمستخدم مع القدرة على evaluatالبريد دقة تقنية الزرع. الكلى الماوس هو التركيب التشريحي صغيرة، مما يجعل من الممكن، وخاصة عند استخدام إبرة طويلة، لحقن الخلايا السرطانية عن طريق الكلى ومباشرة في الصفاق. التصوير الماوس في غضون عدة أيام من الحقن يحدد مدى المترجمة زرع الخلايا السرطانية في الكلى. ميزة أخرى يمكن أن تعقد الحقن ضمن الكلية هي وجود وفرة من الدهون الحشوية، التي يمكن أن تتراكم والذين تتراوح أعمارهم الحيوان. الكلى مرئيا بسهولة من خلال الغشاء البريتوني في الماوس الخالية من الدهون، ولكن الكلى يمكن أن تصبح حجب تحت فصوص من الدهون الحشوية التي يمكن أن تتطور مع مرور الوقت.

عند انتهاء تجربة معينة، يمكن استخدام عدد من التقييمات لتحديد عبء الورم كامل الجسم. التصوير إضاءة الحيوية للأجهزة رفعه يوفر مقياسا موضوعيا من عبء الورم. الوزن الرطب من الأورام الأولية تطبيع للkidne المقابلذ باعتبارها الرقابة الداخلية يوفر قياس كتلة بالجملة. العبء المنتشر في الرئة ويمكن أيضا أن تحدد من خلال تضخيم الرئتين مع الحبر الهند ككل للسماح التصور العقيدات ورم الرئة البيضاء باستخدام مجهر تشريح. ويمكن لهذه قراءات وضع عبء الورم مجموع الجسم، والتي يمكن استخدامها كأساس للتحقيق الكفاءة العلاجية في مرحلة ما قبل السريرية لتطوير العقاقير. التعبير عن GFP من قبل خلايا رينكا-GL أيضا يفسح المجال لتدفق cytometric يحلل الأنسجة الحاملة للورم. ومع ذلك، يجب توخي الحذر لأي تقييم تدفق cytometric في الكلى الحاملة للورم، وخاصة عند التحقيق في تكوين وحجم أي استجابة المناعية المتولدة نتيجة العلاج. الكلى هي الأجهزة الوعائية للغاية، مما يجعل من المرجح أن تقييم الاستجابة المناعية (سواء المؤيدة للورم أو المضادة للورم) في الكلى الحاملة للورم كلها سوف تشمل كلا من "نسيجيا والأوعية الدموية-المعربةد "الخلايا المناعية في وقت الحصاد الجهاز. لتمييز الأنسجة مقابل الخلايا المناعية في الدم، ونحن نستخدم تقنية حيث يتم حقن المسمى تألقي مكافحة CD45.2 ريتوكسيماب (ماب) رابعا قبل القتل الرحيم. ثم يتم إعداد الكلى لتدفق الخلوي، والذي يتضمن خارج الحي تلطيخ مع مختلف المسمى تألقي مكافحة CD45.2 ماب 28 و 29. تلطيخ المزدوج CD45.2 يميز الخلايا داخل الأوعية الدموية من الأنسجة في وقت الحصاد. ويتيح هذا البروتوكول بسيط تحديد الكريات البيض الرئيسية الأنساب الواردة في الأوعية الدموية التي قد تخلط وإلا فإن تفسير الاستجابات المناعية التكيفية والفطرية في الأنسجة. يلغي هذا البروتوكول أيضا على ضرورة التروية، والتي قد تكون لها عواقب غير مقصودة 28 و 29.

لا يوجد حاليا زيادة التقدير لواستخدام العلاج المناعيلعلاج السرطان. تطوير علاجات تستند مناعيا في المستقبل لمركز تنسيق الانقاذ البحري (وغيرها من أنواع السرطان) تبدأ في المختبر باستخدام نموذج clinically- وفسيولوجيا ذات الصلة. نموذج RCC مثلي الموصوفة هنا يحتوي على عدد من السمات الرئيسية (على سبيل المثال، الورم الرئيسي الكلوي، الانبثاث بعيدة، وقمع المناعة الناجمة عن الورم، ومكونات لرصد الطولي للنمو الورم) لاختبار فعالية من مجموعة متنوعة من طرائق علاجية. ومن المغري أيضا إلى التكهن بأن هذا النموذج يمكن تكييفه في المستقبل لتقييم التقدم في وسائل أخرى لعلاج RCC، مثل العمليات الجراحية و / أو بروتوكولات العلاج التنسيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (R15CA173657 إلى AW وR01CA109446 إلى TSG)، ومعهد السرطان سيمونز (لAW)، وجامعة Minnestoa تسلق مؤسسة سرطان الكلى 4 (لTSG). نشكر الدكتور كريستين اندرسون للحصول على المساعدة مع المناعي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial tears ophthalmic ointment Akorn NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive 3M CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) Purdue Products, L.P. NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) Hospira 0409-1587-50 
Heating pad Sunbeam
Syringes BD 309659
Gauze Venture 908291
Ketamine Phoenix Pharmaceuticals NDC 57319-609-02
Xylazine  Akorn NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387
IVIS Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt GoldBio LUCK-1G
India Ink Chartpak Inc 44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system Neuromics SBT0200
Renca ATCC CRL-2947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
  2. Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
  3. Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
  4. Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
  5. Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
  6. Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
  7. Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
  8. Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
  9. Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
  10. Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
  11. Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
  12. VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
  13. Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
  14. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
  15. Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
  16. Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
  17. Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
  18. Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
  19. Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
  20. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
  21. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
  22. Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
  23. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
  24. James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
  25. James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
  26. James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
  27. Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
  28. Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
  29. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 122، وسرطان الخلايا الكلوية، ورم خبيث، الكلى، مثلي، ضمن الكلية، وسيفيراز
وسرطان الخلايا مسانج ماوس نموذج الإنتقالية الكلوي لتقييم الكمي وطولية من قبل السريرية العلاج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. A., James, B. R., Wilber, … More

Murphy, K. A., James, B. R., Wilber, A., Griffith, T. S. A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies. J. Vis. Exp. (122), e55080, doi:10.3791/55080 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter