Summary
Piezoelektriske kirurgi har medført forbedringer i menneskelige maxillofacial og dental kirurgi. Vi har udviklet en protokol for at optimere piezoelektriske kirurgi for kraniel vindue kirurgi i mus.
Abstract
Multiphoton mikroskopi er blevet bredt tilpasset til imaging neuroner i vivo. Gentagne imaging kræver implantation af en kraniel vindue eller gentagne udtynding af kraniet. Kranie vindue kirurgi udføres typisk med en høj hastighed roterende boremaskine, og mange efterforskere finde det udfordrende for at forhindre boret fra beskadige den sarte dura og blodkar. Omfattende uddannelse og praksis er forpligtet til at fjerne knogle uden skader på underliggende væv og dermed kraniel vindue kirurgi kan være vanskelige og tidskrævende, og producere vævsskader. Piezoelektriske kirurgi, som er flittigt brugt til maxillofacial og dental kirurgi, udnytter ultrasoniske vibrationer til at fjerne knogle uden at beskadige bløde væv. Vi har udviklet en metode, der anvender piezoelektriske kirurgi for at forbedre kraniel vindue kirurgi i mus som forberedelse til multiphoton billeddannelse. Sammenligninger inden for vores lab finde at metoden kræver mindre kirurgi tid og har en lavere gennemsnitlige sats for komplikationer som følge af dural blødning end kraniel vindue kirurgi med en roterende boremaskine.
Introduction
Kranie vindue kirurgi til at forberede multiphoton imaging i vivo gnavere er blevet en vigtig teknik i neurovidenskab. Fjernelse eller udtynding af knoglen er nødvendigt at forberede optiske billeddannelse musen med en multiphoton mikroskop. Denne operation er udført enten ved helt at fjerne et område af knoglen til at afsløre de underliggende dura1eller ved udtynding en region af knoglen uden fuld fjernelse fra dura2. Den tynde kranie tilgang kan producere mindre betændelse og aktivering af mikroglia3 men giver en fladere dybdeskarphed imaging, en mindre billedbehandling vinduesstørrelse (200 µm) og en begrænset tidsperiode, hvor vinduet kan være afbildet på grund af knogle genvækst2 . Tilføjelse af en poleret og forstærket glasvindue (porte) kan øge imaging størrelse og billedbehandling periode men er vanskeligt at udføre4.
Begge aktuelle operationer bruge en høj hastighed roterende boremaskine til tynde eller fjern ben fra kraniet. Den tynde kranie teknik bruger også en skalpel efter boret til yderligere tynde ben2. Havne teknik kræver det ekstra trin i høj hastighed polering med grus4. I en høj hastighed forårsager roterende boremaskine, luft drevet turbine eller elmotor borehoved spin på en høj hastighed. Som roterende Boremaskiner afsnit både knogler og blødt væv, er der en risiko for at beskadige dura og underliggende blodkar. Succesen af operationen afhænger dygtighed af kirurgen. Ud over disse windows tilberedt med mekanisk kirurgiske metoder, har en kemisk metode af optisk clearing kraniet med forskellige løsninger været udviklede5,6. Men da piezoelektriske kirurgi er en mekanisk metode til kirurgi, vores sammenligninger her vil være begrænset til andre mekaniske metoder.
Piezoelektriske kirurgiske enheder bruge ultrasoniske vibrationer til at nedbryde mineraliseret knogle uden skadelige underliggende blødt væv og dermed tilbyde en tilgang til tynd hurtigt et stort område af knoglen. I en piezoelektriske kirurgisk saloner, turbinen er erstattet af en stak af keramiske diske og når nuværende anvendes, diskene vibrere på ultrasonisk frekvenser. Vibrationer, der overføres gennem håndstykker til diamant belagt tips til at skære igennem ben uden skadelige bløde væv, en fordel i forhold til roterende Boremaskiner, der ikke diskriminerer mellem vævstyper. Piezoelektriske kirurgi blev oprindeligt udviklet til brug i human af Tomaso Vercellotti og har ført til forbedringer i dental og Kranio-maxilofacial kirurgi7,8,9,10,11 .
Piezoelektriske kirurgi er blevet brugt til at oprette en osteotomi i Wistar rotter og blev fundet af magnetisk resonans imaging (MR) og histologi at producere betydeligt færre skader end en traditionel dental boremaskine12. Forfatterne konkluderede, at piezoelektriske kirurgi var sikkert for at fjerne knogle nær bløde hjernevæv. Mus, men har en tyndere dura, der er lettere beskadiget, og denne undersøgelse forberede ikke kronisk optiske billeddannelse windows. Kronisk imaging kræver at blodkarrene ikke er beskadigede og at blodpropper ikke udgør under vinduet. Skader på dura fører til betændelse, der forårsager den rude hen til sky, og aktiverer mikroglia og spredning af reaktive astrocytter. Her har vi optimeret piezoelektriske kirurgi for mus til at oprette både tynde kraniet og fuld knogle fjernelse kraniel windows egnet til kronisk billeddannelse. Vi sammenlignede denne kirurgisk teknik til kranie vindue operationer forberedt med en høj hastighed roterende boremaskine.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev udført ifølge standarderne fastsat af Columbia University Medical Center institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). Dødshjælp blev udført via cervikal dislokation under anæstesi med ketamin 100 mg/kg og xylazin 10 mg/kg injiceres intraperitoneal. Alle kirurgiske procedurer blev udført i en steril måde (kirurgen var iført hoved cap, ansigtsmaske, sterile handsker og ren engangs laboratoriekittel) og kirurgiske værktøjer blev autoklaveres mellem hver brug.
1. presurgical trin
- Autoklave alle kirurgiske instrumenter til at sikre sterilitet.
- Bedøver C57bl6 mus med isofluran (4% for induktion og 1.5-2% for kirurgi). Klemmes det bagben tå hver 10 min for at sikre korrekt dybde af anæstesi. Øge anæstesi, hvis vocalization eller hind lemmer retraktion ses.
- Anvende veterinære øje lubricant øjne til at forhindre udtørring.
- Fjerne hår over hovedbunden med en 3 min anvendelse af hår fjernelse gel eller ved barbering med en barbermaskine.
- Placere musen i stereotaxisk rammen på en varmepude eller kalibreret vand recirkulerende tæppe indstillet til 38° C.
- Administrere buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutant for at give presurgical analgesi.
- Desinficere hovedbunden med tre skiftevis anvendelser af chlorhexidin eller betadine og 70% ethanol ved hjælp af en bomuld tippes applikator.
- Indsprøjtes 100 mL bupivacaine fortyndes 50% i saltvand under hovedbunden for at give Lokal anæstesi.
2. piezoelektriske kraniel vindue kirurgi
- Ved hjælp af autoklaveres steril kirurgiske instrumenter, fjerne en 1 cm cirkel af hovedbunden over kraniet ved at skære med kirurgisk saks i et cirkulært mønster. Løft hovedbunden off kraniet udsætter periosteum væv over knoglen.
- Brug spidsen af pincet til at skrabe de udsatte knogle klare eventuelle resterende periosteum væv. Det er vigtigt at sikre, at de dental cement ikke vil falder senere.
- Indstil piezoelektriske kirurgi-enhed til at vibrere på den laveste indstilling. Bemærk, at højere indstillinger kan bryde blodkar på grund af intense vibrationer.
- Fix det sterile cirkulære tip til saloner.
Bemærk: 4 mm rund spids er velegnet til operationer. Stor aflæsse størrelse bidrager til hastigheden af kirurgi som hele vinduet kan fortyndes samtidigt. - Fyld en 10 mL sprøjte med is kold kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) og holde den i hånden ikke holde den piezoelektriske saloner.
- Overrisle kraniet af dryppende ACSF fra sprøjten ind på kraniet med en hastighed på 1 mL/min. Alternativt, skal du bruge en peristaltisk pumpe placeret over kraniet til gratis brug af anden side.
Bemærk: Kunstvanding med kolde ACSF er vigtigt at forhindre overophedning på grund af friktionen fra de højfrekvente vibrationer. - Forsigtigt anvende den vibrerende kirurgisk tip til kranium med en let cirkulær bevægelse (3 cirkler per 1 s) og tynde ben til den ønskede dybde til at udføre en tynd kraniet forberedelse (5-10 min).
Bemærk: Her, 4 mm windows blev foretaget, blev tyndet til 20 µm. Men vinduets størrelse varierer med størrelsen af den kirurgiske tip. Tykkelsen af knoglen kan justeres til den ønskede dybde baseret på længden af tid at anvende spidsen på kraniet. - Forsigtigt justere vinklen på saloner og ændre vinklen på spidsen mens pressionsmiddel til kraniet at tynde kraniet ensartet.
- For at udføre en komplet knogle fjernelse uden at efterlade nogen tynde ben bag, tynde ben indtil revner er synlige omkring den rude område. Fjern de resterende flager af tynde knogler med pincet uden at skade den underliggende dura.
- Sættetid en 1 mm stykke hæmostatisk kollagen skum i kolde ACSF. Hold den våde skum med pincet og placere den på det tynde kraniet. Gør det muligt at sidde på det tynde kraniet for omkring 30 s til at stoppe enhver micro blødninger fra udviklingslande.
- Bruge pincet til at placere en 4 mm glas coverslip lateralt over det vindue, der har været tyndet i knoglen.
- Bruge bagsiden af en lille plastik eller træ bomuld tippes applikator til at anvende ca 100 µL af dental akryl til kraniet at holde vinduet på plads.
3. post kirurgisk behandling
- Fjerne musen fra den kirurgiske apparater og placere det i en opvarmet bur til nyttiggørelse. Overvåge den løbende indtil den har genvundet fuld bevidsthed (vurderet af normale mobilitet, gangart og adfærd).
- Vurdere dyrene to gange om dagen for tre dage for manifestationer af post-operative smerter herunder nedsat aktivitet, grooming, mad og vandforbrug, bevogtning adfærd (fx halter eller en foroverbøjet kropsholdning) eller øget aggression. Returnere ikke dyret til selskab med andre dyr, indtil det er fuldt tilbagebetalt.
- Administrere buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) subcutaneously som en smertestillende 8 – 12 h efter operation for 3 dage. Overvåge område af vinduet nøje efter operation for opspringning, inflammation og tegn på infektion. Hvis dyret ikke vende tilbage til baseline fodring og soignering adfærd, konsultere en dyrlæge om mulige interventioner eller eutanasi.
Representative Results
Før du fortsætter med piezoelektriske kirurgi, skal du fjerne eventuelle resterende periosteum fra kraniet. Når kraniet er uigennemsigtig og glat (figur 1a), kirurgen kan begynde piezoelektriske kirurgi. Når du fjerner ben med det vibrerende piezo tip, det er afgørende at overrisle kraniet med is kold ACSF. Korrekt vanding opnås når bunden 1 mm i spidsen er nedsænket i ACSF (figur 1b). Uden ordentlig kunstvanding, bliver knoglen overophedet og skade hjernen. Efter kraniet har været tyndet til den ønskede dybde valgt af kirurgen, kan der være nogle resterende blødning fra blodkar placeret i knoglen. Ophøre hurtigt alle blødning, anvende en lille 1 mm stykke af kollagen skum dyppet i ACSF til området af vinduet. Lad kollagen sidde på kraniet for ca 30 s (figur 1 c). Når kollagen skum er fjernet, vises vinduet halvgennemsigtige, så klart visualisering af blodkar i dura. Dura vil være intakt uden betydelig blå mærker. (Fig. 1 d). Hvis dura vises røde og betændte, er det sandsynligt på grund af brudte blodkar fra for meget pres på spidsen under operationen. For at beskytte det nye vindue og forberede kronisk imaging, skal et glas coverslip placeres over området. Et korrekt anvendt glas coverslip forsigtigt vil sidde på toppen af vinduet og vil ikke forårsage nogen skade på området. Glas coverslip skal dække hele vinduet. Hvis glas coverslip anvendes korrekt på kraniet, forbliver vinduet halvgennemsigtige under glas. Alle blodkar i dura vil stadig være synlige (figur 1e). Dental akryl skal anvendes omkring glas coverslip permanent overholde det til overfladen af kraniet. Kanterne af glas coverslip skal også være omfattet i dental akryl (figur 1f).
Vi fandt, at piezoelektriske kirurgi er typisk meget hurtigere end en traditionel kraniel vindue, tager omkring 10-12 min. pr. kirurgi (figur 2A). Vi fandt også, at der var færre komplikationer på grund af dura blå mærker og blødning som observeret af øjet (figur 2B). Et ordentligt forberedt vindue vil tillade multiphoton billeddannelse af fluorescerende indikatorer i kortikale neuroner in vivo. Vi valgte at billedet den røde calcium indikator JRGECO1a i celle organer af lag 4 kortikale neuroner (figur 3A-3B). Vi kunne observere calcium transienter i disse celle organer gennem vinduet udarbejdet ved hjælp af PHASOR.
Figur 1: piezoelektriske kirurgi. (en) i kraniet, efter det er blevet ordentligt forberedt til PHASOR. Den periosteal væv er blevet fjernet, forlader en glat og ren overflade. (b) et repræsentativt billede af PHASOR i gang. I bunden 1 mm af den vibrerende kirurgisk tip er neddykket i is koldt ACSF. Væsken påføres kranium med en hastighed på 1 mL/min. En let cirkulær bevægelse er anvendt på kraniet og knoglerne er tyndet via ultrasoniske vibrationer. (c) når kraniet har været tyndet, en 1 mm cirkulære stykke af kollagen skum gennemblødt i kolde ACSF får lov til at hvile på vinduet for at stoppe enhver mikro blødninger fra knoglen. (d) A vellykket vindue med en gennemskinnelig dura viser alle de intakte blodkar. Der er ingen synlige skader eller blå mærker på overfladen af hjernen. (e) en glas coverslip er placeret over vinduet for at beskytte overfladen af hjernen. (f) Dental akryl påføres kraniet til permanent løse glas coverslip over vinduet. Skalere bar 1 mm i alle billeder.
Figur 2. Sammenligning af succesrate i uddannelse for PHASOR eller dental bore kirurgi. (A) Gennemsnitlig tid pr. operation var lavere for PHASOR end dental drill operationer (p < 0,05, to tailed t test) n = 30 operationer pr. gruppe og gennemsnitlig 10 operationer pr. kirurg. (B) procentdelen af vellykkede operationer (defineret som ingen blødning eller synlige skader på dura som observeret af kirurgens øje gennem mål, at 350 X zoom) var højere for PHASOR end dental drill operationer (n = 30 operationer for hver gruppe, en tailed z-test). Fejllinjer Vis SD.
Figur 3. Multiphoton imaging i vivo gennem et kranie vindue fortyndet med PHASOR. (A) Calcium transienter observeret med røde calcium indikator JRGECO1a var afbildet i lag 4 pyramideformet neuroner i murine motor cortex in vivo. Skalalinjen = 100 µm. (B) det samme vindue men anden region i lag 4 motor cortex. Headfixed mus med 3 mm vindue tilberedt med PHASOR. Skalalinjen = 30 µm. filmede med et multiphoton mikroskop, 40 X mål, 1040 nm excitation bølgelængde.
Discussion
Operationen kan ændres ved at ændre den kirurgiske spids. Der er mange forskellige størrelser af tip, der kan anvendes til saloner. Ændre størrelse eller form af spidsen vil resultere i forskellige størrelse vinduer. Ud over 4 mm spidsen, vi også prøvet en 3 mm spids og fandt det også fungerede godt. Selv med kunstvanding med is koldt ACSF, vi har ikke kunnet få gode resultater med tips, der også var indsnævre (ca. 0,25 mm) på grund af de koncentrerede vibrationer forårsager for meget varme og brændende ben fører til skade for den underliggende dura. Vi har ikke prøvet mange andre tips, der er tilgængelige, og vi forventer, at andre laboratorier kan finde nye anvendelser for disse forskellige tips. Kirurgi er forholdsvis ligetil, fandt vi, at der er flere trin, der kan kræve fejlfinding. Først er, at den vibrerende spids producerer en masse uro i ACSF, hvilket mindsker synligheden og producerer svært ved at vurdere knogle dybde under knogle udtynding trin i operationen. Vi anbefaler, at hvis det er for svært at se, hvor tynd knoglen er, tage en pause til at tørre kraniet og vindue ved at anvende en steril vatpind på siden af knoglen. Gælde ikke vatpinden direkte til vinduet, da den ru overflade er skadelig for tynde ben. Efter at have kontrolleret dybden, genanvende ACSF og fortsætte med kirurgi. Vi fandt også, at hvis der er skader på dura, det er normalt på grund af kirurgen lægger for meget pres på spidsen. Holder håndstykker mere forsigtigt og anvende mindre kraft vil sandsynligvis løse problemet. Hvis kirurgen er med magt skrabning tip på knoglen, vil det forårsage en pause i den tynde knogle og beskadige kraniet. Endelig, hvis den underliggende dura vises efter udtynding af knoglen, forslået, det er sandsynligvis på grund af overskydende varme fra vibrationer. Øge ACSF flow vil løse dette problem.
Den største begrænsning af PHASOR er at håndstykker kan tynde ben, men kan ikke Fjern alle ben over dura. Diamond belagt tip har lille ru bump. Gnide nødvendige for at tynde kraniet ville slib dura og forårsage blødning hvis det blev brugt til at fjerne alle knogle. Således kræves brug af pincet til at fjerne de resterende tynde lag. Mens der er igangværende debat om hvorvidt billeddannelse gennem en tynd kraniet producerer mindre betændelse og mindre spredning af mikroglia og reaktive astrocytter, i nogle tilfælde foretrækkes et vindue med ingen knogle resterende, f.eks., at give en større dybde af imaging3 .
Vi har optimeret kraniel vindue forberedelse for multiphoton billeddannelse i mus. PHASOR er, at vores viden, den første anvendelse af piezoelektriske teknik til gnaver kraniel vindue kirurgi for optiske billeddannelse. Vi finder, at anvendelsen af piezoelektriske kirurgi i mus deler fordelene ved øget hastighed og faldt bivirkninger også rapporteret i mennesker7,8,9,10. Udnyttelse af piezoelektriske enheden resulterede i hurtigere operationer (figur 2A) og færre utilsigtede hændelser for blødning i forhold til et højhastighedstog roterende bore (figur 2B). Vi fandt også, inden for vores lab, at PHASOR var lettere for nye kirurger til at lære end traditionelle tilgange til kranie vindue kirurgi. Fordele ved hastighed og brugervenlighed er tilbøjelige til at variere blandt kirurger. Tynde kraniet præparater kræver typisk 30-45 min til tynde ben med en boremaskine og skalpel2, mens PHASOR tilgangen kræver typisk mindre end 10 min.
Vi fandt, at vi i windows tilberedt med PHASOR kunne billede calcium transienter i lag 4 pyramideformet neuroner i motoriske cortex, der havde været transfekteret med adeno-associeret virus kodning calcium indikator JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). vi har også fundet, at sammenlignet med en tynd kraniet kraniel vindue forberedt med en roterende boremaskine og skalpel, imaging regionen var større, og samtidig en tynd kraniet forberedt med en roterende boremaskine og skalpel har en billeddannelse vindue på 20 µm i diameter2 . Med PHASOR kunne vi hurtigt tynd et område med 3-4 mm. Dette er lignende til vinduet imaging rapporteret med porte4. Denne større vindue bevarer fordelen ved hurtig billedbehandling rapporteret til tynde kraniet windows forberedt med en dental boremaskine og skalpel. Desuden vinduet tilberedt med PHASOR kan straks afbildet, i modsætning til traditionelle knogle fjernelse vinduer, der kan kræve uger til at helbrede før vinduet kan være optimalt afbildet3.
Denne teknik kan anvendes til at studere ændringer i blodgennemstrømningen i fartøjer under dura. En vigtig fremtidig undersøgelse er at sammenligne immunoreactivity for PHASOR med andre metoder til kranie vindue. Det ville være vigtigt at fastslå, hvis PHASOR producerer mindre betændelse i forhold til eksisterende metoder. Vi håber, at den piezoelektriske kirurgisk teknik dokumenteret her vil tillade flere labs at udføre kraniel windows og med held bruge multiphoton imaging in vivo.
Sørg for at saloner er indstillet til at vibrere på den laveste indstilling og at ACSF er kunstvandet, med en konstant hastighed. Is kold ACSF skal anvendes konstant eller det vil varme op og skade dura. Vi fandt, at ACSF skal anvendes med en hastighed på mindst 1 mL/min. enten bruge en sprøjte holdes i hånden, eller bruge en peristaltisk pumpe, snarere end indbygget vanding i saloner. Vandingsanlæg i håndstykker skubber ACSF også kraftigt og producerer for meget turbulens, som væsentligt vil forringe synligheden.
Disclosures
Der er ingen afsløringer.
Acknowledgments
Tamara Zeric for at hjælpe med at få det multiphoton billede i dette papir. Støttet af hjernen & adfærd, Parkinsons og JPB fundamenter, R01 MH108186 og R01 DA07418. F31 stipendium 1F31MH109293-01A1 til S C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
| Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
| Stereotax frame | Kopf | 963 | |
| Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
| Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
| C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
| Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
| Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Mice | JAX | 664 | |
| Prairie Ultima multiphoton microscope | Bruker | ||
| JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |
References
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice. Nat protoc. 12, 213-220 (2010).
- Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing. Laser Physics Letters. 9, (2012).
- Yang, X., et al. Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging. IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).
- Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).
- Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure. Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).
- Vercellotti, T., Podesta, A. Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).
- Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. Piezoelectric surgery in implant dentistry. Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).
- Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction. J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).
- Pavlikova, G., et al. Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model. Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).
