Summary
Piezoelektriske kirurgi har ført til forbedringer i menneskelig maxillofacial og dental kirurgi. Vi har utviklet en protokoll for å optimalisere piezoelectric kirurgi for kraniale vinduet kirurgi i mus.
Abstract
Multiphoton mikroskopi er mye tilpasset imaging nerveceller i vivo. Gjentatte imaging krever implantasjon av skallen-vinduet eller gjentatte fortynning av skallen. Skallen vinduet kirurgi utføres vanligvis med en høy hastighet roterende drill, og mange etterforskere synes det er vanskelig for å forebygge bore skade delikat dura og blodkar. Omfattende opplæring og praksis er nødvendig for å fjerne benet uten skade på underliggende vev og dermed skallen vinduet kirurgi kan være vanskelig, tidkrevende, og produsere vevsskade. Piezoelektriske kirurgi, som er mye brukt for maxillofacial og dental kirurgi, bruker ultralyd vibrasjoner for å fjerne bein uten å skade bløtvev. Vi har utviklet en metode å bruke piezoelectric kirurgi for å forbedre skallen vinduet kirurgi i mus i forberedelse til multiphoton imaging. Sammenligninger i vår lab finne at metoden krever mindre kirurgi tid og har en lavere gjennomsnittlig pris for komplikasjoner på grunn av dural blødning enn skallen vinduet kirurgi med en roterende drill.
Introduction
Skallen vinduet kirurgi å forberede gnagere multiphoton imaging i vivo har blitt en viktig teknikk i nevrovitenskap. Fjerning eller fortynning av bein er nødvendig å forberede musen optiske bildebehandling med multiphoton mikroskop. Denne operasjonen utføres enten ved å helt fjerne et område av bein å eksponere den underliggende dura1, eller av thinning en region av bein uten fullstendig fjerning fra dura2. Den tynne skalle tilnærmingen kan produsere mindre betennelse og aktivering av microglia3 , men gir en grunnere dybdeskarphet tenkelig, mindre tenkelig vindusstørrelse (200 µm) og en begrenset tidsperiode der vinduet kan avbildes på grunn av bein gjenvekst2 . Tillegg av en polert og forsterket glassvindu (porter) kan øke tenkelig størrelse og tenkelig periode, men er vanskelig å utføre4.
Både gjeldende operasjoner bruker en høyhastighets roterende drill tynn eller fjerne bein fra skallen. Tynn skallen teknikken bruker også en skalpell etter øvelsen å ytterligere tynne bein2. Porter teknikken krever høy hastighet polering med grus4ekstra trinn. I høy hastighet fører roterende drill, luften drevet turbin eller elektrisk motor borekronen å spinne på en høy hastighet. Som roterende øvelser delen både bein og bløtvev, er det en risiko for skade dura og underliggende blodkar. Suksessen til operasjonen avhenger av dyktighet av kirurgen. I tillegg til disse vinduene med mekanisk kirurgiske metoder, blitt en kjemisk metode for optisk fjerne skallen med ulike løsninger utviklet5,6. Men siden piezoelectric kirurgi er en mekanisk kirurgi, vil våre sammenligninger her være begrenset til andre mekaniske metoder.
Piezoelektriske kirurgisk enheter bruker ultralyd vibrasjoner å bryte ned mineralholdig bein uten skadelige underliggende bløtvev og dermed tilby en tilnærming for å raskt tynne et stort område av bein. I en piezoelectric kirurgisk handpiece, turbinen er erstattet av en stabel av keramiske plater og når gjeldende brukes, diskene vibrerer på Ultralydutstyr frekvenser. Vibrasjoner overført gjennom handpiece til diamond belagt tips å skjære gjennom bein uten skade bløtvev, en fordel over roterende øvelser som ikke diskriminerer mellom vev. Piezoelektriske ble opprinnelig utviklet for bruk i human av Tomaso Vercellotti og har ført til forbedringer i dental og Kranio-maxilofacial kirurgi7,8,9,10,11 .
Piezoelektriske kirurgi er brukt til å opprette en osteotomi i Wistar rotter og ble funnet av magnetisk resonans imaging (MRI) og histology å produsere mindre skade enn en tradisjonell tannlege bore12. Forfatterne konkluderte med at piezoelectric kirurgi var trygt for å fjerne beinet nær myk hjernevev. Mus, men har en tynnere dura som er lettere skadet, og at studien har ikke forberede windows kronisk optisk tenkelig. Kronisk imaging krever at blodkarene ikke er skadet og at blodpropp ikke form under vinduet. Skade dura fører til betennelser som fører til at vinduet til cloud, og aktiverer microglia og spredning av astrocyttene og reaktiv. Her har vi optimalisert piezoelectric kirurgi for mus å lage både tynne skallen og full bein fjerning skallen windows egnet for kronisk bildebehandling. Vi sammenlignet dette kirurgisk teknikk til skallen vinduet operasjoner med en høyhastighets roterende drill.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til standarder angi ved Columbia University Medical Center institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). Eutanasi ble utført via cervical forvridning under anestesi med ketamin 100 mg/kg og xylazine 10 mg/kg injisert intraperitoneally. Alle kirurgiske prosedyrer ble utført i et sterilt måte (kirurg hadde hodet cap, ansiktsmaske, sterile hansker og ren disponibel Laboratoriefrakk) og kirurgiske verktøy var autoklaveres mellom hver bruk.
1. presurgical trinn
- Autoclave alle kirurgiske instrumenter slik sterilitet.
- Bedøve C57bl6 mus med isoflurane (4% for induksjon og 1,5-2% for kirurgi). Knip bakben tå hvert 10 min for å sikre riktig dybde av anestesi. Øke anestesi hvis vocalization eller hind lem retraksjon er sett.
- Bruke veterinær øye smøremiddel øynene for å hindre tørking.
- Fjerne håret over hodebunnen med et 3 min program for fjerning hårgelé eller barbering med en elektrisk barberhøvel.
- Sted musen i stereotaxic rammen på en varmeputen eller kalibrert resirkuleringsanlegg teppe sett til 38° C.
- Administrere buprenorfin (0,1 mg/kg) subcutaneously for å gi presurgical analgesi.
- Rense hodebunnen med tre vekslende programmer av chlorhexidine eller betadine og 70% etanol bruker en hytten guessing applikatoren.
- Sette inn 100 mL bupivacaine utvannet 50% i saltvann under hodebunnen å gi lokalbedøvelse.
2. piezoelectric skallen vinduet kirurgi
- Bruker autoklaveres sterilt Kirurgiske instrumenter, fjerne en 1 cm sirkel av hodebunnen over skallen ved å kutte med kirurgisk saks i et sirkulært mønster. Løft hodebunnen av skallen utsette periosteum vev over benet.
- Bruk spissen av tang til å skrape det utsatt beinet klar av alle gjenværende periosteum vev. Dette er viktig å sikre at tannlege sement ikke vil falle av senere.
- Angi tidsenheten piezoelectric kirurgi til å vibrere på lavest innfatning. Merk at høyere innstillinger kan bryte blodkar på grunn av sterke vibrasjoner.
- Fastsette sterilt sirkulær spissen å handpiece.
NOTE 4 mm runde spissen er godt egnet for operasjoner. Den store størrelsen bidrar til hastigheten på operasjonen som hele vinduet kan thinned samtidig. - Fyll en 10 mL sprøyte med isen kalde kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) og holde den i hånden ikke holder den piezoelectric handpiece.
- Vanne skallen av dryppende ACSF fra sprøyten til skallen med en hastighet på 1 mL/min. Alternativt, bruk en peristaltiske pumpe plassert over skallen til gratis bruk av den andre hånden.
Merk: Vanning med kaldt ACSF er viktig å unngå overoppheting på grunn av friksjonen fra høyfrekvente vibrasjoner. - Forsiktig gjelder vibrerende kirurgisk spissen skallen med lette sirkelbevegelser (3 sirkler per 1 s) og tynne bein til ønsket dybde til å utføre en tynn skallen forberedelse (5-10 min).
Merk: Her, 4 mm windows ble laget som ble tynnet å 20 µm. Imidlertid størrelsen på vinduet varierer avhengig av størrelsen på kirurgisk spissen. Tykkelsen av benet kan justeres til ønsket dybde basert på lengden på tiden bruke spissen på skallen. - Forsiktig justere vinkelen på handpiece og endre vinkelen på spissen pressmiddel til skallen tynn skallen jevnt.
- For å utføre en fullstendig bein fjerning uten å forlate noen tynne bein bak, tynne bein til sprekker er synlige rundt vindusområdet. Fjern gjenværende flak av tynne bein med tang uten å skade den underliggende dura.
- Suge en 1 mm stykke hemostatic kollagen skum i kalde ACSF. Hold våt skum med tang og plassere den på tynn skallen. La det sitte på tynn skallen for om 30 å stoppe noen micro blør fra utviklingsland.
- Bruk tang til å plassere en 4 mm glass dekkglassvæske sidelengs over vinduet som har vært tynnet i benet.
- Bruk baksiden av en liten plastikk eller tre bomull tippet applikator gjelder ca 100 µL av dental akryl til skallen å holde vinduet på plass.
3. innlegg kirurgisk behandling
- Fjerne musen fra kirurgisk apparatet og plasserer den i en oppvarmet bur for gjenoppretting. Overvåke den kontinuerlig før det har gjenvunnet full bevissthet (vurdert av normale mobilitet, gangart og virkemåte).
- Vurdere dyrene to ganger om dagen i tre dager for manifestasjoner av post-kirurgiske smerte inkludert redusert aktivitet, grooming, mat og vannforbruk, vokter atferd (f.eks halte eller en sammenkrøket holdning) eller økt aggresjon. Ikke tilbake dyret til selskapet av annet dyrene før det er helt gjenopprettet.
- Administrere buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) subcutaneously som et smertestillende 8-12 h etter operasjonen for 3 dager. Overvåke området i vinduet tett etter kirurgi for dehiscence, betennelse og underskriver av infeksjon. Hvis dyret ikke tilbake til opprinnelige fôring og grooming atferd, oppsøke veterinær angående mulige intervensjoner eller euthanasia.
Representative Results
Før du utfører piezoelectric kirurgi, fjerne eventuelle gjenværende periosteum fra skallen. Når skallen er ugjennomsiktig og glatt (figur 1a), kirurgen kan begynne piezoelectric kirurgi. Når du fjerner bein med vibrerende piezo spissen, er det avgjørende å vanne skallen med isen kalde ACSF. Riktig vanning oppnås når bunnen 1 mm tips er neddykket i ACSF (figur 1b). Uten riktig vanning, vil bein overopphetes og skade hjernen. Etter skallen har vært tynnet til ønsket dybde utvalgt av kirurg, kan det være noen rester blødning fra blodårene i benet. For å raskt slutte alle blødning, gjelder en liten 1 mm stykke kollagen skum dynket i ACSF til området i vinduet. La kollagen sitte på skallen for ca 30 s (figur 1 c). Når kollagen skum er fjernet, vises vinduet gjennomsiktig, slik at tydelig visualisering av blodkar i dura. Dura vil være intakt uten vesentlig blåmerker. (Figur 1 d). Hvis dura vises rød og betent, skyldes dette sannsynligvis ødelagte blodkar fra for mye press på spissen under operasjonen. For å beskytte det nye vinduet og klargjøre den for kronisk imaging, må et glass dekkglassvæske plasseres over området. En riktig anvendt glass dekkglassvæske forsiktig vil sitte på toppen av vinduet og vil ikke føre til skade området. Glass dekkglassvæske må dekke hele vinduet. Hvis glass dekkglassvæske brukes riktig skallen, forblir vinduet gjennomsiktig under glasset. Alle blodkar i dura vil fortsatt være synlig (figur 1e). Dental akryl må brukes rundt glass dekkglassvæske permanent følge det overflaten av skallen. Kantene av glasset dekkglassvæske må også være dekket i dental akryl (figur 1f).
Vi fant at piezoelectric kirurgi er vanligvis mye raskere enn en tradisjonell skallen vindu, tar ca 10-12 minutter per kirurgi (figur 2A). Vi fant også at det var mindre komplikasjoner på grunn av dura blåmerker og blødninger som observert av øyet (figur 2B). En skikkelig forberedt vinduet kan multiphoton imaging fluorescerende indikatorer i kortikale nevroner i vivo. Vi valgte å image røde kalsium indikatoren JRGECO1a i cellen legemer lag 4 kortikale nevroner (figur 3A-3B). Vi kan observere kalsium transienter i disse cellen legemer gjennom vinduet tilberedt med PHASOR.
Figur 1: Piezoelectric kirurgi. (en) skallen når det er skikkelig forberedt for PHASOR. Alle periostal vev er fjernet, etterlot en glatt og ren overflate. (b) et representativt bilde av PHASOR pågår. Bunnen 1 mm av den vibrerende kirurgisk tips er neddykket i isen kalde ACSF. Væsken brukes til skallen med en hastighet på 1 mL/min. Lette sirkelbevegelser brukes til skallen og bein er tynnet via ultralyd vibrasjoner. (c) etter skallen har vært tynnet, en 1 mm rund bit av kollagen skum dynket i kaldt ACSF er lov til å hvile på vinduet for å stoppe noen mikro blør fra benet. (d) en vellykket vindu med en gjennomsiktig dura viser alle intakt blodkar. Det er ingen synlige skader eller blåmerker på overflaten av hjernen. (e) et glass dekkglassvæske er plassert over vinduet for å beskytte overflaten av hjernen. (f) Dental akryl brukes til skallen permanent fikse glass dekkglassvæske over vinduet. Skalere bar 1 mm i alle bilder.
Figur 2. Sammenligning av suksessrate i trening for PHASOR eller tannlege bore kirurgi. (A) gjennomsnittlig tid per kirurgi var lavere for PHASOR enn tannlege bore operasjoner (p < 0,05, to tailed t-test) n = 30 operasjoner per gruppe og gjennomsnittlig 10 operasjoner per kirurg. (B) andelen vellykkede operasjoner (definert som ingen blødning eller synlig skade dura observert av kirurgens øye gjennom målet satt til 350 X zoom) var høyere for PHASOR enn tannlege bore operasjoner (n = 30 operasjoner for hver gruppe, en tailed z-test). Viser SD.
Figur 3. Multiphoton imaging i vivo gjennom et skallen vindu tynnet med PHASOR. (A) kalsium transienter observert med indikatoren røde kalsium JRGECO1a ble avbildet i lag 4 pyramidale nevroner i murine motorisk cortex i vivo. Skala bar = 100 µm. (B) vinduet men annerledes område av lag 4 motorisk cortex. Headfixed musen med 3 mm vindu med PHASOR. Skala bar = 30 µm. Imaged med multiphoton mikroskop, 40 X mål, 1040 nm eksitasjon bølgelengde.
Discussion
Operasjonen kan endres ved å endre kirurgisk spissen. Det er mange forskjellige størrelser av tips som kan brukes i handpiece. Endre størrelsen eller formen tips vil resultere i forskjellige størrelser Vinduer. I tillegg til 4 mm spissen, vi også prøvde en 3 mm tips og fant det også fungerte bra. Selv med vanning med is kaldt ACSF, vi var ikke kjøpedyktig bli gode resultater med tips som var for smale (ca. 0,25 mm) på grunn av konsentrert vibrasjonene forårsake for mye varme og brenning benet som fører til skade til underliggende dura. Vi har ikke prøvd en rekke andre tips som er tilgjengelig, og vi forventer at andre laboratorier kan finne nye programmer for disse ulike tips. Operasjonen er relativt ukomplisert, fant vi at det er flere trinn som krever feilsøking. Først er at vibrerende spissen produserer mye turbulens i ACSF, som reduserer synligheten og produserer vanskeligheter med å konstatere bein dybde under bein tynning trinn i operasjonen. Vi anbefaler at hvis det er for vanskelig å se hvordan tynne bein er, ta en pause tørke skallen og vinduet ved å bruke en steril bomull swab ved siden av benet. Gjelde ikke bomullspinnen direkte til vinduet siden grov overflaten er skadelig for tynne bein. Etter å sjekke dybden, nytt ACSF og fortsette med operasjonen. Vi fant også at hvis det er skade på dura, det skyldes vanligvis kirurgen legger for mye press på spissen. Holder handpiece mer forsiktig og bruke mindre ville sikkert fastsette problemet. Hvis kirurgen makt skraping spissen på benet, vil det forårsake et brudd i tynne bein og skade skallen. Til slutt, hvis etter tynning benet, underliggende dura vises mørbanket, skyldes dette sannsynligvis overskuddsvarme fra vibrasjoner. Økende hastighet på ACSF flyt løser dette problemet.
Den viktigste begrensningen av PHASOR er at handpiece kan tynne bein, men kan ikke fjerne alle benet over dura. Diamond belagt spissen har små grov støt. Rubbing måtte tynn skallen vil slipes dura og forårsake blødninger hvis den ble brukt til å fjerne alle benet. Bruk av Tang må derfor fjerne de gjenværende tynt lag. Mens det er pågående debatten om imaging gjennom en tynn skallen produserer mindre betennelse og mindre spredning av microglia og reaktive astrocyttene, i noen tilfeller foretrekkes et vindu med ingen bein gjenværende, f.eks å gi en større dybde Imaging3 .
Vi har optimalisert skallen vinduet forberedelse til multiphoton imaging i mus. PHASOR er, vi vet, den første anvendelsen av piezoelectric teknikken til gnager skallen vinduet kirurgi for optisk tenkelig. Vi finner at bruk av piezoelectric kirurgi i mus aksjer fordelene av økt hastighet og redusert uønskede hendelser også rapportert i mennesker7,8,9,10. Utnyttelse av piezoelectric enheten resulterte i raskere operasjoner (figur 2A) og færre bivirkninger av blødning i forhold til en høyhastighets rotary bore (figur 2B). Vi fant også, i vår lab, at PHASOR var lettere for nye kirurger å lære enn tradisjonelle tilnærminger til skallen vinduet kirurgi. Fordeler av fart og brukervennlighet er sannsynlig å variere blant kirurger. Tynn skallen forberedelser krever vanligvis 30-45 minutter å tynne bein med en drill og skalpell2, mens PHASOR tilnærming krever vanligvis mindre enn 10 min.
Vi fant at i windows med PHASOR kunne vi bildet kalsium transienter i lag 4 pyramidale nevroner i motorisk cortex som hadde vært transfekterte med adeno assosiert virus koding indikatoren kalsium JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). vi fant også at, sammenlignet med en tynn skallen skallen vindu med en roterende drill og skalpell, tenkelig regionen var større, mens en tynn hodeskalle med en roterende drill og skalpell har en tenkelig vinduet på 20 µm diameter2 . Med PHASOR kunne vi raskt tynn et område av 3-4 mm. Dette ligner på vinduet bildebehandling med porter4. Dette større vinduet beholder fordelen av rask bildebehandling rapportert for tynne skallen windows med en tannlege bore og skalpell. Videre vinduet med PHASOR kan avbildes umiddelbart, i motsetning til tradisjonelle bein fjerning windows som krever uker å helbrede før vinduet kan optimalt fotografert3.
Denne teknikken kan brukes for å studere endringer i blodstrømmen i skipene under dura. En viktig fremtidig studien er å sammenligne immunoreactivity av PHASOR med andre metoder i skallen-vinduet. Dette vil være viktig å bestemme om PHASOR produserer mindre betennelse i forhold til eksisterende metoder. Vi håper at piezoelectric kirurgiske teknikken dokumentert her vil tillate mer labs for å utføre skallen windows og bruke multiphoton imaging i vivo.
Kontroller at handpiece er satt til å vibrere på lavest innfatning og at ACSF er blir Vannes konstant. Iskald ACSF må brukes hele tiden, eller det vil varme opp og skade dura. Vi fant at ACSF må brukes med en hastighet på minst 1 mL/min. enten bruke en sprøyte holdt i hånden, eller bruke en peristaltiske pumpe, i stedet for den innebygde vanning i handpiece. Vanning systemet i handpiece kaste ut ACSF for kraftfullt og produserer mye turbulens, som vil betydelig svekke synlighet.
Disclosures
Det er ingen avsløringer.
Acknowledgments
Tamara Zeric for å få multiphoton bildet i dette papiret. Støttet av hjerne og atferd, Parkinsons og JPB stiftelser, R01 MH108186 og R01 DA07418. F31 fellesskap 1F31MH109293-01A1 til S C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
| Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
| Stereotax frame | Kopf | 963 | |
| Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
| Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
| C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
| Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
| Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Mice | JAX | 664 | |
| Prairie Ultima multiphoton microscope | Bruker | ||
| JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |
References
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice. Nat protoc. 12, 213-220 (2010).
- Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing. Laser Physics Letters. 9, (2012).
- Yang, X., et al. Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging. IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).
- Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).
- Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure. Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).
- Vercellotti, T., Podesta, A. Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).
- Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. Piezoelectric surgery in implant dentistry. Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).
- Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction. J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).
- Pavlikova, G., et al. Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model. Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).
