Дискриминации в семи подмножеств иммунных клеток, два флюрохром проточная цитометрия
Summary
Здесь мы представляем гранулярных протокол потока для определения CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки, клетки и моноцитов в периферической крови человека с помощью только двух флуорохромов вместо семи. С этим подходом пять дополнительных маркеров могут быть записаны на большинстве цитофлуориметрами потока.
Abstract
Характеристика иммунных клеток сильно полагается на многоцветный проточной цитометрии для выявления субпопуляции, на основе дифференциальных выражения поверхностных маркеров. Настройки классической многоцветные панели требует мощных инструментов, пользовательские обозначенные антитела и тщательного изучения дизайна для сведения к минимуму спектрального наложения. Мы разработали многопараметрических анализ для выявления основных человеческих популяций иммунных (CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в периферической крови, объединив семь lineage маркеров, используя только два флуорохромов. Наша стратегия основывается на том наблюдении, что lineage маркеров постоянно выражаются в уникальное сочетание каждой популяции клеток. Сочетая эту информацию с тщательного титрования антител позволяет следователям для записи пять дополнительных маркеров, расширение оптических предел большинства потока цитофлуориметрами. Голова к голове сравнения показали, что подавляющее большинство населения иммунных клеток в периферической крови можно охарактеризовать с сопоставимой точности между нашего метода и классические «один маркер флюрохром один подход», хотя последняя все еще более точные для выявления групп населения, таких как NKT клетки и клетки γδ T. Сочетая семь маркеры с помощью двух флуорохромов позволяет для анализа сложных иммунных клеток населения и клинических образцов на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10 и даже на 2-3 флюрохром области инструментов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ потока цитометрии. Этот подход также очень хорошо подходит для проверки несколько клеточных популяций в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.
Introduction
Проточной цитометрии — это метод, который был разработан для анализа нескольких параметров на одной частицы со скоростью несколько тысяч событий на втором1. Примеры образцов анализируемой проточной цитометрии включают, но не ограничиваются, клетки, бусы, бактерии, везикул и хромосом. Аэрогидродинамических системы направляет частиц на допрос точки, где каждая частица пересекает пути с одним или несколькими лазерами, и несколько параметров записаны для дальнейшего анализа. Вперед и боковых рассеивается, порожденных рассеяния чисто лазерного света, используются для выявления целевых групп населения и извлечения сведений о относительный размер и внутренней сложности/гранулярности частиц, соответственно. Все остальные параметры, которые составляют большую часть данных в анализе гранулярных потока, являются производными от флюрохром меченых зондами, которые узнают и связывают для конкретных целей на частицы интерес.
Проточной цитометрии является основным инструментом для иммунологических исследований для выявления и характеристики популяции клеток. Для того чтобы рассечь сложности иммунной системы, многоцветные панели постоянно совершенствуются расширить количество маркеров одновременно записан для глубоких Иммунофенотипирование клеток населения1. Это приводит к развитию более способными инструментов и флуорохромов, с недавних high-end потока цитофлуориметрами, превышающий 20 люминесцентных параметров. Это приводит в сложные исследования дизайн благодаря флюрохром спектрального наложения и более высокие расходы, связанные с пользовательских антитела маркировки и квалифицированных операторов. В ряде случаев сложность и затраты снижаются с помощью отдельных панелей маркеров для различных клеточных популяций. Этот подход, однако, является ошибка склонными, уменьшает информация в каждой панели и может быть трудно применять образцы с ограниченное количество клеток. Кроме того увеличивая количество маркеров не исключает глубокую Иммунофенотипирование на инструментах с меньшим числом люминесцентных параметров. Ранее мы разработали окрашивание протокол для выявления основных человеческих популяций иммунной (CD4+ и CD8+ T клетки, γδ T клетки, клетки B, НК-клетки и моноцитов) в мононуклеаров периферической крови (получения), объединив семь lineage маркеров с помощью только два флуорохромов вместо семи требуется, с помощью традиционных «один флюрохром один маркер» подход (www.hcdm.org)2,3. Наш первоначальный доклад изучены и проверены понятие объединения семи маркеров в двух флуорохромов для глубокой Иммунофенотипирование. В настоящем докладе мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции и выведение клеток периферической крови, сосредоточив внимание на практическом аспекте и устранение неисправностей шаги для достижения успешного пятнать.
Этот протокол основывается на том наблюдении, что lineage маркеров константное выражение на поверхности клетки и что каждой популяции клеток имеет исключительное сочетание lineage маркеров. В репликацию, CD3 выражение подразделяет иммунные клетки на две основные категории: CD3-положительных Т-лимфоцитов и клеток CD3-отрицательные. В рамках подгруппы позитивные CD3, CD4+, CD8+ и γδ T клетки могут быть разделены с помощью антител, ориентированные исключительно на CD4 и CD8 γδ рецептора. Подобным образом, в рамках подгруппы негативные CD3 B клетки, клетки и моноциты могли быть однозначно идентифицированы с помощью антител против CD19, CD56 и CD14, соответственно. В стандартный один маркер флюрохром один подход анти CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19, – CD56 и – TCR γδ антитела обнаруживаются с семи различных флуорохромов. Наш подход сочетает в себе анти CD3, – CD56 и – TCR γδ антител в одном флюрохром (с пометкой для удобства флюрохром A) и анти CD4,-CD8, – CD14 и – CD19 антител в различных флюрохром (флюрохром B). Это возможно сочетанием антитела титрования и дифференциального антигена выражения. Обе CD4+ и CD8+ T клетки являются позитивными на антитела анти CD3, в флюрохром A, но они могут быть разделены в флюрохром B максимальное выражение CD8 сигнала при размещении, с ad hoc титрования, CD4 сигнала между CD8 и CD3 двойное отрицание положительные CD4/CD8 клетки. Т-клетки γδ выражает высокий уровень CD3 чем CD4 и CD8, и поэтому они могут быть определены как CD3 высокой4. Этот сигнал далее повышено маркировки γδ Т-клеток в флюрохром A с анти TCR γδ антител, улучшая таким образом разделение между CD3 низкая Т-клетки и клетки высокой γδ T CD3. B клетки могут быть определены как CD3– в A флюрохром и CD19+ в флюрохром б. Чтобы отделить CD3 негативные НК-клетки из клетки B, антитела анти CD56 использовался в флюрохром А как анти CD3. Это возможно потому, что CD56 выразил на NK клеток на гораздо более низком уровне, чем CD3 T клетки5. Наконец моноциты могут быть определены через комбинацию вперед стороне разброс свойств и выражение CD14 в флюрохром б.
Идея объединения до четырех маркеров с помощью двух флуорохромов уже успешно предпринята до6,7,8и был использован в клинический протокол для выявления злокачественных лимфоцитарный населения9 . Предыдущий доклад также комбинированные семь маркеры (с различными специфика от маркеров чем мы использовали в наших протокол) с помощью двух флуорохромов, но этот подход опирался на комплекс маркировки каждого антитела с различным количеством флюрохром10. Это отличается наш метод, который использует коммерчески доступных антител и может быть адаптирована к инструмент конфигурации и могут воспользоваться преимуществами нового поколения флуорохромов полимера.
Общая цель этой методологии является расширение оптических пределы большинства потока цитофлуориметрами, позволяя для записи пяти дополнительных маркеров допросить комплекс клеточных популяций. Как следствие расширенный Иммунологический анализ может быть выполнена на цитофлуориметрами расхода флюрохром доступной 6-10, и 2-3 флюрохром области инструментов можно добиться замечательных результатов в областях с ограниченными ресурсами. Высококачественные инструменты также могут воспользоваться такой подход с использованием дополнительных флуорохромов выполнить более глубокий анализ цитометрия потоков и для создания модульной потока гранулярных панели ориентации несколько линий на же время11. Это потенциально может уменьшить количество панелей, используемых в модульных Иммунофенотипирование проточной цитометрии и снизить затраты, ошибки и время обработки. Этот подход также очень хорошо подходит в случае клинических образцов с ограниченным числом ячеек.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокола, представленные здесь было показано, быть достаточно гибкими и нечувствительным к изменениям в окрашивание буфер, температуры и подготовка клеток периферической крови из-за высокой выражение lineage маркеров на поверхности клеток. Наиболее важным этапом для получения высокого…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано национального института артрита и Musculoskeletal и кожных заболеваний, , премия номер P30-AR053503; Стейблер фонд, www.stablerfoundation.org; Национальный институт аллергии и инфекционных болезней, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Нина Ирландии программа для здоровья легких (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
