Summary
نقدم هنا، بروتوكول سيتوميتريك تدفق لتحديد خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات في الدم المحيطي البشري باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من سبعة. مع هذا النهج، يمكن تسجيل خمس علامات إضافية على معظم تدفق سيتوميتيرس.
Abstract
خصائص الخلايا المناعية يعتمد بشدة على قياس التدفق متعدد الألوان لتحديد الفئات السكانية الفرعية استناداً إلى التعبير التفاضلية من علامات السطحية. يتطلب برنامج الإعداد للوحة متعددة الألوان الكلاسيكية الراقية الصكوك والأجسام المضادة المسماة مخصصة، وتصميم الدراسة المتأنية للتقليل من التداخل الطيفي. قمنا بتطوير إجراء تحليل مولتيباراميتريك تحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في الدم عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط. استراتيجيتنا يستند إلى الملاحظة التي أعرب علامات النسب عن باستمرار في مزيج فريد من كل سكان الخلية. الجمع بين هذه المعلومات مع معايرة دقيقة للأجسام المضادة يسمح للمحققين بتسجيل خمس علامات إضافية، توسيع حدود معظم تدفق سيتوميتيرس الضوئية. وجها لوجه المقارنة أظهرت أن الغالبية العظمى من السكان الخلايا المناعية في الدم يمكن أن توصف بدقة قابلة للمقارنة بين أسلوب لدينا والكلاسيكية "نهج علامة فلوروتشرومي--واحدة واحدة"، على الرغم من أن هذا الأخير لا يزال أكثر دقة لتحديد السكان مثل NKT الخلايا والخلايا γδ تي. الجمع بين سبع علامات استخدام اثنين فلوروتشروميس يسمح لتحليل السكان الخلايا المناعية المعقدة والعينات السريرية على سيتوميتيرس تدفق fluorochrome معقولة 6-10، وحتى على الصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس الإضافية لتحقيق التدفق الخلوي تحليل أعمق. هذا النهج أيضا مناسبة لفحص العديد من السكان خلية في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا جيدا.
Introduction
التدفق الخلوي هو أسلوب الذي استحدث لتحليل معلمات متعددة في جزيئات مفردة بمعدل عدة آلاف من الأحداث في كل ثانية1. أمثلة للعينات التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي وتشمل، ولكن لا تقتصر على، خلايا، والخرز، والبكتيريا وحويصلات والكروموسومات. نظام فلويديك توجيه الجسيمات عند نقطة الاستجواب حيث يتقاطع كل الجسيمات طريقها مع ليزر واحد أو أكثر، وتسجل معلمات متعددة لمزيد من التحليل. تنتشر إلى الأمام والجانب، المتولدة عن تشتت ضوء الليزر نقية، تستخدم لتحديد السكان المستهدفين واسترداد المعلومات حول الحجم النسبي وتعقيد/تقسيمات داخلية من الجسيمات، على التوالي. يتم اشتقاق كافة المعلمات الأخرى، التي تستأثر بمعظم البيانات في تحليل تدفق سيتوميتريك، بتحقيقات المسمى فلوروتشرومي أن تعترف وربط أهداف محددة على الجسيمات ذات الاهتمام.
التدفق الخلوي أداة أساسية للدراسات المناعية تحديد وتوصيف السكان الخلية. تشريح تعقيد النظام المناعي، هي لوحات متعددة الألوان في تطور مستمر لتوسيع عدد العلامات المسجلة في نفس الوقت إيمونوفينوتيبينج العميق للخلية السكان1. يؤدي هذا إلى وضع صكوك أكثر قدرة وفلوروتشروميس، مع سيتوميتيرس تدفق الراقية الأخيرة تتجاوز 20 الفلورية المعلمات. هذه النتائج في تصميم الدراسة معقدة بسبب التداخل الطيفي فلوروتشرومي وارتفاع التكاليف المرتبطة بجسم مخصص مشغلي الوسم والمهرة. في العديد من الحالات، يتم تقليل التعقيد والتكاليف باستخدام لوحات منفصلة لعلامات للسكان خلية مختلفة. هذا النهج، هو عرضه للخطأ ومع ذلك، ويقلل من المعلومات الموجودة في كل لوحة، ويمكن أن يكون صعباً لتطبيقه على عينات مع عدد محدود من الخلايا. وعلاوة على ذلك، تزايد عدد علامات يحول دون إيمونوفينوتيبينج العميق على الصكوك مع معلمات الفلورسنت أقل. أننا سبق أن وضعت بروتوكولا المصبوغة لتحديد السكان المناعة البشرية الرئيسية (CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات) في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) عن طريق الجمع بين سبع علامات النسب باستخدام فلوروتشروميس اثنين فقط بدلاً من السبعة المطلوبة باستخدام نهج (www.hcdm.org) "علامة فلوروتشرومي--واحدة واحدة" التقليدية2،3. تقريرنا الأولى استكشاف والتحقق من صحة مفهوم الجمع بين علامات سبعة في اثنين فلوروتشروميس إيمونوفينوتيبينج العميق. في هذا التقرير، نقدم بروتوكول خطوة خطوة لعزل ووصمة عار خلايا الدم المحيطية، مع التركيز على الجانب العملي، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها خطوات لتحقيق تلطيخ ناجحة.
ويستند هذا البروتوكول على ملاحظة أن علامات النسب يكون تعبير ثابت على سطح الخلية، وأن كل السكان خلية مزيج حصري من علامات النسب. في ببمكس، والتعبير CD3 الخلايا المناعية تقسم إلى فئتين رئيسيتين هما: لمفاوية T CD3--الإيجابية والسلبية CD3 الخلايا. داخل الفريق الفرعي إيجابية CD3، خلايا CD4+، CD8+ ويمكن فصل الخلايا γδ تي استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4، CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة، ضمن الفريق الفرعي CD3 السلبية، ب الخلايا والخلايا ناغورني-كاراباخ ووحيدات يمكن تعريفه بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14، على التوالي. في نهج واحد فلوروتشرومي ماركر واحد قياسية، مكافحة-CD3،-CD4،--، CD8-CD14،-يتم الكشف عن الأجسام γδ CD19-CD56 وتكر مع سبعة فلوروتشروميس مختلفة. لدينا نهج يجمع بين مكافحة-CD3-CD56 وأجسام γδ-تكر في أحد فلوروتشرومي (المسمى للراحة فلوروتشرومي A) ومكافحة-CD4،--، CD8-CD14-والأجسام المضادة CD19 في فلوروتشرومي مختلفة (فلوروتشرومي ب). وهذا ممكن عن طريق الجمع بين أضداد معايرة والتعبير مستضد التفاضلية. كلا CD4+ و CD8+ تي الخلايا إيجابية للأجسام المضادة-CD3 في فلوروتشرومي أ، ولكن يمكن فصلهم في فلوروتشرومي ب تحقيق الحد الأقصى من التعبير عن إشارة CD8 بينما تضع، مع معايرة مخصصة، إشارة CD4 بين CD8 و الخلايا النفي المزدوج إيجابية-CD4/CD8 CD3. الخلايا التائية γδ تعرب عن مستوى أعلى من CD3 CD4 و CD8، وذلك يمكن التعرف عليهم ك عالية CD34. كذلك عزز هذه الإشارات بوصفها γδ خلايا تي في فلوروتشرومي أ مع أضداد γδ تكر المضادة، وبالتالي تحسين الفصل بين CD3 منخفضة تي الخلايا والخلايا عالية γδ تي CD3. يمكن تحديد الخلايا ب ك CD3– في فلوروتشرومي أ و CD19+ في فلوروتشرومي ب لفصل CD3 السلبية ناغورني كاراباخ الخلايا من الخلايا باء، كمكافحة-CD3 جسم CD56 المضادة في فلوروتشرومي أ. وهذا ممكن لأنه أعرب عن CD56 في ناغورني كاراباخ الخلايا على مستوى أقل بكثير من CD3 على خلايا تي5. وأخيراً، يمكن تحديد وحيدات عبر مزيج من خصائص مبعثر جانب الأمام والتعبير عن CD14 في فلوروتشرومي ب
فكرة الجمع بين أربع علامات باستخدام فلوروتشروميس اثنين سعت بنجاح قبل6،،من78، وقد استخدمت في بروتوكول سريرية لتحديد السكان اللمفاوية الخبيثة9 . تقرير سابق أيضا ضم سبع علامات (مع خصوصية مختلفة من العلامات مما كنا في أعمالنا البروتوكول) باستخدام اثنين من فلوروتشروميس، ولكن هذا النهج يعتمد على العلامات المعقدة لكل جسم مع كمية متفاوتة من فلوروتشرومي10. هذا هو على النقيض لدينا أسلوب الذي يستخدم الأجسام المضادة المتاحة تجارياً ويمكن تكييفها لتكوين أداة ويمكن الاستفادة من الجيل الجديد من فلوروتشروميس البوليمر.
والهدف العام لهذه المنهجية توسيع حدود بصري لمعظم تدفق سيتوميتيرس تسمح بتسجيل خمس علامات إضافية لاستجواب السكان خلية معقدة. نتيجة لذلك، يمكن إجراء تحليل المناعية متقدمة في المتناول 6-10 fluorochrome تدفق سيتوميتيرس، والصكوك الحقل فلوروتشرومي 2-3 يمكن أن تحقق نتائج ملحوظة في المناطق ذات الموارد المحدودة. الأدوات الراقية يمكن أن تستفيد أيضا من هذا النهج باستخدام فلوروتشروميس إضافية لإنجاز التدفق الخلوي تحليل أعمق وإنشاء وحدات تدفق الألواح سيتوميتريك استهداف الأنساب عدة في الوقت نفسه11. هذا يحتمل أن تقلل عدد اللوحات المستخدمة في وحدات إيمونوفينوتيبينج التدفق الخلوي، وخفض التكاليف، والأخطاء والتعامل مع الوقت. وهذا النهج أيضا جيد جداً مناسبة في حالة العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق "جونز هوبكنز مجلس المراجعة المؤسسية" تحت قانون المساءلة وقابلية التأمين الصحي جميع الدراسات للمواد البشرية. وكانت عينات المريض ومراقبة إزالة الألغام التي تم تحديدها. تم الحصول على ببمكس والدم من ضوابط صحية بالموافقة المستنيرة.
ملاحظة: هذا البروتوكول تم اختبارها على طازجة أو مجمدة معزولة خلايا الدم المحيطية والدم كله.
1-إعداد الخلية
-
عزل خلايا الدم طرفية (PBMC) من الدم كله
- سحب الدم في أنبوب أخضر-أعلى 10 مل تحتوي على الهيبارين الصوديوم. بعد أن كانت مليئة الأنبوب الدم، فورا عكس الأنبوبة عدة مرات لمنع تخثر الدم.
ملاحظة: يمكن استخدام أنابيب تحتوي على تخثر الدم الأخرى مثل حمض الإيثيلين (يدتا) أو سترات الصوديوم مع نتائج مماثلة. إذا كان يتم تجميع كمية مختلفة من الدم، ينبغي تحجيم الخطوات التالية في البروتوكول تبعاً لذلك. - نقل الدم مرسومة بعناية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. تمييع الدم بمبلغ مساو من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
- إضافة 15 مل من الكثافة المتوسطة التدرج (مثلاً، فيكول) إلى الجزء السفلي من أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الجديد وتراكب بعناية الدم المخفف على أعلى كثافة متوسطة متدرجة، تجنب أي خلط بين المتوسطة الكثافة المتدرجة والدم المخفف.
ملاحظة: هذا خطوة حاسمة لفصل سليم بين ببمكس من الخلايا الحمراء. - الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، مع لا الفرامل لتجنب تعطيل الواجهة.
- بعد الطرد المركزي، بعناية نضح الطبقة العليا باستخدام ماصة وتخلص منه، مع الاهتمام بعدم إزالة الخلايا عند نقطة الالتقاء بين المتوسط التدرج البلازما والكثافة، التي يتم فيها يقسم ببمكس. جمع العديد من الخلايا ممكن من الواجهة دون لمس بيليه الخلية الحمراء في أسفل الأنبوبة المخروطية 50 مل ونقل إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
- إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 25 مل وعكس عدة مرات لخلط. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقيقة في الرايت مع الفرامل في إزالة أي تلوث كثافة متوسطة متدرجة من تعليق خلية.
- نضح المادة طافية دون القلق خلية بيليه بعناية. إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 25 مل وعكس عدة مرات لخلط. الطرد المركزي في x 200 غ لمدة 10 دقيقة في الرايت مع الفرامل إلى إزالة الصفائح الدموية.
- نضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. ريسوسبيند ببمكس في 1 مل أزيد الصوديوم PBS/0.1%. أزيد الصوديوم يقلل وضع حد أقصى، ذرف، استيعاب الأجسام المضادة، وزيادة خلية الإنعاش، ولكن يمكن أن يعوق سميته بقاء الخلية. ولهذا السبب، ينبغي تجنب أزيد الصوديوم في جميع الخطوات إذا كان سيتم استزراع الخلايا للتجارب اللاحقة. عزل الخلايا وتلطيخ دون أزيد الصوديوم أعطت نتائج مماثلة لتلطيخ المؤداة حضور أزيد الصوديوم.
تنبيه: أزيد الصوديوم يمكن أن يسبب الموت التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. الاتصال قد يسبب حروق للجلد والعيون. - تمييع الخلايا لعد بنقل 30 ميليلتر من ببمكس في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. قم بإضافة 120 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و 150 ميليلتر تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء (01:10 إضعاف الخلية). ريسوسبيند بعناية.
- نقل 10 ميليلتر هيموسيتوميتير، عد الخلايا تبعاً لذلك لعد تستخدم الدائرة وتحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء. خلايا قابلة للحياة = عدد تريبان الأزرق الخلايا السلبية مجموع x 10 (معامل التخفيف المستخدمة في هذا البروتوكول) x 104.
ملاحظة: متوسط، 7-15 × 106 من ببمكس ينبغي أن تجمع من 10 مل دم. - ريسوسبيند الخلايا في 10 × 106 لكل مل أزيد الصوديوم PBS/0.1%
ملاحظة: ويمكن تجميد PBMC والمخزنة في النتروجين السائل لفترة ممتدة من الوقت. ومع ذلك، يمكن تغيير التعبير عن علامات مثل مستقبلات تشيموكيني بهذا الإجراء.
- سحب الدم في أنبوب أخضر-أعلى 10 مل تحتوي على الهيبارين الصوديوم. بعد أن كانت مليئة الأنبوب الدم، فورا عكس الأنبوبة عدة مرات لمنع تخثر الدم.
-
إعداد الخلايا من ببمك المجمدة
ملاحظة: إجراءات التجميد مختلفة يمكن أن تؤثر على الانتعاش وبقاء الخلية12. تم تجميد ببمكس لهذه التجارب وضعت خصيصا تجميد وسائل الإعلام أو مصل الدم البقري الجنين (FBS)/10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) مع نتائج مماثلة.
تنبيه: [دمس] يمكن أن تكون خطرة قليلاً في حالة استنشاق (الرئة مهيجة)، الجلد الاتصال (مهيجة، بيرميتور)، للاتصال بالعين (مهيجة)، للابتلاع.- إزالة PBMC المجمدة من النتروجين السائل ووضعه على الجليد. نقل كريوفيال من الجليد مباشرة إلى حمام الماء 37 درجة مئوية. الحفاظ كريوفيال على سطح الماء وهزه بلطف قارورة حتى تبقى بيليه جليد صغيرة. نقل كريوفيال مرة أخرى على الجليد.
- قم بإزالة أي ماء مع مسح رش إيثانول 70%. أضف 1 مل أزيد الصوديوم PBS/0.1% ببطء في 4 درجات مئوية وعناية بنقل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة أزيد الصوديوم PBS/0.1% الباردة ببطء في 4 درجات مئوية للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 15 مل.
- بعناية إزالة أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 10 ريسوسبيند طافية، الخلايا في 1 مل أزيد الصوديوم PBS/0.1%.
ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون حراكه الخلايا في ربمي 10% FBS مع نتائج مماثلة. - تمييع الخلية لعد بنقل 30 ميليلتر من ببمكس في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. قم بإضافة 120 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و 150 ميليلتر تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء (01:10 إضعاف الخلية). ريسوسبيند بعناية.
- نقل 10 ميليلتر هيموسيتوميتير، عد الخلايا تبعاً لذلك لعد تستخدم الدائرة وتحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء. خلايا قابلة للحياة = عدد تريبان الأزرق الخلايا السلبية مجموع x 10 (معامل التخفيف المستخدمة في هذا البروتوكول) x 104.
- ريسوسبيند الخلايا في 10 × 106 كل مل في أزيد الصوديوم PBS/0.1%.
-
إعداد الخلايا من الدم كله
- سحب الدم في أنبوب أخضر-أعلى 10 مل تحتوي على الهيبارين الصوديوم. بعد أن كانت مليئة الأنبوب الدم، فورا عكس الأنبوبة عدة مرات لمنع تخثر الدم.
ملاحظة: الأنابيب التي تحتوي على تخثر الدم الأخرى مثل يدتا أو سترات الصوديوم يمكن استخدامها مع نتائج مماثلة. إذا كان يتم تجميع كمية مختلفة من الدم، ينبغي تحجيم الخطوات التالية في البروتوكول تبعاً لذلك. - نقل 200 ميليلتر من الدم كله إلى أنبوب 12 مم × 75 مم توج، إضافة 2 ميليلتر من أزيد الصوديوم ودوامه بلطف ل 2 s.
- سحب الدم في أنبوب أخضر-أعلى 10 مل تحتوي على الهيبارين الصوديوم. بعد أن كانت مليئة الأنبوب الدم، فورا عكس الأنبوبة عدة مرات لمنع تخثر الدم.
2-خلية تلطيخ
ملاحظة: اختيار أزواج من فلوروتشروميس مع تداخل تقريبا لا الطيفية مهم للحد من انتشار البيانات بسبب انتشار عالية من فلوروتشرومي في الجهاز فلوروتشرومي الأخرى. تحقيق تحديد أمثل لشركة فرعية الخلية، ينبغي استخدام فلوروتشروميس مع عائد كم عالية مثل جسم أزواج PE BV421 و PE-آسيا والمحيط الهادئ.
-
تلوين من ببمك الطازجة والمجمدة
- نقل 100 ميليلتر من ببمك (1 × 106 خلايا) إلى لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا.
ملاحظة: يمكن استخدام أي عدد من الخلايا أقل من 1 × 106 مع نتائج مماثلة2. - الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة إلى كل ميليلتر 100 جيدا لبرنامج تلفزيوني يتضمن صبغة العيش الميت يمكن حلها أن يتجاوب مع أمين مجاناً على البروتينات لمدة 10 دقائق لتسمية الخلايا الميتة.
- التحضير لكل عينة 30 ميليلتر من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة (مكافحة-CD3--CD56، TCRγδ في فلورتشرومي أ، ومكافحة خلايا CD4، CD8، CD19، CD14 في فلورتشرومي ب). يتم الإشارة إلى تركيز الأجسام المضادة في جدول 1 و جدول 2. في هذه المرحلة، يمكن كذلك إضافة معاير الأجسام المضادة ضد الجزيئات المستهدفة المختلفة وفي فلوروتشروميس مختلفة (على سبيل المثال، الجدول 3).
ملاحظة: تركيز الأجسام المضادة يمكن أن تختلف تبعاً للشركة المصنعة ورقم الشحنة. ولذلك، ينبغي أن الاختبارات الأولية لتحقيق الإشارات الأمثل. واستخدمت برنامج تلفزيوني، PBS/0.5% جيش صرب البوسنة، PBS/0.2% أزيد الصوديوم أو أزيد الصوديوم PBS/0.5% BSA/0.1% مع نتائج مماثلة لتمييع الأجسام المضادة2. يمكن أيضا أن تكون الملون الخلية بأحجام مختلفة من 30 ميليلتر لدمج هذه المنهجية للقائمة بالفعل بسهولة تلطيخ البروتوكولات. - الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة كوكتيل الأجسام المضادة لكل بئر وريسوسبيند بعناية دون توليد الفقاعات. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
ملاحظة: فمن الممكن وصمة عار العينات من 4 درجة مئوية مع نتائج مماثلة. - إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت المصبوغة وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، والحصول على البيانات المتعلقة سيتوميتير تدفق. إذا تم تغيير حجم المصبوغة، الرجاء التأكد على الأقل تمييع برنامج ميكس جسم تستخدم لغسل الفائض من الأجسام المضادة.
ملاحظة: يمكن الثابتة مع بارافورمالدهيد PBS/2% الخلايا الملون، ويوضع في ثلاجة عند درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها وثم حصلت على سيتوميتير تدفق في اليوم التالي.
تنبيه: بارافورمالدهيد ضار إذا ابتلع ويمكن أن يسبب تهيج الجلد
- نقل 100 ميليلتر من ببمك (1 × 106 خلايا) إلى لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا.
-
بقع من الدم كله
- لكل أنبوبة 12 مم × 75 مم توج، إضافة مزيج من الأجسام المضادة (مكافحة-CD3.-CD56، TCRγδ في فلوروتشرومي أ، ومكافحة خلايا CD4، CD8، CD19، CD14 في فلوروتشرومي ب) واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. وترد في الجدول 4تركيز الأجسام المضادة. في هذه المرحلة، معاير الأجسام المضادة ضد الجزيئات المستهدفة المختلفة ويمكن إضافة كذلك في فلوروتشروميس مختلفة. تركيز الأجسام المضادة يمكن أن تختلف تبعاً للشركة المصنعة ورقم الشحنة. ولذلك، ينبغي أن الاختبارات الأولية لتحقيق الإشارات الأمثل.
ملاحظة: فمن الممكن وصمة عار عينات في 4 درجات مئوية مع نتائج مماثلة. - الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 3 دقائق على RT ونضح المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. جعل حلاً س 1 من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: ينبغي أن يكون الحل تحلل RT قبل الاستخدام. - إضافة 2.0 مل 1 × العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء لكل أنبوبة وكاب جيدا وعكس عدة مرات لخلط. وتغطي بإحباط والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة.
- تدور إلى أسفل في 300 x ز للحد الأدنى 5 بعناية نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
- إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: عند هذه النقطة، بيليه الخلية يجب أن يكون تلوين أبيض شاحب مما يدل تحلل خلايا الدم الحمراء ناجحة. نضح المادة طافية عدم الإزعاج بيليه الخلية بعناية ولطف ريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. - سلالة الخلايا عن طريق أنابيب 12 مم × 75 مم مع 40 ميكرومتر تصفية قبعات إزالة الركام الخلية والحصول على البيانات المتعلقة سيتوميتير تدفق.
- لكل أنبوبة 12 مم × 75 مم توج، إضافة مزيج من الأجسام المضادة (مكافحة-CD3.-CD56، TCRγδ في فلوروتشرومي أ، ومكافحة خلايا CD4، CD8، CD19، CD14 في فلوروتشرومي ب) واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. وترد في الجدول 4تركيز الأجسام المضادة. في هذه المرحلة، معاير الأجسام المضادة ضد الجزيئات المستهدفة المختلفة ويمكن إضافة كذلك في فلوروتشروميس مختلفة. تركيز الأجسام المضادة يمكن أن تختلف تبعاً للشركة المصنعة ورقم الشحنة. ولذلك، ينبغي أن الاختبارات الأولية لتحقيق الإشارات الأمثل.
3-أضداد معايرة
ملاحظة: معايرة الأجسام المضادة هو الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة، واستنساخه. معايرة لمكافحة--CD3-CD8،-γδ CD14-CD19 وتكر-يتبع الإجراء القياسي الذي يتم اشتقاق تركيز الأجسام المضادة لفصل قمم الإيجابية والسلبية على النحو الأمثل تلطيخ مؤشر13،14كحد أقصى. ينبغي أن يكون تخفيف في ذروة أو أقرب إلى الذروة من ناحية ارتفاع منحنى مؤشر وصمة عار مختارة (الشكل 1 ألف-جيم). الأجسام المضادة-CD4 هو معاير لمكان ذروة السكان إيجابية بين السكان إيجابية واحدة CD3 و CD3 CD4 + CD8 + "تي" الخلايا، أقرب إلى إشارة إيجابية واحدة CD3 أفضل تميز سكان CD8dim (CD8 + الخلايا γδ تي وخلايا تي ناغورني-كاراباخ). وعلى نفس المنوال، خلايا CD56 المعايرة يهدف إلى وضع ناغورني كاراباخ CD56+ بين CD3+ و CD3 السكان– .
-
الحد الأقصى من وصمة عار مؤشر منحنى
ملاحظة: المعايرة لمكافحة--CD3-CD8،-γδ CD14-CD19 وتكر-يتبع الإجراء القياسي الذي يتم اشتقاق تركيز الأجسام المضادة لفصل قمم الإيجابية والسلبية على النحو الأمثل تلطيخ مؤشر منحنى15كحد أقصى. إذا تم إضافة أجسام مضادة ضد علامات أخرى للفريق، يحتاجون أيضا إلى أن تكون معاير مع منحنى مؤشر المصبوغة كحد أقصى.- إعداد إضعاف إضعاف جسم بملء 10 آبار لصفيحة 96-جيدا مع 40 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت. في البئر الأولى وزيادة الحجم النهائي إلى 80 ميليلتر من المخزن المؤقت المصبوغة وإضافة الأجسام المضادة للاهتمام بتركيز 4 مرات تركيز اقترح من قبل الشركة المصنعة.
- مزيج جيد ونقل 40 ميليلتر في الثانية أيضا. يخلط جيدا وكرر هذه الخطوة لكل الأخرى الآبار.
- وصمة عار 10 عينات من ببمك أو الدم كله مع 30 ميليلتر لتخفيف إضعاف مختلفة 10 من الأجسام المضادة بعد البروتوكول وصف قبل.
- الحصول على البيانات مع سيتوميتير تدفق وارسم الإشارة من كل تمييع (الشكل 1A).
- بوابة على السكان السلبية والإيجابية لكل تركيز الأجسام المضادة. يمكن أن يؤدي إلى زيادة تركيز الأجسام المضادة على خلفية ارتفاع. ولذلك، تغيير حجم البوابة السلبية تبعاً لذلك.
- لكل تركيز الأجسام المضادة، استخراج معلومات حول المتوسط والانحراف المعياري لكثافة السكان السلبية الفلورسنت، والوسيط لكثافة السكان إيجابية فلورسنت. حساب لكل تركيز الأجسام المضادة في فهرس وصمة عار بهذه الصيغة: (متوسط كثافة السكان إيجابية الفلورسنت – متوسط كثافة السكان السلبية الفلورسنت) ÷ (الانحراف المعياري 2 x من شدة الفلورسنت سلبية السكان) (الشكل 1B).
- الأرض في مقابل مؤشر وصمة عار. تركيز الأجسام المضادة، كسر لتمييع جسم (مثلاً، 01:10 إضعاف = 0.1)، وتحديد تركيز الأجسام المضادة مع قيمة الفهرس وصمة عار كحد أقصى (الشكل 1).
-
معايرة الأجسام المضادة ومكافحة CD4-CD56
ملاحظة: معايرة الأجسام المضادة-CD4--و CD56 يعتمد على المعايرة السابقة على علامات أخرى في الفريق الثاني-فلوروتشرومي. لجسم CD4 مكافحة المعايرة يهدف إلى وضع مكافحة-CD4 الإشارة بين CD8 مزدوجة+/CD3+ CD3 والإشارات واحدة إيجابية السكان (الشكل 1).- تيتراتي CD4 المضادة والأجسام المضادة CD56 مع استراتيجية إضعاف إضعاف كما هو موضح من قبل، مشيراً إلى تركيزات إضافية بين دقة تحديد نطاق التركيز التي تسمح بفصل خلايا CD4+ تي الخلايا والخلايا ناغورني كاراباخ من خلية أخرى والسكان.
- تيتراتي الأجسام المضادة-CD4 بوضع إشارة CD4 المضادة بين CD8 مزدوجة+/CD3+ CD3 والإشارات واحدة إيجابية السكان (الشكل 1).
ملاحظة: رعاية خاصة وينبغي أن يتم بوضوح فصل خلايا CD4 خلايا+ ر من CD8+ قاتمة والسكان. - تيتراتي جسم CD56 مكافحة اتباع استراتيجية مماثلة للمعايرة الأضداد المضادة CD4، عن طريق وضع ناغورني كاراباخ الخلايا بين CD3--السلبية والسكان CD3--الإيجابية.
4-استراتيجية النابضة
-
تحديد الخلية اللمفاوية ومونوسيتيك من السكان وإزالة الخلايا الميتة ومعظم خلايا الدم الحمراء المتبقية من التحليل.
- حدد جميع السكان التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية ووحيدات استناداً إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر منطقة (مقابل منتدى التعاون الأمني-أ SSC-أ). إزالة المجاميع الخلية من التحليل عن طريق عرض المبعثر إلى الأمام مقابل ارتفاع المبعثر إلى الأمام (مقابل منتدى التعاون الأمني-ح ث منتدى التعاون الأمني) والجانب مبعثر الارتفاع مقابل الجانب مبعثر العرض (مقابل SSC-ح ث ال SSC).
- استخدم علامة تمييز يعيش الميت لاستبعاد الخلايا الميتة إيجابية مشرقة وخلايا الدم الحمراء المتبقية من التحليل. بوابة على الخلايا الليمفاوية ووحيدات استناداً إلى موجز منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب-أ مختلفة.
-
اثنين-فلوروتشرومي 7-علامة استراتيجية النابضة السكان اللمفاوية.
ملاحظة: داخل الفريق الفرعي إيجابية CD3، خلايا CD4+، CD8+ ويمكن فصل الخلايا γδ تي استخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4، CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة، ضمن الفريق الفرعي CD3 السلبية، ب الخلايا والخلايا ناغورني-كاراباخ ووحيدات يمكن تعريفه بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14، على التوالي.- حدد البوابة اللمفاويات وخلق مؤامرة دوت مع على كل محور واحد من اثنين فلوروتشروميس المستخدمة في هذا البروتوكول (الشكل 2).
- بوابة CD8+ تي الخلايا المحددة ك CD3+/CD8+ مضاعفة الخلايا إيجابية في أعلى الزاوية اليمنى دوت-الأرض (الشكل 2). استبعاد السكان CD8 الخافتة التي قد تحتوي على خلايا NKT. بوابة على CD4+ تي الخلايا المحددة كالسكان ما بين CD8+ تي في CD3 وخلايا مفردة السكان إيجابية. بوابة على الخلايا التائية γδ اعتبرت عالية CD3 الخلايا. تقسيم الخلايا التائية γδ CD8 إيجابية وسلبية CD8.
- بوابة في ناغورني كاراباخ الخلايا المحددة كالسكان ما بين CD3--الإيجابية والسلبية CD3 الخلايا. تقسيم الخلايا ناغورني كاراباخ في CD8 إيجابية وسلبية CD8. بوابة ب الخلايا المحددة ك CD19 CD3--السلبية+ السكان في الزاوية السفلية اليمنى من الأرض نقطة.
- حدد غيتس الوحيدات وخلق مؤامرة دوت مع على كل محور واحد من اثنين فلوروتشروميس المستخدمة في هذا البروتوكول (الشكل 2). بوابة على CD3/CD14–+ السكان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد وتحليل تجربة التدفق الخلوي لخلايا الدم المحيطية الإنسان ملطخة بسبع نسب علامات (مكافحة-CD3،-CD4،-، CD8-CD14،-أضداد γδ CD19-CD56 وتكر) استخدام اثنين فقط تعرض فلوروتشروميس.
يتم وصف النتائج الممثل لمكافحة--CD8-ومعايرة أضداد CD56. لكل جسم (في هذا المثال، مكافحة-CD8)، وسجلت البيانات من عشرة تخفيف إضعاف المتعاقبة لحساب منحنى مؤشر وصمة عار (الشكل 1 ألف-جيم). تركيز الضد الأمثل تحددها وصمة عار أقصى مؤشر إشارة13،14. وينبغي اختيار تخفيف في ذروة أو أقرب إلى الذروة من ناحية ارتفاع منحنى مؤشر وصمة عار. مكافحة CD4--والأجسام المضادة CD56 كانت معاير تلطيخ المحيطي خلايا الدم إلى جانب علامات أخرى في الفريق الثاني-فلوروتشرومي (معاير سابقا). وينبغي أن تهدف المعايرة للأجسام المضادة-CD4، وضع إشارة CD4 المضادة بين CD8 مزدوجة+/CD3+ إشارة و CD3 واحدة إيجابية السكان (الشكل 1). رعاية خاصة وينبغي أن يتم بوضوح فصل خلايا CD4 خلايا+ ر من CD8+ قاتمة والسكان. ببمكس كانت ملطخة بتركيز الأمثل من علامات المشار إليها وتركيزات مختلفة لمكافحة CD4. لون رمز تركيزات: يشير اللون الأخضر إلى التركيزات التي تؤدي انفصال أمثل لخلايا CD4 الخلايا+ تي من CD3 الأخرى+السكان؛ اللون البرتقالي يشير إلى التركيزات التي تؤدي فصل مقبولة ولكن ليست مثالية؛ الأحمر يشير إلى التركيزات التي يؤدي سوء فصل خلايا CD4 خلايا+ T من الخلايا CD8 خافت أو السكان النفي المزدوج CD4/CD8. تم معايرة مكافحة CD56 بطريقة مماثلة كالأجسام المضادة-CD4، بوضع ناغورني كاراباخ الخلايا بين CD3 السكان CD3--إيجابية وسلبية–.
الممثل النابضة الاستراتيجية يوضح كيفية تحديد الخلايا اللمفاوية ومونوسيتيك من السكان وإزالة من تحليل الخلايا الميتة ومعظم خلايا الدم الحمراء (الشكل 2A) المتبقية. جميع التحليل اللاحق الذي استند إلى هذه الاستراتيجية النابضة. الممثل النابضة استراتيجية يتم استخدامه لتحديد خلايا CD4+ و CD8+ تي الخلايا والخلايا γδ T، الخلايا ب، ناغورني كاراباخ الخلايا ووحيدات في تلطيخ العلامة fluorochrome سبعة اثنين (الشكل 2-ج).
الممثل النتائج السلبية هي المستمدة من عينة سوء إعداد ومعايرة مكافحة CD4--والأجسام المضادة CD56. الفشل في السليم تيتراتي نتائج CD4 في سوء فصل خلايا CD4 خلايا+ ر من CD8+ تي الخلايا (الشكل 3A)، بينما معايرة CD56 فقيرة يمكن أن تؤدي إلى فصل فقراء من ناغورني كاراباخ من خلايا ب والخلايا سلبية لجميع العلامات في (لوحة المصبوغة الشكل 3). يمكن أن يحدث سوء ربك تحلل مع بقع الدم كله. إذا كان الهدف الأساسي من البروتوكول لحساب النسبة المئوية للسكان خلية مختلفة (مثلاً, في المائة من خلايا CD4+ تي الخلايا)، التلوث مع ربك النفي المزدوج الخلايا، التي ستظهر في هذه المؤامرة دوت كالسكان النفي المزدوج، ينبغي أن تستبعد من التحليل (الشكل 3). استناداً إلى تجربتنا مع هذا البروتوكول، وقد لاحظنا أن الفصل الدقيق بين CD8 ناغورني-كاراباخ وخلايا ب+ الخلايا يمكن التحقق منها باستخدام علامات أخرى. على سبيل مثال، خلايا ناغورني كاراباخ هي النفي المزدوج للدكتور هلا و CCR6، بينما تكون الخلايا ب إيجابية مزدوجة (3D الشكل).
البروتوكول قدم في هذه المخطوطة من المفترض أن يكون جزءا من فريق متعدد الألوان المصبوغة باستجواب عدة السكان محصنة في عينات مع عدد محدود من الخلايا. باستخدام هذا النهج، نحن التحقيق في ديناميات السكان محصنة في عينات طولية من الجهات المانحة مع الورم النخاعي المتعدد تلقي عملية زرع خلايا الجذعية (NCT00566098 الرقم16). وجمعت ببمك المجمدة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي في اليوم 0، 14، 28، 60، 180، 360 بعد زرع الأعضاء. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على استجواب السكان اللمفاويات عدة تركز على صورتهم السذاجة/الذاكرة (CD45RA، CCR7)، حالة استنفاد التنشيط والخلية (الدكتور هلا، CD57، CD45RA + ذاكرة المستجيب، CD16)، والنمط الظاهري تي المستجيب (CCR4، CCR6، CXCR3) في واحد تلطيخ لوحة17،،من1819،20،21،،من2223،24،25 , 26-وكان هذا مفيداً بشكل خاص نظراً لأن عدد الخلايا التي تم جمعها لبعض المرضى والنقاط الزمنية تكاد لا تكفي للوحة المصبوغة واحدة فقط. الممثل النابضة استراتيجية (الشكل 4)، وديناميات السكان الخلية المحددة (الشكل 5) النكس المريض مع مرور الوقت. في المايلوما ب خلايا يمكن التعبير عن علامة ناغورني كاراباخ CD56. لاستبعاد هذا الاحتمال، استخدمنا الدكتور هلا و CCR6 إلى زيادة التمييز بين الخلايا ب من ناغورني كاراباخ الخلايا (الشكل 4 باء). CD8+ وتم تحديد الخلايا التائية الذاكرة والسذاجة بالتعبير عن CD45RA و CCR7: السذاجة (CD45RA+/CCR7+)، الذاكرة المركزية (سم، CD45RA/CCR7–+)، ذاكرة المستجيب (م، CD45RA/CCR7–- ) وذاكرة المستجيب CD45RA+ (أمرا، CD45RA+/CCR7+) (الشكل 4). تعبير الدكتور هلا و CD57 في CD8+ ساذج، خلايا الذاكرة الإجمالية T (التي تتكون من سم، م وأمرا)، سم، م وأمرا (الشكل 4). CD4+ وتم تحديد الخلايا التائية الذاكرة والسذاجة بالتعبير عن CD45RA و CCR7: السذاجة (CD45RA+/CCR7+)، الذاكرة المركزية (سم، CD45RA/CCR7–+)، ذاكرة المستجيب (م، CD45RA/CCR7–- ) وذاكرة المستجيب CD45RA+ (أمرا، CD45RA+/CCR7+) (4E الشكل). تعبير الدكتور هلا و CD57 في خلايا CD4+ السكان من السذاجة والذاكرة (التي تتكون من سم، م وأمرا)، سم، م وأمرا (4F الشكل). CCR4 و CCR6 كانت تستخدم كعلامات لتحديد ضمن السكان الذاكرة Th9 CD4+ تي الخلايا (الشكل 4). Th1، Th1/17 و Th2 و Th17 CD4+ ر مساعد الفئات السكانية الفرعية حددت من خلال التعبير عن CCR4 و CCR6 و CXCR3 (الشكل 4 ح). التعبير CD16 و CD57 في ناغورني كاراباخ الخلايا (الشكل 4I). زرع الخلايا الجذعية أدى CD4 المطرد+ و CD8+ تنشيط خلية T كما هو موضح بزيادة التعبير عن الدكتور هلا و CD57، وفي انحراف من مساعد تي للنمط الظاهري Th1. في اليوم 60 زيادة النسبة المئوية للخلايا ب شكل كبير التنبؤ بانتكاس المريض (الشكل 5).
رقم 1: معايرة جسم الممثل- النقطة (أ) الأرض يظهر التعبير CD8 على PBMC الطازج الملون مع تركيز الجسم المشار إليه. الجدول (ب) يمثل المتوسط والانحراف المعياري لشدة الفلورسنت CD8+، متوسط كثافة الفلورسنت CD8 السكان– ، ومؤشر المشتقة وصمة عار لتركيز كل اختبار. (ج) الرسم البياني يظهر كيف متفرعة إلى تركيز الأمثل الجسم كدالة لمؤشر وصمة عار. (د) معايرة الممثل من جسم CD4. لقد تم تعديل لوحة د من 2017 بوان et al.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل النابضة استراتيجية ونتائج التمييز يتدنى. (أ) التمثيل التخطيطي ليبنوا الإقصاء والتمييز الخلايا الحية وعلى أساس الحجم النابضة للخلايا الليمفاوية ووحيدات. (ب) اللمفاويات الفئات السكانية الفرعية المحددة مع النهج fluorochrome اثنين. وحددت وحيدات (ج) مع النهج fluorochrome اثنين. لقد تم تعديل هذا الرقم من عام 2017 بوان et al.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الحصول على نتائج ممثلة من الفصل عينة غير لائق ومعايرة الأجسام المضادة خاطئة. (أ) معايرة غير صحيحة CD4 جسم النتائج بدقة ضعيفة بين خلايا CD4+ و CD8+ السكان. (ب) ضعف CD56 المعايرة يمكن أن يؤدي إلى فصل سيئة من ناغورني كاراباخ من الخلايا ب. (ج) تأثير تحلل ربك غير مكتملة على التمييز الجمهرات الفرعية. (د) مثال على استخدام علامات أخرى للتحقق من فصل دقيق بين خلايا ب وخلايا ناغورني كاراباخ: الخلايا ب من الدكتور هلا وإيجابية مزدوجة CCR6، في حين الخلايا ناغورني كاراباخ النفي المزدوج. لقد تم تعديل لوحة د من 2017 بوان et al.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: النابضة استراتيجية لتحليل العينات المأخوذة من مريض مع المايلوما. كانت بوابات لمفاوية (أ) على أساس بهم منتدى التعاون الأمني، ويظهر مجال التعاون بين بلدان الجنوب وعلى تدفق سيتوميتريك الشخصية مع تلطيخ الخلايا المناعية فلوروتشرومي اثنين. (ب) فصل من ناغورني-كاراباخ وب الخلايا باستخدام CCR6 والدكتور هلا (ج) النابضة استراتيجية لتحديد CD8+ خلايا تي الذاكرة والسذاجة. (د) التعبير هلا-الدكتور و CD57 في CD8+ خلايا تي ساذجة والذاكرة. (ﻫ) النابضة استراتيجية لتحديد خلايا CD4+ خلايا تي الذاكرة والسذاجة. التعبير (F) هلا-الدكتور و CD57 في خلايا CD4+ خلايا تي ساذجة والذاكرة. (ز) تحديد CD4 Th9+ تي الخلايا (ح) تحديد الهوية من Thelper CD4+ خلية T الفئات السكانية الفرعية (أنا) CD16 و CD57 التعبير في ناغورني كاراباخ الخلايا. تم تكييف هذا الرقم من عام 2017 بوان et al.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: ديناميات السكان خلية في المريض مع المايلوما. (أ) دينامية السكان الرئيسية اللمفاويات في PBMC معزولة و cryopreserved في اليوم المشار إليه بعد زرع الخلايا الجذعية (اللجنة الدائمة). (ب) وصف للفئات السكانية الفرعية CD8 مع مرور الوقت. (ج) وصف للفئات السكانية الفرعية CD4 على مر الزمن. (د) تحليل لمجموعات فرعية ناغورني-كاراباخ. وقد تم رسم البيانات مع "المنشور جرافباد". تم تكييف هذا الرقم من عام 2017 بوان et al.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الهدف | استنساخ | فلوروتشرومي | المورد | تركيز | والغرض |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | دينار بحريني | 1/20 | النسب |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | دينار بحريني | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | السيرة الذاتية | 1/30 | |
| خلايا CD4 | الجيش الوطني الرواندي-T4 | PE | دينار بحريني | 1/450 | |
| CD8 | الجيش الوطني الرواندي-T8 | PE | دينار بحريني | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | دينار بحريني | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | دينار بحريني | 1/300 | |
| الخلايا الميتة | أزرق ل/د | الملازم | 1/300 | التمييز يعيش الميت | |
| دينار بحريني = BD العلوم البيولوجية، بيو = بيوليجيند، الملازم = تكنولوجيا الحياة | |||||
الجدول 1: جسم لوحة تستخدم لتلطيخ الخلايا المناعية فلوروتشرومي اثنين من ببمك (خليط BV421-PE)-
| الهدف | استنساخ | فلوروتشرومي | المورد | تركيز | والغرض |
| CD3 | UCHT1 | آسيا والمحيط الهادئ | دينار بحريني | 1/20 | النسب |
| CD56 | NCAM16.2 | آسيا والمحيط الهادئ | دينار بحريني | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | آسيا والمحيط الهادئ | السيرة الذاتية | 1/30 | |
| خلايا CD4 | الجيش الوطني الرواندي-T4 | PE | دينار بحريني | 1/450 | |
| CD8 | الجيش الوطني الرواندي-T8 | PE | دينار بحريني | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | دينار بحريني | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | دينار بحريني | 1/300 | |
| الخلايا الميتة | أزرق ل/د | الملازم | 1/300 | التمييز يعيش الميت | |
| دينار بحريني = BD العلوم البيولوجية، بيو = بيوليجيند، الملازم = تكنولوجيا الحياة | |||||
الجدول 2: جسم لوحة تستخدم لتلطيخ الخلايا المناعية فلوروتشرومي اثنين من ببمك (مجموعة آسيا والمحيط الهادئ-PE).
| الهدف | استنساخ | فلوروتشرومي | النشرة المصورة | المورد | تركيز | والغرض |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | دينار بحريني | 1/20 | النسب |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | دينار بحريني | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | السيرة الذاتية | 1/30 | |
| خلايا CD4 | الجيش الوطني الرواندي-T4 | PE | 555347 | دينار بحريني | 1/450 | |
| CD8 | الجيش الوطني الرواندي-T8 | PE | 555367 | دينار بحريني | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | دينار بحريني | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | دينار بحريني | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | السيرة الذاتية | 1/30 | التفريق |
| CD45RA | HI100 | آسيا والمحيط الهادئ-H7 | 560674 | دينار بحريني | 1/60 | |
| CCR4 | 1 1 | PE Cy7 | 561034 | دينار بحريني | 1/60 | ال مجموعات فرعية |
| CCR6 | G034--E3 | BV605 | 353419 | السيرة الذاتية | 1/30 | |
| CXCR3 | ج 1 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | دينار بحريني | 1/30 | |
| CD57 | ناغورني كاراباخ-1 | PE CF594 | 562488 | دينار بحريني | 1/900 | تنشيط/استنفاد |
| الدكتور هلا | G46-6 | BV510 | 563083 | دينار بحريني | 1/30 | |
| CD16 | 8 3 | BUV395 | 563784 | دينار بحريني | 1/30 | ناغورني كاراباخ، التنشيط الوحيدات |
| الخلايا الميتة | أزرق ل/د | L-23105 | الملازم | 1/300 | التمييز يعيش الميت | |
| دينار بحريني = BD العلوم البيولوجية، بيو = بيوليجيند، الملازم = تكنولوجيا الحياة | ||||||
الجدول 3: تجميد الفريق الضد المستخدمة لوصمة عار ببمك من مريض مع الورم النخاعي المتعدد.
| الهدف | استنساخ | فلوروتشرومي | المورد | تركيز | والغرض |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | دينار بحريني | 1/80 | النسب |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | دينار بحريني | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | السيرة الذاتية | 1/200 | |
| خلايا CD4 | الجيش الوطني الرواندي-T4 | PE | دينار بحريني | 1/1200 | |
| CD8 | الجيش الوطني الرواندي-T8 | PE | دينار بحريني | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | دينار بحريني | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | دينار بحريني | 1/300 | |
| الخلايا الميتة | أزرق ل/د | الملازم | 1/300 | التمييز يعيش الميت | |
| دينار بحريني = BD العلوم البيولوجية، بيو = بيوليجيند، الملازم = تكنولوجيا الحياة | |||||
الجدول 4: جسم لوحة تستخدم لتلطيخ الخلايا المناعية فلوروتشرومي اثنين من كل الدم (BV421-PE تركيبة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت البروتوكول المعروضة هنا مرنة جداً وحساس للتغيرات في تلطيخ المخزن المؤقت، ودرجة الحرارة وإعداد خلايا الدم المحيطية بسبب التعبير ارتفاع نسب علامات على سطح الخلية. أن الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة، واستنساخه من معايرة الأجسام المضادة. من المذكرة، حيث ينبغي دائماً إجراء المعايرة للأجسام المضادة أثناء برنامج الإعداد من لوحة سيتوميتريك التدفق، هذه الخطوة لا إضافة مقاعد البدلاء-الوقت الإضافي إلى نهجنا fluorochrome اثنين. معايرة لمكافحة--CD3-CD8،-γδ CD14-CD19 وتكر-يتبع الإجراء القياسي الذي يتم اشتقاق تركيز الأجسام المضادة لفصل قمم الإيجابية والسلبية على النحو الأمثل تلطيخ مؤشر13،14كحد أقصى. ينبغي أن يكون تخفيف في ذروة أو أقرب إلى الذروة من ناحية ارتفاع منحنى مؤشر وصمة عار مختارة (الشكل 1A-ج). من ناحية أخرى، يحتاج معايرة مخصصة للأجسام المضادة-CD4 ومكافحة CD56 التي يتعين القيام بها. الأجسام المضادة-CD4 هو معاير لمكان ذروة السكان CD4 إيجابية بين السكان إيجابية واحدة CD3 و CD3+/CD8+ تي الخلايا، أقرب إلى إشارة إيجابية واحدة CD3 تميز أفضل (السكانخافت CD8 CD8+ γδ تي الخلايا والخلايا T ناغورني-كاراباخ). وعلى نفس المنوال، خلايا CD56 المعايرة يهدف إلى وضع ناغورني كاراباخ CD56+ بين CD3+ والسكان CD3. يسهل التعبير أقل بطبيعة الحال من CD56 المعايرة لهذه الأجسام المضادة مع التركيز على استخدام قريبة من القيمة التي تم الحصول عليها في منحنى تشبع. استخدام الكم عالية الغلة فلوروتشروميس عامل حاسم آخر الفصل أمثل بين علامات/السكان متعددة على نفس الجهاز. حصلنا على نتائج ناجحة مع آسيا والمحيط الهادئ، و BV421، والمؤسسة العامة، ولكن فلوروتشروميس الأخرى، مثل الجيل الجديد من صبغ البوليمر، وينبغي أن تعطي نتائج قابلة للمقارنة. لتقليل إمكانية القطع الأثرية بسبب التعويضات، من المهم أيضا اختيار زوج من فلوروتشروميس مع القليل، إذا وجدت، التداخل الطيفي، مثل PE PE وآسيا والمحيط الهادئ، أو BV421. اختيار أزواج من فلوروتشروميس مع تقريبا أي تعويض مهم للحد من انتشار البيانات بسبب انتشار عالية من فلوروتشرومي في الجهاز فلوروتشرومي الأخرى. نشر الحد يسهل النابضة محصنة ضد الفئات السكانية الفرعية بالتقليل من تشويه الإشارات ويسمح باستخدام هذه المنهجية، وإذا كان يقتصر على فلوروتشروميس اثنين، دون حاجة إلى ضوابط التعويض.
مزيج العلامات التي اقترحنا من عالية للتخصيص على أساس الاحتياجات المحقق. وفي الواقع، بعض علامات يمكن استبعاد من التحليل إذا أنها لا تشير إلى عدد أن فائدة. على سبيل المثال، من الممكن لإزالة الأجسام المضادة-CD19 لاستبعاد الخلايا ب، أو جسم CD4 المناهضة للتركيز فقط على CD8+ تي الخلايا. من المذكرة، الأجسام المضادة-CD8 مهم لتحديد CD8+ ناغورني كاراباخ الخلايا والخلايا γδ T، وبالتالي لا يمكن إزالة من لوحة. تحسين الفصل بين السكان خلية نادرة، يمكن استخدام أخرى فلوروتشروميس/كاشفات لبعض علامات لتلطيخ fluorochrome اثنين. على سبيل مثال، يمكن نقل CD56 إلى جهاز للكشف عن مختلف للكشف عن خلايا NKT، التي ليس من الممكن مع الفريق الثاني-فلوروتشرومي. في حين أنه من الممكن الحد من عدد علامات من الفريق، ينبغي ممارسة الحذر في إضافة أو تغيير أو تبديل علامات.
قدمت مجموعة الآلات والأجسام المضادة والمهارات اللازمة، نهج قياسية واحدة fluorochrome علامة لا تزال الطريقة الأكثر دقة تحديد السكان المناعية متعددة وتميز الفئات السكانية الفرعية نادرة، مثل خلايا تي NKT أو γδ. ومع ذلك، هو الهدف الأساسي لهذا الأسلوب لا أن تكون بديلاً عن النهج الكلاسيكي، ولكن بدلاً من ذلك إلى تحقيق إيمونوفينوتيبينج عميق عند العمل مع الصكوك مع عدد قليل من أجهزة الكشف، أو عينات مع عدد محدود من الخلايا، مع الحد من التعقيد والتكلفة في إعداد النظام التجريبي. وقد فعلنا فحص واسعة النطاق من العينات السريرية من مرضى الورم النخاعي المتعدد والتصلب الجهازي، التهاب وتبين أن هذا الإجراء المصبوغة يمكن تحسين الاستجواب المتزامن للسكان عدة المحدودة مع مرض لايم عدد الخلايا. وقد أظهرت نتائج لدينا حتى الآن أن هذا الإجراء غير مبال بالتنشيط المناعي المزمن أو الأمراض المعدية، ولكن ينبغي إجراء اختبارات أولية تقييم مدى دقة هذا البروتوكول في الدول المختلفة من المرض.
التوجهات المستقبلية لتعزيز إمكانات هذا البروتوكول تشمل دراسات لتوصيف لمفاوية المتسللة في الأنسجة الأولية من العينات السريرية. هذا ذات الصلة للأورام وأمراض المناعة الذاتية المناعة فيها هذا النهج يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن للتحليل العينات بمواد محدودة. نحن التخطيط لاختبار هذا الفريق على الخلايا بيرميبيليزيد لتوسيع إمكانيات الكشف عن التعبير سيتوكين وإشارات الجزيئات في نفس العينات السريرية. وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن نهج مماثلة، تهدف إلى توسيع عدد علامات قابل للتسجيل، ويمكن أيضا وضع باستخدام مجموعات مختلفة من علامات، ويمكن أيضا نماذج حيوانية فورديفيرينت المتقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيده هذه الدراسة بالمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وموسكولوسكيليتال والأمراض الجلدية، < https://www.niams.nih.gov/>، جائزة رقم P30-AR053503؛ مؤسسة استقرارا، www.stablerfoundation.org; الوطني معهد الحساسية والأمراض المعدية، www.niaid.nih.gov، T32AI007247؛ نينا أيرلندا برنامج لصحة الرئة (نيبله)، https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
