Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4+ e CD8+ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.
Abstract
Caratterizzazione delle cellule immuni si basa fortemente su multicolor flusso cytometry per identificare sottopopolazioni basate su espressione differenziale dei marcatori di superficie. Installazione di un pannello multicolor classico richiede strumenti high-end, gli anticorpi con etichettati personalizzati e attento studio design per minimizzare la sovrapposizione spettrale. Abbiamo sviluppato un’analisi multiparametrica per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4+ e CD8+ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) nel sangue periferico mediante la combinazione di sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi. La nostra strategia si basa sull’osservazione che marcatori lignaggio costantemente sono espressi in una combinazione unica di ogni popolazione cellulare. Combinando queste informazioni con un’attenta titolazione degli anticorpi permette ai ricercatori di registrare cinque indicatori aggiuntivi, espandendo il limite ottico della maggior parte dei citometri a flusso. Confronto testa a testa ha dimostrato che la stragrande maggioranza delle popolazioni di cellule immuni nel sangue periferico può essere caratterizzata con precisione paragonabile tra il nostro metodo ed il classico “approccio di indicatore di un fluorocromo-uno”, anche se quest’ultimo è ancora più precisi per l’identificazione di popolazioni come T γδ cellule e cellule NKT. Combinazione di sette indicatori utilizzando due fluorocromi permette l’analisi delle popolazioni delle cellule immuni complesse e campioni clinici su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e anche su 2-3 strumenti di campo fluorocromo nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso. Questo approccio è anche molto adatto per lo screening di diverse popolazioni di cellule nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.
Introduction
Citometria a flusso è una tecnica che è stata sviluppata per analizzare più parametri su singole particelle ad una velocità di diverse migliaia di eventi al secondo1. Esempi di esemplari analizzati tramite flusso cytometry includono, ma non sono limitati a, cellule, perline, batteri, vescicole e cromosomi. Un sistema fluidico dirige le particelle nel punto di interrogatorio dove ogni particella si interseca il percorso con uno o più laser, e più parametri vengono registrati per ulteriori analisi. Disperde in avanti e laterali, generati dallo scattering della luce pura laser, vengono utilizzati per identificare la popolazione target e recuperare informazioni sulla dimensione relativa e la complessità interna/granularità delle particelle, rispettivamente. Tutti gli altri parametri, che rappresentano la maggior parte dei dati in un analisi cytometric di flusso, sono derivati dalle sonde fluorocromo-etichetta che riconoscono e si legano a specifici obiettivi sulle particelle di interesse.
Citometria a flusso è uno strumento primario per gli studi immunologici identificare e caratterizzare le popolazioni delle cellule. Per sezionare la complessità del sistema immunitario, pannelli multicolor sono in continua evoluzione per espandere il numero di marcatori contemporaneamente registrate per profonda immunophenotyping delle popolazioni delle cellule1. Questo sta portando allo sviluppo di strumenti più capaci e fluorocromi, con recente citometri a flusso High-end superiore a 20 parametri fluorescenti. Ciò si traduce nella progettazione di studio complesso a causa della sovrapposizione spettrale fluorocromo e costi più elevati connessi con operatori qualificati ed etichettatura su ordinazione dell’anticorpo. In diversi casi, complessità e i costi sono ridotti utilizzando pannelli separati di marcatori per diverse popolazioni cellulari. Questo approccio, tuttavia, è soggetto a errori, riduce le informazioni in ogni pannello e può essere difficile da applicare ai campioni con un numero limitato di cellule. Inoltre, aumentando il numero di marcatori preclude immunophenotyping profondo sugli strumenti con meno parametri fluorescenti. Precedentemente abbiamo sviluppato un protocollo di colorazione per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4+ e CD8+ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) in cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) combinando sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi anziché sette necessaria utilizzando il tradizionale “un fluorocromo-uno marcatore” approccio (www.hcdm.org)2,3. Il nostro rapporto iniziale esplorato e convalidato la nozione di combinare sette marcatori in due fluorocromi per immunophenotyping profonda. In questo rapporto, presentiamo un protocollo passo a passo per isolare e macchiare le cellule del sangue periferico, concentrandosi sull’aspetto pratico e risoluzione dei problemi per ottenere una colorazione di successo.
Questo protocollo è basato sull’osservazione che i marcatori lineage hanno un’espressione costante sulla superficie delle cellule e che ogni popolazione delle cellule ha un’esclusiva combinazione di marcatori di lignaggio. In PBMCs, espressione CD3 suddivide le cellule immuni in due categorie principali: i linfociti T CD3 positivi e cellule CD3-negative. All’interno del sottogruppo positivo CD3, CD4+, CD8+ e cellule T γδ possono essere separate usando gli anticorpi destinati esclusivamente a CD4, CD8 e il recettore γδ. In modo paragonabile, all’interno del sottogruppo negativo CD3, cellule B, cellule NK e dei monociti possono essere identificati in modo univoco utilizzando anticorpi contro CD19, CD56 e CD14, rispettivamente. In un approccio di marcatore fluorocromo-uno uno standard, anti-CD3-CD4,-CD8, – CD14,-CD19-CD56 e TCR – γδ gli anticorpi vengono rilevati con sette diversi fluorocromi. Il nostro approccio combina anti-CD3 – CD56 e TCR – γδ anticorpi in un fluorocromo (etichettato per fluorocromo convenienza A) e anti-CD4,-CD8, – CD14 e – CD19 anticorpi in un fluorocromo diverso (fluorocromo B). Questo è possibile tramite una combinazione di titolazione degli anticorpi e l’espressione dell’antigene differenziale. Entrambi CD4+ e CD8+ T cellule sono positive per l’anticorpo anti-CD3 in fluorocromo A, ma possono essere separati in fluorocromo B massimizzando l’espressione del CD8 segnale durante l’inserimento, con una titolazione ad hoc, il segnale di CD4 tra il CD8 e le cellule di CD3 positivi-CD4/CD8 doppia negazione. Cellule T γδ esprime il livello di CD3 superiore CD4 e CD8, e pertanto possono essere identificati come CD3 alta4. Questo segnale è ulteriormente potenziato dall’etichettatura γδ cellule T in fluorocromo A con un anticorpi di anti-TCR γδ, migliorando così la separazione tra CD3 basso T cellule e cellule di alta γδ T CD3. Le cellule B possono essere identificate come CD3– di fluorocromo A e CD19+ in fluorocromo B. Per separare le cellule di NK CD3 negative dalle cellule di B, un anticorpo anti-CD56 fu adibito a fluorocromo A anti-CD3. Questo è possibile perché CD56 espressi sulla cellula NK ad un livello molto inferiore rispetto CD3 su cellule T5. Infine, i monociti possono essere individuati tramite una combinazione di proprietà di forward-side scatter ed espressione di CD14 in fluorocromo B.
L’idea di combinare fino a quattro marcatori utilizzando due fluorocromi è stato tentato già con successo prima delle6,7,8ed è stato utilizzato in un protocollo clinico per identificare popolazioni linfocitarie maligni9 . Un rapporto precedente anche combinato sette indicatori (con differente specificità dal marcatori che abbiamo usato nel nostro protocollo) utilizzando due fluorocromi, ma questo approccio invocata una complessa l’etichettatura di ciascun anticorpo con quantità variabile di fluorocromo10. Questo è in contrasto con il nostro metodo che utilizza anticorpi disponibili in commercio e può essere adattato per la configurazione dello strumento e possa avvantaggiarsi della nuova generazione dei fluorocromi polimero.
L’obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandere i limiti ottici della maggior parte dei citometri a flusso permettendo la registrazione di cinque ulteriori indicatori per interrogare le popolazioni delle cellule complesse. Di conseguenza, avanzata analisi immunologica può essere eseguita su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e 2-3 fluorocromo campo strumenti possono raggiungere notevoli risultati nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso e creare modularità del flusso cytometric pannelli diversi lignaggi al tempo stesso11di targeting. Questo può potenzialmente ridurre il numero di pannelli utilizzati in citometria a flusso modulare immunophenotyping e ridurre i costi, errori e tempo di trattamento. Questo approccio è anche molto adatto nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui ha dimostrato di essere abbastanza flessibile e insensibile ai cambiamenti di macchiatura buffer, la temperatura e la preparazione delle cellule del sangue periferico a causa l’alta espressione di marcatori di lignaggio sulla superficie delle cellule. La fase più critica per l’ottenimento di dati di alta qualità, riproducibili è la titolazione di anticorpi. Di nota, dato che la titolazione degli anticorpi deve sempre essere eseguita durante l’installazione di un pannello di cytometric di f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dall’Istituto nazionale dell’artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie della pelle, , premio numero P30-AR053503; La Fondazione Stabler, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy and Infectious Disease, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irlanda programma per la salute del polmone (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
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