2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름
Summary
여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.
Abstract
면역 세포 특성화는 무 겁 게 차동 식 표면 표식에 따라 모집단을 식별 하기 위해 여러 가지 빛깔 cytometry에 의존 합니다. 클래식 멀티 컬러 패널의 설치에는 최고급 악기, 사용자 지정 레이블이 지정 된 항 체, 및 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 주의 깊은 연구 디자인 필요 합니다. 우리 주요 면역 인구를 식별 하는 multiparametric 분석 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 두 형광을 사용 하 여 7 개의 혈통 마커를 결합 하 여 말 초 혈액에서. 우리의 전략은는 혈통 마커 독특한 조합에 각 세포 인구에 의해 표현 됩니다 끊임없이 관찰을 기반으로 합니다. 항 체의 주의 적정와 함께이 정보를 결합 하 여 대부분 교류 cytometers의 광학 제한 확대 5 추가 마커를 기록 하는 조사 수 있습니다. 머리 비교 시연 주변 혈액에서 면역 세포 인구의 대다수 우리의 방법과 고전적인 “한 형광 색소 1 마커 접근”, 사이 대 등 한 정확도로 나타낼 수 있다 비록 후자는 여전히 NKT 세포 등 γ T 세포 인구를 식별 하는 데 더 정확 하다 두 형광을 사용 하 여 7 개의 마커를 결합 하 여 복잡 한 면역 세포 인구와 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers, 그리고 한정 된 자원 가진 지역에서 2-3 형광 색소 필드 악기에도 임상 샘플의 분석에 대 한 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 달성 하기 위해 여분의 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 여러 세포 인구를 심사 적합 합니다.
Introduction
Cytometry 이벤트 두 번째1당 몇 천의 속도로 단일 입자에 여러 매개 변수를 분석 하에 개발 된 기술입니다. 표본 cytometry 분석의 예는 포함 되지만 셀, 구슬, 박테리아, 소포 및 염색체에 국한 되지 않습니다. 유체 시스템 어디 하나 이상의 레이저와 그것의 경로 교차 하는 각 입자 및 여러 매개 변수는 추가 분석을 위해 기록 됩니다 심문 지점에서 입자를 지시 합니다. 앞으로 및 측면 살포, 순수한 레이저 빛의 산란에 의해 생성 된 대상 인구를 식별 하 고 각각 상대적인 크기와 입자의 내부 복잡성/단위에 대 한 정보를 검색 하는 데 사용 됩니다. 모든 다른 매개 변수, 흐름 cytometric 분석에서 데이터의 대부분을 담당 하는 형광 색소 표시 된 조사는 인식 하 고 바인딩할 특정 대상의 입자에 의해 파생 됩니다.
Cytometry 면역학 연구 특성화 세포 인구를 식별 하는 기본 도구입니다. 면역 시스템의 복잡성을 해 부하 다 색 패널은 세포 인구1의 깊은 immunophenotyping 동시에 기록 하는 마커의 수를 확장할 끊임없이 진화 된다. 이것은 20 형광 매개 변수를 초과 하는 최근 하이 엔드 흐름 cytometers 형광, 및 더 많은 능력의 개발을 선도 합니다. 이 결과 형광 색소 스펙트럼 중복으로 인해 복잡 한 연구 디자인 및 사용자 지정 항 체 라벨 및 숙련 된 연산자와 관련 된 높은 비용. 여러 인스턴스, 복잡성 및 비용 다른 세포 인구에 대 한 마커의 별도 패널을 사용 하 여 감소 된다. 그러나이 방법은, 오류가 발생 하기 쉬우며, 각 패널에 정보를 감소 이며 세포의 제한 된 수의 샘플에 적용 하기 어려울 수 있습니다. 또한, 적은 형광 매개 변수를 가진 계기에 깊은 immunophenotyping을 걸로 하겠습니다 마커 수 증가. 우리는 이전 주요 면역 인구를 식별 하는 얼룩 프로토콜을 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 7 혈통 마커를 사용 하 여 결합 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 7 대신만 두 형광 전통적인 “한 형광 색소 1 마커” 접근 (www.hcdm.org)2,3를 사용 하 여 필요 합니다. 우리의 초기 보고서 탐색 하 고 깊은 immunophenotyping에 대 한 두 가지 형광에 7 개의 마커를 결합의 개념을 확인. 이 보고서에서 우리는 단계에 의해 단계 프로토콜을 분리 하 고 주변 혈액 세포, 얼룩를 제시 하는 실용적인 측면에 초점을 맞추고 및 성공적인 얼룩을 달성 하는 단계를 문제 해결.
이 프로토콜은 그 혈통 마커 상수 식 세포 표면에 있고 각 셀 인구는 혈통 마커의 독점 조합 관찰을 기반으로 합니다. PBMCs에서 CD3 식 다시 나눈다 면역 세포 두 가지 주요 범주로: CD3 양성 T 림프 톨 및 CD3-부정적인 세포. CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여. 표준 한 형광 색소 1 마커 접근, 안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-7 다른 형광 CD19-CD56, TCR-γ 항 체는 검출. 우리의 접근 방식, 결합 한 안티-CD3-CD56, 그리고 한 형광 색소 (형광 색소 편의 A에 대 한 분류) 및 안티-CD4-TCR γ 항 체-CD8,-CD14와-CD19 항 체에 다른 형광 색소 (형광 색소 B). 이 항 체 적정 및 차동 항 식의 조합에 의해 가능 하다. 두 CD4+ 와 CD8+ T 세포에 형광 색소, 안티-CD3 항 체에 대 한 긍정적인 하지만 형광 B는 CD8 사이 CD4 신호를 ad hoc 적정으로 배치 하면서 CD8 신호 표현의 극대화 색소에서 분리 될 수 있다 고 CD3 이중 부정 긍정적인-CD4/CD8 세포. Γ T 세포 표현 보다는 c d 4와 CD8, CD3의 높은 수준 그리고 그러므로 그들은 CD3 높은4로 식별할 수 있습니다. 이 신호는 라벨 γ 형광 색소 A CD3 낮은 T 세포와 CD3 높은 γ T 세포 구분 개선 한 안티 TCR γ 항 체와 T 세포에 의해 더 밀어 주었다. B 세포는 c d 3로 확인 될 수 있다– 형광 색소 A와 CD19+ 형광 색소 나에 CD3 부정적인 NK 세포 B 세포에서 분리, 안티 CD56 항 체는 형광 색소 A에에서 안티-CD3으로 사용 되었다. CD56 CD3 T 세포5보다 훨씬 낮은 수준에서 NK 세포에 표현 했기 때문에 이것이 가능 합니다. 마지막으로, monocytes는 앞으로 사이드 분산형 속성 및 형광 색소 B. CD14의 식의 조합을 통해 확인할 수 있습니다.
2 형광을 사용 하 여 최대 4 개의 마커를 결합의 아이디어6,7,8, 전에 이미 성공적으로 시도 하 고 악성 림프 인구9 식별 하는 임상 프로토콜에 사용 되었습니다. . 이전 보고서는 또한 7 개의 마커를 결합 (다른 특이성 표식에서와 우리가 우리의 프로토콜에서 사용 하는 보다) 다양 한 양의 형광 색소10각 항 체의 복잡 한 라벨에 의존 2 개의 형광, 하지만이 방법을 사용 하 여. 이 대조적으로 우리의 메서드는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하 여 악기 구성에 적용할 수 있습니다 하 고 고분자 형광의 새로운 세대를 활용할 수 있습니다.
이 방법론의 전반적인 목표 대부분 교류 cytometers 복잡 한 세포 인구가 5 추가 마커의 녹음에 대 한 수의 광학 한계를 확장 하는 것입니다. 결과적으로, 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers에 고급 면역학 분석을 수행할 수 있습니다 그리고 2-3 형광 색소 필드 악기 한정 된 자원 가진 지역에서 놀라운 결과 얻을 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 수행 하 고 동일한 시간11에서 여러 계보를 대상으로 하는 cytometric 패널 모듈형 흐름을 만들려면 추가 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 잠재적으로 모듈형 immunophenotyping cytometry에 사용 되는 패널의 수를 감소 하 고 비용, 오류 및 처리 시간을 줄일 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 적합 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 매우 유연 하 고 변화 버퍼, 온도 및 셀 표면에 혈통 마커의 높은 표현으로 인해 주변 혈액 세포 준비 얼룩에 구분 표시 되었습니다. 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계는 항 체 적정. 주의 때문에 항 체의 적정 흐름 cytometric 패널의 설치 하는 동안 항상 수행 해야이 단계 추가 하지 않습니다 여분 벤치 타임 우리의 2-형광 색소 접근. 안티-CD3의 적정…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal와 피부 질환에 의해 지원 되었다 , 보너스 번호 P30-AR053503; 스 테 블러 재단, www.stablerfoundation.org; 국립 연구소의 알레르기와 전염병, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; 니 나 아일랜드 프로그램 폐 건강 (NIPLH)에 대 한 https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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