Summary
在这里, 我们提出了一个流式细胞仪协议, 以识别 cd4+和 cd8 + t 细胞, γ t细胞, b 细胞, nk 细胞和单核细胞在人外周血中只使用两个荧光色素, 而不是七个。通过这种方法, 可以在大多数流式细胞仪上记录五个附加标记。
Abstract
免疫细胞特征在很大程度上依赖于多色流式细胞术, 以基于表面标记的微分表达来识别亚群。经典多色面板的设置需要高端仪器、定制标记抗体和仔细的研究设计, 以最大限度地减少光谱重叠。我们开发了一种多参数分析, 通过使用两个荧光标记组合 7个沿线标记, 确定外周血中的主要人体免疫群 (cd4 + 和 cd8 + t 细胞、γ t细胞、b 细胞、nk 细胞和单核细胞)。我们的策略是基于这样的观察, 即血统标记不断以每个细胞群的独特组合来表达。将这些信息与对抗体的仔细滴定相结合, 可以让研究人员记录另外五个标记, 从而扩大大多数流式细胞仪的光学极限。头部与头部的比较表明, 外周血中绝大多数免疫细胞群的特征与我们的方法和经典的 "一种荧光-铬-一标记方法" 相当, 尽管后者仍然是这样。更精确的识别群体, 如 nkt 细胞和γ t 细胞。使用两个荧光素组合七个标记, 可以在负担得起的6-10 氟铬流细胞仪上分析复杂的免疫细胞群和临床样本, 甚至可以在资源有限的地区使用 2-3-2-2---氟铬现场仪器。高端仪器也可以受益于这种方法, 通过使用额外的荧光色素完成更深入的流式细胞仪分析。这种方法也非常适合在细胞数量有限的临床样本中筛选几个细胞群。
Introduction
流式细胞术是一种以每秒几千个事件1的速率分析单个粒子上的多个参数的技术.流式细胞仪分析的标本包括但不限于细胞、珠子、细菌、囊泡和染色体。流体系统在审讯点引导粒子, 在那里, 每个粒子与一个或多个激光相交其路径, 并记录多个参数进行进一步分析。利用纯激光散射产生的正向散射和侧散射分别用于识别目标群体并检索有关粒子相对大小和内部复合度的信息。所有其他参数, 这些参数占流式细胞仪分析中的大部分数据, 都是由荧光色标记的探针得出的, 这些探头识别并绑定到感兴趣粒子上的特定目标。
流式细胞术是免疫学研究的主要工具, 用于识别和表征细胞群。为了剖析免疫系统的复杂性, 多色面板不断进化, 以扩大同时记录的标记数量, 用于细胞群的深度免疫表型 1.这导致了更有能力的仪器和荧光素的开发, 最近的高端流式细胞仪超过20个荧光参数。这导致了复杂的研究设计, 由于氟铬光谱重叠, 并在更高的成本与定制抗体标签和熟练的操作人员。在某些情况下, 通过对不同的细胞群使用单独的标记面板, 可以降低复杂性和成本。但是, 这种方法容易出错, 会减少每个面板中的信息, 并且可能很难应用于单元格数量有限的示例。此外, 由于标记数量的增加, 在荧光参数较少的仪器上进行了深度免疫表型。我们之前开发了一个染色协议, 以确定主要的人类免疫群体 (cd4+和 cd8+ t 细胞, γ t 细胞, b 细胞, nk 细胞和单核细胞) 结合使用的七个谱系标记只有两个含氟铬, 而不是使用传统的 "一-一标记" 方法 (www.hcdm.org)2,3所需的七个。我们的初步报告探讨并验证了将七个标记组合在两个荧光素中用于深免疫表型的概念。在本报告中, 我们提出了一个逐步分离和染色外周血细胞的协议, 重点介绍了实际方面和故障排除步骤, 以实现成功的染色。
该协议基于这样的观察, 即谱系标记在细胞表面有一个恒定的表达式, 并且每个细胞群都有一个排他的谱系标记组合。在 pbmc 中, cd3 表达将免疫细胞细分为两大类: cd3 阳性 t 淋巴细胞和 cd3 阴性细胞。在 cd3 阳性亚群中, cd4+、cd8+和γ t 细胞可以使用仅针对 cd4、cd8 和γ受体的抗体分离。以类似的方式, 在 cd3 阴性亚群中, b 细胞、nk 细胞和单核细胞可以分别使用抗 cd19、cd56 和 cd14 的抗体进行唯一的鉴定。在标准的一荧光色标记方法中, 用七种不同的荧光色检测到抗 cd3、-cd4、-cd8、-cd14、-cd19、-cd56 和-tcr γ抗体。我们的方法将抗 cd3、-cd56 和-tcr γ抗体结合在一个荧光素 (标记为方便氟铬 a) 和抗 cd4、cd8、-cd14 和-cd19 抗体中的不同氟铬 (氟铬 b) 中。这是可能的抗体滴定和差异抗原表达的组合。cd4+和 cd8+ t 细胞对氟铬 a 中的抗 cd3 抗体呈阳性, 但它们可以在荧光 b 中分离, 最大限度地提高 cd8 信号的表达, 同时在 cd8 和 cd8 之间放置 cd4 信号。正 cd3 正 cd--cd8 双负细胞。与 cd4 和 cd8 相比, γ t 细胞的 cd3 表达水平更高, 因此可以识别为 cd3 高4。通过在荧光 a 中标记带有抗 tcr γ抗体的 h2 t 细胞, 进一步增强了这一信号, 从而改善了 cd3 低 t 细胞与 cd3 高γ t 细胞之间的分离。b 细胞可以被识别为 cd3-在荧光铬 a 和 cd19+在荧光铬 b。为了将 cd3 阴性 nk 细胞与 b 细胞分离, 在氟铬 a 中使用了抗 cd56 抗体作为抗 cd3 抗体。这是可能的, 因为 cd56 在 nk 细胞上的表达水平远远低于 t 细胞5上的 cd3。最后, 单核细胞可以通过向前散射特性和 cd14 在氟铬 b 中的表达的组合来识别。
在6、7、8之前, 已经成功地尝试了使用两种荧光素组合四个标记的想法, 并在临床协议中使用了这一想法, 以确定恶性淋巴细胞群 9.以前的一份报告还使用了两个荧光色素 (与我们的协议中使用的标记不同的特异性), 但这种方法依赖于对每个抗体进行复杂的标记, 其中的荧光铬量不同。这与我们使用市售抗体的方法形成鲜明对比, 该方法可根据仪器配置进行调整, 并可利用新一代聚合物荧光色。
这种方法的总体目标是扩大大多数流式细胞仪的光学极限, 允许记录五个额外的标记, 以询问复杂的细胞群。因此, 先进的免疫分析可以在经济实惠的6-10 氟铬流式细胞仪上进行, 2-3 个氟铬现场仪器可以在资源有限的领域取得显著成果。高端仪器也可以受益于这种方法, 通过使用额外的荧光色, 以完成更深入的流式细胞仪分析, 并创建模块化流式细胞仪面板, 同时针对多个血统11。这可能会减少模块化免疫表型流式细胞术中使用的面板数量, 并减少成本、错误和处理时间。这种方法也非常适用于细胞数量有限的临床样本。
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Protocol
所有对人体材料的研究都得到了约翰·霍普金斯大学机构审查委员会根据《健康保险可移植性和问责制法》进行的批准。患者和对照样本被取消鉴定。pbmc 和血液是在知情同意的情况下获得的。
请注意:该方案已在新鲜或冷冻分离的外周血细胞和全血上进行了测试。
1. 细胞制备
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全血外周血细胞 (pbmc) 的分离
- 在含有肝素钠的10毫升绿色顶管中抽血。管充满血液后, 立即倒置管几次, 以防止凝固。
请注意:含有乙二胺四乙酸 (edta) 或柠檬酸钠等其他抗凝剂的管材可用于具有类似的效果。如果收集了不同数量的血液, 则应相应地缩放协议中的以下步骤。 - 小心地将抽血转移到50毫升的锥形管中。在没有钙和镁的情况下, 用等量的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 稀释血液。
- 在新的50毫升锥形管底部添加15毫升密度梯度介质 (例如, 菲卡尔), 并小心地将稀释后的血液覆盖在密度梯度介质之上, 避免密度梯度介质与稀释血液之间的任何混合。
请注意:这是将 pbmc 与红细胞适当分离的关键步骤。 - 在室温 (rt) 下, 以 400 x g 离心 30分钟, 无需刹车, 以避免接口中断。
- 离心后, 使用移液器仔细吸气并丢弃上层, 注意不要在等离子体和密度梯度介质之间的界面上取出细胞, 这就是 pbmc 分层的地方。从界面收集尽可能多的细胞, 而不接触50毫升锥形管底部的红细胞颗粒, 并转移到一个新的50毫升锥形管。
- 添加 pbs, 使最终的体积到25毫升, 并反转几次混合。在使用制动器的情况下, 以 300 x g的速度离心 10分钟, 以去除电池悬浮液中的任何密度梯度介质污染。
- 小心吸气上清液, 不干扰细胞颗粒。添加 pbs, 使最终的体积到25毫升, 并反转几次混合。在 rt 以 200 x g的速度离心 10分钟, 并打开刹车以去除血小板。
- 小心吸气上清液, 而不干扰细胞颗粒。在1毫升的 pbs%-0.1% 氮化钠中再利用 pbmc。氮化钠可减少抗体的封盖、脱落、内化, 并增加细胞恢复, 但其毒性会损害细胞活力。因此, 如果将细胞培养用于后续实验, 则应在所有步骤中避免使用氮化钠。没有氮化钠的细胞分离和染色结果与在氮化钠存在下进行的染色相似。
注意事项:氮化钠会影响中枢神经系统而导致死亡。接触可能会导致皮肤和眼睛灼伤。 - 通过在 1.5 ml 微离心管中传输30μl 的 pbmc 来稀释细胞进行计数。然后加入120μl 的 pbs 和150μl 的 trypan 蓝, 以确定细胞数量和活力 (1:10 细胞稀释)。小心地重新扫描。
- 将10μl 转移到血细胞计, 根据所使用的计数室对细胞进行相应的计数, 并确定活细胞的数量。可生物细胞 = trypan 蓝色负细胞总数 x 10 (本协议中使用的稀释系数) x 10 4.
请注意:平均而言, 从10毫升的血液中收集 7-15 x 10 6 的 pbmc。 - 以每毫升 10 x 10 6 的速度重新移植细胞-----------------------------------------------------------
请注意:pbmc 可以在液氮中长期冷冻和储存。然而, 标记物的表达, 如趋化因子受体可以通过此程序改变。
- 在含有肝素钠的10毫升绿色顶管中抽血。管充满血液后, 立即倒置管几次, 以防止凝固。
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冷冻 pbmc 细胞的制备
注:不同的冷冻程序会影响细胞的恢复和活力12。用于这些实验的 pbmc 被冷冻在特殊配方的冷冻培养基或胎儿牛血清中 (FBS)/10 二甲基亚硫醚 (dmso) 中, 结果相似。
注意事项:dmso 在吸入 (肺刺激物)、皮肤接触 (刺激性、渗透剂)、眼神接触 (刺激性)、摄入的情况下可能具有轻微的危险性。- 从液氮中取出冷冻 pbmc, 放在冰上。将冷冻瓶直接从冰中转移到37°c 的水浴中。将冷冻瓶放在水面上, 轻轻摇晃小瓶, 直到残留一个小冰球。把冷冻瓶放回冰上。
- 用70% 的乙醇喷擦去除所有水。在4°c 时慢慢加入1毫升的 pbs 0.1% 氮化钠, 并小心地将细胞转移到15毫升的锥形管中。在4°c 下慢慢加入冷 pss 0.1% 氮化钠, 最终体积达到15毫升。
- 以 300 x克离心 10分钟, 小心地去除上清液, 将细胞重新悬浮在1毫升的 pbsss% 0.1% 氮化钠中。
请注意:细胞也可以在 rpmi 10% fbs 中重新悬浮, 结果类似。 - 通过在 1.5 ml 微离心管中传输30μl 的 pbmc 来稀释电池进行计数。然后加入120μl 的 pbs 和150μl 的 trypan 蓝, 以确定细胞数量和活力 (1:10 细胞稀释)。小心地重新扫描。
- 将10μl 转移到血细胞计, 根据所使用的计数室对细胞进行相应的计数, 并确定活细胞的数量。可生物细胞 = trypan 蓝色负细胞总数 x 10 (本协议中使用的稀释系数) x 10 4.
- 将细胞以 10 x 10/6/毫升的速度在 pbss%-0.1% 氮化钠中重新使用。
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全血细胞的制备
- 在含有肝素钠的10毫升绿色顶管中抽血。管充满血液后, 立即倒置管几次, 以防止凝固。
请注意:含有 edta 或柠檬酸钠等其他抗凝剂的管材可用于具有类似的效果。如果收集了不同数量的血液, 则应相应地缩放协议中的以下步骤。 - 将200μl 的全血输送到12毫米 x75 mm 的封管中, 加入2μl 的氮化钠, 轻轻旋涡2次。
- 在含有肝素钠的10毫升绿色顶管中抽血。管充满血液后, 立即倒置管几次, 以防止凝固。
2. 细胞染色
请注意:选择几乎没有光谱重叠的含铬对对于减少由于荧光铬在其他荧光探测器中的高溢出量而导致的数据传播非常重要。为了实现细胞亚群的最佳识别, 应采用高量子产率的荧光色素, 如抗体对 pe-bv421 和 pe-apc。
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新鲜冷冻 pbmc 的染色
- 将 100μl pbmc (1 x10 6 细胞) 转移到96井 v 型底板上。
请注意:任何数量的细胞低于 1 x10 6 可以使用类似的结果2。 - 在 rt 以 350 x克的速度离心 3分钟, 并在不干扰细胞颗粒的情况下小心吸气上清液。在每口井中加入100μl 的 pbs, 其中含有一种活的/死的固定染料, 在蛋白质上与游离胺反应 10分钟, 给死细胞贴上标签。
- 为每个样品准备30μl 的混合物, 其中包含所有抗体 (抗 cd3.-cd56, tcrmn 在氟铬 a 中, 和抗 cd4, cd8, cd19, cd14 在氟铬 b)。抗体的浓度见表 1和表 2.在这一阶段, 还可以添加针对不同目标分子和不同荧光素的滴定抗体 (例如, 表 3)。
请注意:抗体浓度可能因制造商和批号的不同而不同。因此, 应进行初步测试, 以获得最佳信号。使用 pbs、pbs 0.5% bsa、pbss2 0.2% 氮化钠或 pbs 0.5% bsa%. 0.1% 氮化钠稀释抗体2。细胞也可以在不同于30μl 的体积中染色, 以便将这种方法轻松地与现有的染色协议集成。 - 在 rt 以 350 x克的速度离心 3分钟, 并在不干扰细胞颗粒的情况下小心吸气上清液。将抗体鸡尾酒添加到每口井中, 并小心地重新悬浮, 而不会产生气泡。在黑暗中在 rt 中孵化30分钟。
请注意:有可能在4°c 下对样品进行染色, 结果类似。 - 在 rt 以 350 x g 的速度添加 150μl 的染色缓冲液和离心机, 每次 3分钟, 并在不干扰细胞颗粒的情况下小心吸气上清液。在200μl 的 pbs 中重新移植细胞, 并获取流式细胞仪的数据。如果染色量发生变化, 请确保用于清洗多余抗体的原始抗体混合物至少稀释20倍。
请注意:染色细胞可以用 pbs2% 聚甲醛固定, 在4°c 的冰箱里保存一夜, 然后在第二天在流动细胞仪上获得。
注意事项:如果吞咽, 对苯甲醛是有害的, 会引起皮肤刺激
- 将 100μl pbmc (1 x10 6 细胞) 转移到96井 v 型底板上。
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全血染色
- 在每个12毫米 x 75 毫米封管中, 添加抗体的混合物 (抗 cd3.-cd56, 荧光 a 中的 tcrmn, 以及在荧光 b 中的抗 cd4、cd8、cd19、cd14), 并在黑暗中的 rt 孵育30分钟。抗体的浓度见表 4。在这一阶段, 可以添加针对不同目标分子和不同荧光的滴定抗体。抗体浓度可能因制造商和批号的不同而不同。因此, 应进行初步测试, 以获得最佳信号。
请注意:在4°c 下对样品进行染色, 结果类似。 - 在 rt 以 350 x克的速度离心 3分钟, 并在不干扰细胞颗粒的情况下小心吸气上清液。按照制造商的说明, 对红细胞裂解缓冲液进行1x 的解决方案。
请注意:在使用之前, 应在 rt 中使用裂解解决方案。 - 在每个管中加入2.0 毫升的1x 红细胞裂解缓冲液, 盖好, 并反转多次混合。盖上铝箔, 让坐15分钟。
- 在 300 x克的情况下旋转 5分钟, 小心地吸气上清液, 而不会干扰细胞颗粒。
- 在 300 x g 处添加2毫升的 pbs 和离心机, 5分钟。
注: 在这一点上, 细胞颗粒应该有一个苍白的颜色, 表明成功的红血球裂解。小心吸吸上清液, 以免干扰细胞颗粒, 并在200μl 的 pbs 中轻轻重新悬浮细胞。 - 通过 12 mm x 75 mm 管将细胞滤网滤盖滤网, 以去除细胞集料并获取流式细胞仪上的数据。
- 在每个12毫米 x 75 毫米封管中, 添加抗体的混合物 (抗 cd3.-cd56, 荧光 a 中的 tcrmn, 以及在荧光 b 中的抗 cd4、cd8、cd19、cd14), 并在黑暗中的 rt 孵育30分钟。抗体的浓度见表 4。在这一阶段, 可以添加针对不同目标分子和不同荧光的滴定抗体。抗体浓度可能因制造商和批号的不同而不同。因此, 应进行初步测试, 以获得最佳信号。
3. 抗体滴定
请注意:抗体滴定法是获取高质量、可重现性数据的最关键步骤。对 cd3、-cd8、-cd14、-cd19 和-tcr γ进行滴定, 遵循标准程序, 通过最大染色指数13,14, 得到抗体浓度以最佳分离正负峰。应选择染色指数曲线上升侧的峰值或接近峰值的稀释量 (图 1a-c)。对抗 cd4 抗体进行滴定, 将 cd4 阳性种群的峰值置于 cd3 单阳性群体和 CD3+/CD8+ t 细胞之间, 更接近 cd3 单阳性信号, 以更好地鉴别 cd8 暗点群体 (cd8+ γ t 细胞和 nk t 细胞)。同样, cd56 滴定法的目的是将 nk cd56 +细胞放置在 cd3+和 cd3种群之间。
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最大染色指数曲线
注:反 cd3、-cd8、-cd14、-cd19 和-tcr γ的滴定遵循标准程序, 根据该程序, 抗体浓度以最佳方式分离正负峰, 通过最大染色指数曲线 15获得抗体浓度以最佳分离正峰和负峰。如果将针对其他标记的抗体添加到面板中, 它们还需要用最大染色指数曲线进行滴定。- 用40μl 染色缓冲液填充96孔板的10口井, 制备2倍抗体稀释。在第一口井中, 将最终体积增加到80μl 的染色缓冲液, 并在浓度为制造商建议浓度的4倍时添加感兴趣的抗体。
- 搅拌均匀, 并将40μl 转移到第二口井。混合好, 并重复这一步的所有其他井。
- 按照前面描述的方法, 在10个不同的2倍抗体稀释中, 用30μl 染色 10个 pbmc 或全血样本。
- 使用流式细胞仪获取数据, 并绘制每次稀释的信号 (图 1a)。
- 每个抗体浓度的负和阳性种群上的门。抗体浓度的增加会导致更高的背景。因此, 请相应地调整负门的大小。
- 对于每个抗体浓度, 提取有关负种群荧光强度的中值和标准偏差的信息, 以及阳性群体荧光强度的中位信息。用这个公式计算每个抗体浓度的染色指数: (阳性种群的中位荧光强度-负种群的中位荧光强度) (2 x 荧光强度的标准偏差的(图 1 b)。
- 绘制染色指数与以抗体稀释分数表示的抗体浓度 (例如, 1:10 稀释 = 0.1), 并确定具有最大染色指数值 (图 1c) 的抗体浓度。
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抗 cd4 和-cd56 抗体滴定法
注:抗 cd4 和-cd56 抗体滴定依赖于以前的滴定, 在双荧光面板中的其他标记。对于抗 cd4 抗体, 滴定法的目的是将抗 cd4 信号置于双 cd8+/cd3+信号和 cd3 单阳性种群之间 (图 1d)。- 对抗 cd4 和 cd56 抗体进行滴定, 具有之前所述的2倍稀释策略, 在这两者之间添加额外的浓度, 以明确识别能够将 cd4+ t 细胞和 nk 细胞与另一个细胞分离的浓度范围人口。
- 通过将抗 cd4信号置于双 cd8+ /cd3 + 信号和 cd3 单阳性种群之间, 对抗 cd4 抗体进行滴定 (图 1d)。
请注意:应特别注意将 cd4+ t 细胞与 cd8+暗淡的种群清楚地分离开来。 - 在 cd3 阴性和 cd3 阳性人群之间放置 nk 细胞, 使抗 cd56 抗体遵循类似于抗 cd4 抗体滴定法的策略。
4. 博彩策略
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识别淋巴细胞和单核细胞群, 并从分析中去除死细胞和大部分残留的红血球。
- 根据正向和侧散射区域 (fsc-a vs ssc-a) 选择含有淋巴细胞和单核细胞的整个群体。通过正向散射高度与正向散射宽度 (fsc-h vs fsc-w) 和侧向散射高度与侧面散射宽度 (ssc-h vs ssc-w) 从分析中去除单元格聚集体。
- 使用活体/死的鉴别标记, 以排除明亮的阳性死亡细胞和残留的红血球的分析。门的淋巴细胞和单核细胞的基础上的不同 fsc-a 和 ssc-a 的配置文件。
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双氟铬7标记门控策略的淋巴细胞群。
注:在 cd3 阳性亚群中, cd4+、cd8+和γ t 细胞可以使用仅针对 cd4、cd8 和γ受体的抗体分离。以类似的方式, 在 cd3 阴性亚群中, b 细胞、nk 细胞和单核细胞可以分别使用抗 cd19、cd56 和 cd14 的抗体进行唯一的鉴定。- 选择淋巴细胞门, 并创建一个点图, 每个轴上使用本协议中使用的两个荧光铬之一 (图 2b)。
- cd8+ t 细胞上的门被确定为 dot-plot+/cd8+点图右上角的双阳性细胞 (图 2b)。排除可能含有 nkt 细胞的暗淡 cd8 种群。cd4+ t 细胞上的门被确定为 cd8+ t 细胞与 cd3 单阳性群体之间的群体。栅极上的栅极被确定为高 cd3 细胞。在 cd8 阳性和 cd8 阴性中细分γ t 细胞。
- nk 细胞上的门被确定为 cd3 阳性细胞和 cd3 阴性细胞之间的群体。cd8 阳性和 cd8 阴性中的 nk 细胞细分。b 细胞上的门被确定为 cd3 负 cd19+群在点图的右下角。
- 选择单核细胞门, 并创建一个点图, 每个轴上使用本协议中使用的两个荧光铬之一 (图 2c)。门上的 cd3-/cd14+ 人口。
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Representative Results
本文介绍了仅使用两种荧光色素的人外周血细胞流式细胞仪染色实验, 该实验采用了7个谱系标记 (抗 cd3、cd4、-cd8、-cd14、-cd19、-cd56 和-tcr γ抗体)。
介绍了抗 cd8 和-cd56 抗体滴定法的代表性结果。对于每个抗体 (在本例中, 抗 cd8), 记录了10次连续2倍稀释的数据, 以计算染色指数曲线 (图 1a-c)。最佳抗体浓度由最大染色指数信号 13,14确定。应选择染色指数曲线上升侧的峰值或接近峰值的稀释。通过染色外周血细胞和双氟铬面板 (以前滴定过) 中的其他标记物, 对抗 cd4 和-cd56 抗体进行滴定。对于抗 cd4 抗体, 滴定应旨在将抗 cd4信号置于双 cd8+ /cd3 + 信号和 cd3 单阳性种群之间 (图 1d)。应特别注意将 cd4+ t 细胞与 cd8+暗淡的种群清楚地分离开来。对 pbmc 进行最佳浓度的指示标记和不同浓度的抗 cd4 染色。浓度的颜色代码: 绿色表示 cd4+ t 细胞与其他 cd3+人群的最佳分离浓度;橙色表示浓度, 导致可接受的, 但不理想的分离;红色表示浓度导致 cd4+ t 细胞与暗淡的 cd8 细胞或 cd8 双阴性群体分离不良。抗 cd56 滴定法的方法与抗 cd4 抗体相似, 将 nk 细胞置于 cd3-阴性人群和 cd3 阳性人群之间。
代表性的门控策略展示了如何识别淋巴细胞和单核细胞群, 并从分析中去除死细胞和大部分残留的红血球 (图 2a)。随后的所有分析都是基于这一门控策略。在两个荧光色-七标记染色中, 采用代表性门控策略对 cd4+和 cd8+ t 细胞、γ t 细胞、b 细胞、nk 细胞和单核细胞进行识别 (图 2b-c)。
抗 cd4 和-cd56 抗体的样品制备和滴定不当产生了有代表性的负面结果。如果不进行适当的滴定 cd4, cd4 + t 细胞与 cd8+ t 细胞的分离不良 (图 3 a), 而 cd56 滴定不良可能导致 nk 与 b 细胞的分离不良, 而染色面板中所有标记的细胞的分离不良 (图 3b)。全血染色可发生不良的红细胞裂解。如果该协议的主要目标是计算不同细胞群的百分比 (例如, cd4+ t 细胞的百分比), 与 rbc 双重负细胞的污染, 这将出现在点图作为双负种群, 应排除在(图 3c)。根据我们使用该协议的经验, 我们注意到 b 细胞和 nk cd8+细胞之间的准确分离可以通过使用其他标记进行验证。例如, nk 单元对 hla-dr 和 ccr6 是双负的, 而 b 单元是双正(图 3d)。
本手稿中提出的协议是多色染色面板的一部分, 用于询问细胞数量有限的样本中的几个免疫群。通过使用这种方法, 我们调查了接受干细胞移植的多发性骨髓瘤捐献者纵向样本的免疫种群动态 (clinicaltrias. gov nct0056609816)。移植后第0、14、28、60、180、360天采用流式细胞术对冷冻 pbmc 进行采集和分析。通过使用这种方法, 我们能够询问几个淋巴细胞群, 重点是他们的天真记忆谱 (cd45ra, ccr7), 激活和细胞消耗状态 (hla-dr, cd57, cd45ra+ 效应记忆, cd16) 和 t 效应器表型 (ccr4, ccr6,cxcr3) 在一个单一的染色面板17,18,19,20,21, 22,23, 24,25,26. 考虑到一些病人收集的细胞数量和时间点几乎不足以进行一个染色面板, 这一点特别有用。代表性门控策略 (图 4) 和随着时间的推移复发患者所选择的细胞群的动态 (图 5)。在多发性骨髓瘤中, b 细胞可以表达 nk 标记 cd56。为了排除这种可能性, 我们使用 hla-dr 和 ccr6 进一步区分 b 细胞和 nk 细胞 (图 4b)。cd8+记忆和天真的 t 细胞被确定了通过 cd45ra 和 ccr7的表达: 天真 (cd45ra+/ccr7 +), 中央记忆 (cm, cd45ra-/ccr7+), 效应记忆 (em, cd45ra-/ccr7-) 和效应存储器 cd45ra+ (emra, cd45ra+/ccr7+) (图 4c)。hla-dr 和 cd57 在 cd8+幼稚的总记忆 t 细胞 (包括 cm、em 和 emra)、cm、em 和 emra 中的表达 (图 4d)。cd4+记忆和天真的 t 细胞被识别通过 cd45ra 和 ccr7 的表达: 天真 (cd45ra+/ccr7+), 中央记忆 (cm,cd45ra-/ccr7+), 效应记忆 (em, cd45ra-/ccr7-) 和效应器内存 cd45ra+ (emra, cd45ra+/ccr7+) (图 4e)。hla-dr 和 cd57 在 cd4+幼稚和内存群 (包括 cm、em 和 emra)、cm、em 和 emra (图 4f) 中的表达。ccr4 和 ccr6 被用作标记, 用于识别记忆群体中的 th9 cd4+ t 细胞 (图 4g)。用 ccr4、ccr6 和 cxcr3( 图 4h) 的表达来识别 th1、then17、th2 和 th17 cd4 + t 辅助子群。nk 细胞中的 cd16 和 cd57 表达 (图 4i)。干细胞移植导致持续的 cd4+和 cd8+ t 细胞激活, hla-dr 和 cd57 表达的增加, 以及 th1 苯型 t 辅助剂的倾斜所显示的。在第60天, 预测患者复发的 b 细胞的百分比显著增加 (图 5)。
图 1: 代表性抗体滴定法.(a) 点图显示 cd8 在新鲜 pbmc 上的表达, 并在指示浓度的抗体下染色。(b) 表表示 cd8+荧光强度的中值和标准偏差、中位荧光强度 cd8-群体以及每个测试浓度的得出的染色指数。(c) 该图显示了如何推导抗体的最佳浓度作为染色指数的函数。(d) cd4 抗体的代表性滴定法。d 小组已从 boin 等人 2017年2修改.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 代表性门控战略和次人口歧视的结果.(a) 双细胞排斥、活细胞歧视和基于大小的淋巴细胞和单核细胞门控的示意图。(b) 用两种荧光法鉴定淋巴细胞亚群。(c) 用两种荧光色素法鉴定的单核细胞。该数字已从 boin 等人 2017年2修改.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 从不正确的样品分离和错误的抗体滴定法获得的代表性结果.(a) cd4 抗体滴定不当会导致 cd4+和 cd8+人群之间的分辨率低下。(b) cd56 滴定不良会导致 nk 与 b 细胞的不良分离。(c) 红细胞不完全裂解对亚种群歧视的影响。(d) 使用其他标记以验证 b 细胞和 nk 细胞之间的准确分离的示例: b 细胞为 hla-dr 和 ccr6 双阳性, 而 nk 细胞为双阴性。d 小组已从 boin 等人 2017年2修改.请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 分析多发性骨髓瘤患者样本的 going 策略.(a) 淋巴细胞是根据其 fsc-a 和 sscc 面积进行门控的, 并通过双氟铬免疫细胞染色显示其流式细胞仪的分布。(b) 使用 ccr6 和 hla-dr. (c) 称重策略分离 nk 和 b 细胞, 以识别 cd8+记忆和幼稚 t 细胞。(d) hla-dr 和 cd57 在 cd8+幼稚和记忆 t 细胞中的表达。(e) 识别 cd4+记忆和幼稚 t 细胞的分型策略。hla-dr 和 cd57 在 cd4+幼稚和记忆 t 细胞中的表达.(g) nk 细胞中 th9cd4 + t 细胞 (h) 的检测. 这一数字已从 boin 等人 2017年2改编。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 多发性骨髓瘤患者细胞数量的动态.(a) 在干细胞移植 (sct) 后的指定日期分离和冷冻保存的 pbmc 主要淋巴细胞群的动态。(b) cd8 亚群的特征随时间的推移。(c) cd4 亚群的特征随时间的推移。(d) nk 子集的分析。数据已通过石墨垫棱镜绘制。这一数字已从 boin 等人 2017年2改编。请点击这里查看此图的较大版本.
| 目标 | 克隆 | 氟铬 | 供应商 | 浓度 | 目的 |
| cd3 | uct1 | bv421 | 屋宇 署 | -20 | 血统 |
| cd56 | ncam16。2 | bv421 | 屋宇 署 | 1.5 900 | |
| b1 | bv421 | 生物 | 半30 | ||
| cd4 | rpa-t4 | 体育 | 屋宇 署 | 半450 | |
| cd8 | rpa-t8 | 体育 | 屋宇 署 | -20 | |
| cd14 | m5e2 | 体育 | 屋宇 署 | -15 | |
| cd19 | hib19 | 体育 | 屋宇 署 | -300 | |
| 死细胞 | l/d blue | lt | -300 | live"死的歧视 | |
| bd = bd 生物科学, bio = 生物传奇, lt = 生命技术 | |||||
表 1:用于 pbmc (bv421-pe 组合) 的双氟铬免疫细胞染色的抗体面板.
| 目标 | 克隆 | 氟铬 | 供应商 | 浓度 | 目的 |
| cd3 | uct1 | Apc | 屋宇 署 | -20 | 血统 |
| cd56 | ncam16。2 | Apc | 屋宇 署 | 半60 | |
| b1 | Apc | 生物 | 半30 | ||
| cd4 | rpa-t4 | 体育 | 屋宇 署 | 半450 | |
| cd8 | rpa-t8 | 体育 | 屋宇 署 | -20 | |
| cd14 | m5e2 | 体育 | 屋宇 署 | -15 | |
| cd19 | hib19 | 体育 | 屋宇 署 | -300 | |
| 死细胞 | l/d blue | lt | -300 | live"死的歧视 | |
| bd = bd 生物科学, bio = 生物传奇, lt = 生命技术 | |||||
表 2: 用于 pbmc (apc-pe 组合) 的双氟铬免疫细胞染色的抗体面板。
| 目标 | 克隆 | 氟铬 | 目录 | 供应商 | 浓度 | 目的 |
| cd3 | uct1 | bv421 | 562426 | 屋宇 署 | -20 | 血统 |
| cd56 | ncam16。2 | bv421 | 562751 | 屋宇 署 | 1.5 900 | |
| b1 | bv421 | 331217 | 生物 | 半30 | ||
| cd4 | rpa-t4 | 体育 | 555347 | 屋宇 署 | 半450 | |
| cd8 | rpa-t8 | 体育 | 555367 | 屋宇 署 | -20 | |
| cd14 | m5e2 | 体育 | 555398 | 屋宇 署 | -15 | |
| cd19 | hib19 | 体育 | 555413 | 屋宇 署 | -300 | |
| ccr7 | g043h7 | af647 | 353217 | 生物 | 半30 | 分化 |
| cd45ra | hi100 | apc-h7 | 560674 | 屋宇 署 | 半60 | |
| ccr4 | 1g1 | pe-cy7 | 561034 | 屋宇 署 | 半60 | th 子集 |
| ccr6 | g034-e3 | bv605 | 353419 | 生物 | 半30 | |
| cxcr3 | 1c6/cxcr3 | af488 | 561730 | 屋宇 署 | 半30 | |
| cd57 | nk-1 | pe-cf594 | 562488 | 屋宇 署 | 1.5 900 | 激活/耗尽 |
| HLA-DR | g46-6 | bv510 | 563083 | 屋宇 署 | 半30 | |
| cd16 | 3g8 | buv395 | 563784 | 屋宇 署 | 半30 | nk, 单核细胞活化 |
| 死细胞 | l/d blue | l-23105 | lt | -300 | live"死的歧视 | |
| bd = bd 生物科学, bio = 生物传奇, lt = 生命技术 | ||||||
表 3: 用于对多发性骨髓瘤患者的冷冻 pbmc 进行染色的抗体面板。
| 目标 | 克隆 | 氟铬 | 供应商 | 浓度 | 目的 |
| cd3 | uct1 | bv421 | 屋宇 署 | 1。5 | 血统 |
| cd56 | ncam16。2 | bv421 | 屋宇 署 | 1.5 400 | |
| b1 | bv421 | 生物 | 半200 | ||
| cd4 | rpa-t4 | 体育 | 屋宇 署 | 半1200 | |
| cd8 | rpa-t8 | 体育 | 屋宇 署 | 1.5 100 | |
| cd14 | m5e2 | 体育 | 屋宇 署 | 1。5 | |
| cd19 | hib19 | 体育 | 屋宇 署 | -300 | |
| 死细胞 | l/d blue | lt | -300 | live"死的歧视 | |
| bd = bd 生物科学, bio = 生物传奇, lt = 生命技术 | |||||
表 4: 用于全血双氟铬免疫细胞染色的抗体面板 (bv421-pe 组合)。
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Discussion
这里介绍的协议已经被证明是相当灵活和不敏感的变化染色缓冲液, 温度和外周血细胞的准备, 由于在细胞表面的血统标记的高表达。获得高质量、可重现数据的最关键的步骤是抗体滴定法。值得注意的是, 由于抗体的滴定应始终在流式细胞仪面板的设置过程中进行, 因此此步骤不会为我们的双氟铬方法增加额外的基准时间。对 cd3、-cd8、-cd14、-cd19 和-tcr γ进行滴定, 遵循标准程序, 通过最大染色指数13,14, 得到抗体浓度以最佳分离正负峰。应选择在峰值处的稀释或在染色指数曲线上升侧接近峰值的位置稀释 (图 1a-c)。另一方面, 需要对抗 cd4 抗体和抗 cd56 抗体进行临时滴定。抗 cd4 抗体滴定 cd4 抗体, 使 cd3 单阳性人群和 cd3+/cd8+ t 细胞之间的 cd4 阳性种群峰值更接近 cd3 单阳性信号, 以更好地鉴别cd8暗淡人群 (cd8+ γ t 电池和 nk t 电池)。同样, cd56 滴定法的目的是将 nk cd56 +细胞放置在 cd3+和 cd3 种群之间。cd56 的自然较低表达使这种抗体的滴定更容易与浓度接近在饱和曲线中获得的值使用。使用高量子产率的荧光色素是在同一探测器上最佳分离多个标记种群的另一个关键因素。我们在 apc、bv421 和 pe 方面取得了成功的结果, 但其他荧光色, 如新一代聚合物染料, 应能得到类似的结果。为了减少因补偿而产生的伪影的可能性, 还必须选择一对几乎没有光谱重叠的荧光色素, 如 pe 和 apc, 或 pe 和 bv421。选择几乎没有补偿的含铬对对于减少由于低铬在其他荧光探测器中的高溢出量而导致的数据传播非常重要。传播减少通过最大限度地减少信号失真促进了免疫亚群的门控, 并允许使用此方法 (如果限制为两个荧光), 而无需补偿控制。
我们提出的标记组合是高度可定制的, 根据调查员的要求。事实上, 如果有些标记不指感兴趣的人口, 就可以将其排除在分析之外。例如, 可以去除排除 b 细胞的抗 cd19 抗体或仅侧重于 cd8 + t 细胞的抗 cd4 抗体.值得注意的是, 抗 cd8 抗体对于识别 cd8+ nk 细胞和γ t 细胞非常重要, 因此不应从面板中取出。为了改善稀有细胞群的分离, 其他荧光色检测器可用于双氟铬染色的一些标记。例如, cd56 可以移动到不同的检测器来检测 nkt 细胞, 这在双氟铬面板中是不可能的。虽然可以减少面板中标记的数量, 但在添加、更改或切换标记时应谨慎行事。
提供必要的仪器、抗体和技能集, 标准的单氟铬-一标记方法仍然是识别多个免疫群体和鉴别罕见亚群 (如 nkt 或γ t 细胞) 的最准确方法。然而, 这种方法的主要目标不是取代经典的方法, 而是在使用探测器数量较少的仪器或细胞数量有限的样品时实现深度免疫表型, 同时降低复杂性以及建立实验系统的成本。我们对多发性骨髓瘤、系统性硬化症、皮肌炎和莱姆病患者的临床样本进行了广泛的筛查, 显示这种染色程序可以改善对几个人群的同时审讯, 有限的细胞的数量。我们迄今的研究结果表明, 这一程序对慢性免疫激活或传染病不敏感, 但应该进行初步测试, 以评估该协议在不同疾病状态下的准确性。
进一步加强该方案潜力的未来方向包括研究从临床样本的主要组织中的浸润淋巴细胞的特性。这与肿瘤和自身免疫性疾病免疫学相关, 在这种方法中, 这种方法可以为有限材料标本的分析提供宝贵的信息。我们正计划在渗透细胞上测试这个面板, 以扩大检测相同临床样本上细胞因子表达和信号分子的潜力。最后, 应当指出, 类似的方法, 旨在扩大可记录标记的数量, 也可以使用不同的标记集, 也可以为不同的动物模型开发。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家关节炎和肌肉骨骼及皮肤病研究所的支持, < http://www.niams.nih.gov/>, 奖项编号 p30-ar053503;www.stablerfoundation.org 的斯台伯尔基金会;国家过敏和传染病研究所, www.niaid.nih.gov, t32ai007247;nina 爱尔兰肺健康方案 (niplh), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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