İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi
Summary
Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.
Abstract
Bağışıklık hücre karakterizasyonu ağır çok renkli Akış Sitometresi yüzey işaretlerinin fark ifadeye dayalı altgrupları tanımlamak için kullanır. Klasik bir çok renkli panel kurulumu high-end aletleri, özel etiketli antikorlar ve spektral örtüşme en aza indirmek için dikkatli bir çalışma tasarım gerektirir. Büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için multiparametric bir analiz geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) sadece iki fluorochromes kullanarak yedi sülale işaretleri birleştirerek periferik kan içinde. Bizim strateji lineage işaretleri sürekli her hücre nüfus tarafından benzersiz bir bileşimini ifade edilir gözlem temel alır. Bu antikorlar dikkatli bir titrasyon ile birleştirme müfettişler çoğu akışı cytometers optik sınırını genişletme beş ek işaretleri kaydetmek izin verir. Hala ikinci olmasına rağmen kafa kafaya karşılaştırma bağışıklık hücre popülasyonlarının periferik kan içinde büyük çoğunluğu bizim yöntem ve klasik “bir fluorochrome bir işareti yaklaşım”, arasında karşılaştırılabilir doğruluk ile karakterize edilebilir gösterdi nüfus NKT hücreleri ve γδ T hücreleri gibi tanımlamak için daha kesin. Karmaşık bağışıklık hücre popülasyonlarının ve klinik örnekler uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers ve hatta 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynakları ile çözümlenmesi için yedi işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme sağlar. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi birkaç hücre popülasyonlarının hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler durumunda eleme için uygundur.
Introduction
Akış Sitometresi birden çok parametre birkaç bin olaylar başına ikinci1oranında tek parçacıklar analiz etmek için geliştirilmiş bir tekniktir. Akış Sitometresi tarafından analiz örnekleri örnekleri içerir, ancak hücreleri, boncuk, bakteri, veziküller ve kromozomlar için sınırlı değildir. Sıvı sistemi sorgulama nerede her parçacık yolunda bir veya daha fazla lazerler ile kesişiyor ve birden çok parametre daha fazla çözümleme için kaydedilir noktada parçacıklar yönlendirir. Ön ve yan scatter, saf lazer ışık saçılma tarafından oluşturulan hedef popülasyon tanımlamak ve sırasıyla göreli boyutu ve iç karmaşıklık/parçalı yapı parçacıkları, hakkında bilgi almak için kullanılır. En-in veri akış sitometrik analizinde için hesap, tüm diğer parametreler, tanıyıp faiz parçacıkların spesifik hedeflere bağlamak fluorochrome etiketli probları tarafından türetilmiştir.
Akış Sitometresi belirlemek ve hücre popülasyonlarının karakterize immünolojik araştırmalar için temel bir araçtır. Çok renkli panelleri bağışıklık sisteminin karmaşıklığı incelemek için sürekli aynı anda hücre nüfus1derin immunophenotyping için kaydedilen işaretleri sayısını artırmak için gelişmektedir. Bu 20 floresan parametreleri aşan son yüksek kaliteli akışı cytometers ile fluorochromes ve daha yetenekli aygıtlar gelişimine lider. Bu fluorochrome spektral çakışma nedeniyle karmaşık çalışma tasarım ve özel antikor etiketleme ve vasıflı operatörler ile ilgili daha yüksek maliyetler ile sonuçlanır. Birkaç durumlarda, karmaşıklığı ve maliyeti için farklı hücre popülasyonlarının işaretleri ayrı paneller kullanılarak azaltılır. Bu yaklaşım, ancak, hata eğilimli olduğunu, her panel bilgileri azaltır ve sınırlı sayıda hücre örnekleri uygulamak zor olabilir. Ayrıca, işaretçileri sayısını artırarak daha az floresan parametreleri ile aletleri üzerinde derin immunophenotyping engellemektedir. Daha önce büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için bir boyama protokol geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) yedi sülale işaretçileri kullanarak birleştirerek periferik kan mononükleer hücrelere (PBMCs) Sadece iki fluorochromes yedi yerine geleneksel “bir fluorochrome bir işareti” yaklaşım (www.hcdm.org)2,3kullanarak gerekli. Bizim ilk rapor araştırdı ve derin immunophenotyping için iki fluorochromes içinde yedi işaretleri birleştirme fikri doğrulanmış. Bu raporda, pratik yönü üzerinde odaklanan ve sorun giderme adımları başarılı bir boyama elde etmek için yalıtmak ve periferik kan hücreleri, leke için bir adım adım iletişim kuralı mevcut.
Bu iletişim kuralı gözlem lineage işaretleri hücre yüzeyinde bir sabit ifade var ve her hücre nüfus lineage işaretleri özel bir kombinasyonu vardır üzerinde temel alır. PBMCs içinde CD3 ifade subdivides bağışıklık hücreleri iki kategoriye ayrılır: CD3 pozitif T lenfositler ve CD3-negatif hücreleri. CD3 pozitif alt grubu, CD4 içinde+, CD8+ ve γδ T hücreleri CD4 ve CD8 γδ reseptör yalnızca hedef antikorları kullanarak ayrılabilir. Benzer bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde B hücreler, NK hücreleri ve monosit benzersiz CD19, CD56 ve CD14, karşı antikor sırasıyla kullanarak tanımlanabilir. Standart bir fluorochrome bir işaretleyici yaklaşım, anti-CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19, – CD56 ve – TCR γδ antikorlar ile yedi farklı fluorochromes tespit edildi. Anti-CD3, – CD56 ve – TCR γδ antikorlar bir fluorochrome (kolaylık fluorochrome A için etiketli) ve anti-CD4, bizim yaklaşım birleştirir-CD8, – CD14 ve – farklı fluorochrome (fluorochrome B) CD19 antikor. Bu antikor titrasyonu ve diferansiyel antijen ifade birleşimi ile mümkündür. Her iki CD4+ ve CD8+ T hücre fluorochrome A anti-CD3 antikor pozitif olmakla birlikte, fluorochrome CD8 sinyal ifade yerleştirerek, bir geçici titrasyon ile CD4 sinyal CD8 arasında ise en üst düzeye çıkarma B ayrılmış ve CD3 pozitif-CD4/CD8 çift negatif hücreleri. γδ T hücreleri CD4 ve CD8 daha yüksek düzeyde CD3 ifade eder ve bu nedenle CD3 yüksek4tanımlanabilir. Bu sinyal daha da γδ T hücreleri fluorochrome A böylece CD3 düşük T hücreleri ile CD3 yüksek γδ T hücreleri arasındaki mesafeyi artırmak bir anti-TCR γδ antikorlar ile etiketleme tarafından artırdı. B hücreleri CD3 tanımlanan– fluorochrome A ve CD19+ fluorochrome d. içinde CD3 negatif NK hücreleri B hücreleri birbirinden ayırmak için bir anti-CD56 antikor fluorochrome A anti-CD3 kullanıldı. CD56 NK hücre CD3 T hücreleri5daha fazla alt düzeyde ifade edilen bu olanak sağlanır. Son olarak, monosit ileri tarafı dağılım özellikleri ve CD14 ifade fluorochrome B. içinde bir arada üzerinden tespit edilebilir
En çok dört işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme fikri6,7,8daha önce başarıyla denedi ve klinik protokolünde Malign lenfositik nüfus9 tanımlamak için kullanılan . Önceki bir rapor da yedi işaretleri kombine (veri işaretleyicilerini üzerinden farklı özgüllük ile daha bizim iletişim kuralında kullanılan) iki fluorochromes ama bu yaklaşım kullanarak dayanıyordu bir karmaşık her antikor fluorochrome10değişen miktarda, etiketleme üzerinde. Bu piyasada bulunan antikor kullanan bizim yöntemi aksine ve enstrüman yapılandırma için adapte edilebilir ve polimer fluorochromes yeni nesil yararlanabilirsiniz.
Bu metodoloji genel amacı karmaşık hücre popülasyonlarının sorguya çekmek için beş ek işaretleyiciler kayıt için izin çoğu akışı cytometers optik sınırlarını genişletmektir. Sonuç olarak, uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers üzerinde gelişmiş immünolojik analizi gerçekleştirilebilir ve 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynaklara sahip çarpıcı sonuçlar elde edebilirsiniz. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ve modüler akış sitometrik paneller aynı saat11birkaç soy hedefleme için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu potansiyel olarak modüler immunophenotyping Akış Sitometresi içinde kullanılan panellerin sayısını azaltmak ve maliyeti, hataları ve işlem süresi azaltır. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler söz konusu olduğunda uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan Protokolü oldukça esnek ve duyarsız arabellek, sıcaklık ve periferik kan hücresi hazırlık lineage işaretleri hücre yüzeyindeki yüksek ifadesi nedeniyle boyama değişiklikler göstermiştir. Yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik antikor titrasyonu adımdır. Antikor titrasyonu her zaman bir akış sitometrik panel kurulumu sırasında gerçekleştirilmesi gereken bu yana belirtmek gerekirse bizim iki fluorochrome yaklaşım için ekstra tezgah-zaman bu adımı ekleme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada artrit Ulusal Enstitüsü ve Musculoskeletal ve deri hastalıkları, tarafından desteklenmiştir , Ödülü numarası P30-AR053503; Stabler Vakfı, www.stablerfoundation.org; Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina İrlanda Program için akciğer Sağlığı (NIPLH) https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
