Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry
Summary
Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.
Abstract
Immunzelle Charakterisierung stützt sich stark auf multicolor Durchflusszytometrie, basierte auf differentielle Expression der Oberflächenmarker Subpopulationen zu identifizieren. Setup von einem klassischen multicolor Panel erfordert High-End-Instrumente, benutzerdefinierte beschriftete Antikörper und sorgfältiges Studiendesign spektrale Überlappung zu minimieren. Wir entwickelten eine multiparametric Analyse, um die großen menschliche Immunsystem Populationen zu identifizieren (CD4+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten) im peripheren Blut durch die Kombination von sieben Linie Marker mit nur zwei Fluorochromes. Unsere Strategie basiert auf der Beobachtung, dass Linie Markierungen ständig in einer einzigartigen Kombination von jeder Zellenbevölkerung ausgedrückt werden. Kombinieren diese Informationen mit einer sorgfältige Titration der Antikörper ermöglicht Ermittler, fünf weitere Symbole erweitert die optische Grenze von den meisten fließen Cytometers aufzuzeichnen. Direktvergleich gezeigt, dass die überwiegende Mehrheit der immun-Zell-Populationen im peripheren Blut mit vergleichbarer Genauigkeit zwischen unsere Methode und die klassische “ein Fluorochrom-One Marker Approach”, charakterisiert werden kann, obwohl letztere ist nach wie vor genauer gesagt zur Identifizierung von Bevölkerungsgruppen wie NKT und γδ T-Zellen. Kombination von sieben Marker mit zwei Fluorochromes ermöglicht die Analyse von komplexen immun-Zell-Populationen und klinischen Proben auf erschwingliche 6-10 Fluorochrom fließen Cytometers und sogar auf 2-3 Fluorochrom Feldgeräte in Gebieten mit begrenzten Ressourcen. High-End-Geräte können auch von diesem Ansatz profitieren, mit zusätzlichen Fluorochromes, um tiefer Flow-Zytometrie-Analyse zu erreichen. Dieser Ansatz eignet sich auch sehr gut für das screening von mehreren Zellpopulationen im Falle von klinischen Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen.
Introduction
Durchflusszytometrie ist eine Technik, die entwickelt wurde, um mehrere Parameter auf einzelne Teilchen mit einer Geschwindigkeit von mehreren tausend von Ereignissen pro Sekunde1zu analysieren. Beispiele von Flow Cytometry analysierten Proben enthalten, aber sind nicht beschränkt auf, Perlen, Bakterien, Vesikel, Zellen und Chromosomen. Fluidische System leitet Partikel zum Verhör Zeitpunkt jedes Partikels kreuzt ihren Weg mit einem oder mehreren Lasern, wobei mehrere Parameter sind für die weitere Analyse aufgezeichnet. Nach vorne und seitliche Streuungen, durch Streuung von der reinen Laserlicht erzeugt werden verwendet, um die Zielgruppe zu identifizieren und Abrufen von Informationen über die relative Größe und interne Komplexität/Granularität der Teilchen, bzw.. Alle anderen Parameter, die meisten Daten in einer durchflusszytometrischen Analyse Rechnung zu tragen, werden durch Fluorochrom-markierte Sonden abgeleitet, die erkennen und binden an spezifische Ziele auf die Partikel von Interesse.
Durchflusszytometrie ist ein wichtiges Werkzeug für immunologische Studien zu identifizieren und zu charakterisieren, Zell-Populationen. Um die Komplexität des Immunsystems zu sezieren, werden mehrfarbige Tafeln ständig weiterentwickelt, erweitern die Anzahl der Markierungen, die gleichzeitig für tiefe Immunphänotypisierung der Zelle Bevölkerungen1aufgezeichnet. Dies führt zu der Entwicklung leistungsfähiger Instrumente und Fluorochromes, mit den letzten High-End-fließen Cytometers von mehr als 20 fluoreszierenden Parameter. Dies führt zu komplexen Studiendesign aufgrund Fluorochrom spektrale Überlappung und höhere Kosten im Zusammenhang mit benutzerdefinierten Antikörper Kennzeichnung und qualifizierte Betreiber. In mehreren Fällen Komplexität und Kosten werden reduziert, mit separaten Feldern Marker für verschiedene Zellpopulationen. Dieser Ansatz jedoch fehleranfällig ist, reduziert die Information in jeder Gruppe und kann schwierig sein, auf Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen anwenden. Darüber hinaus schließt die Erhöhung der Anzahl der Marker Tiefe Immunphänotypisierung auf Instrumente mit weniger fluoreszierende Parametern. Wir zuvor entwickelt Färbung Protokoll um große Bevölkerungsgruppen immun zu identifizieren (CD4+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch die Kombination von sieben Linie Markierungen mit nur zwei Fluorochromes anstelle von den sieben erforderlich mit Hilfe der traditionellen “ein Fluorochrom-One Marker” Ansatz (www.hcdm.org)2,3. Unserem erste Bericht untersucht und bestätigt das Konzept der Kombination von sieben Markierungen in zwei Fluorochromes für tiefe Immunphänotypisierung. In diesem Bericht stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu isolieren und peripheren Blutzellen beflecken mit Schwerpunkt auf den praktischen Aspekt und Problembehandlung Schritte, um eine erfolgreiche Färbung zu erreichen.
Dieses Protokoll basiert auf der Beobachtung, dass Linie Marker einen konstanten Ausdruck auf der Zelloberfläche und dass jede Zellpopulation eine exklusive Kombination von Linie Marker hat. In PBMCs, CD3 Ausdruck Immunzellen in zwei Hauptkategorien unterteilt: CD3-positiven T-Lymphozyten und CD3-negativen Zellen. Innerhalb der CD3 positiven Untergruppe, CD4+, CD8+ und γδ T-Zellen mit Antikörpern, die ausschließlich CD4, CD8 und der γδ-Rezeptor getrennt werden können. In vergleichbarer Weise, innerhalb der CD3 negativen Untergruppe können B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten eindeutig identifiziert werden mit Antikörpern gegen CD19, CD56 und CD14, beziehungsweise. In einen standardisierten Ansatz für ein Fluorochrom-One Marker Anti-CD3-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 – CD56 und -TCR γδ-Antikörper mit sieben verschiedenen Fluorochromes erkannt werden. Unser Ansatz kombiniert Anti-CD3 – CD56 und -TCR γδ Antikörper in einem Fluorochrom (für Bequemlichkeit Fluorochrom A beschriftet) und Anti-CD4-CD8, -CD14 und – CD19-Antikörper in einer unterschiedlichen Fluorochrom (Fluorochrom B). Dies ist möglich durch eine Kombination von Antikörper-Titration und differenzielle Antigen Ausdruck. Beide CD4+ und CD8+ T Zellen sind für den Anti-CD3-Antikörper in Fluorochrom A positiv, aber sie trennten sich im Fluorochrom B den Ausdruck des CD8-Signals während des Einsetzens mit einer ad-hoc-Titration, die CD4-Signal zwischen der CD8 zu maximieren und die CD3 positiven-CD4/CD8 doppelt Negative Zellen. Γδ T-Zellen drückt höheres Maß an CD3 CD4 und CD8, und daher als CD3 hoch4ausgewiesen werden können. Dieses Signal wird weiter verstärkt durch Kennzeichnung γδ T-Zellen in Fluorochrom A mit einer Anti-TCR γδ-Antikörpern, die Trennung zwischen niedrigen T-Zellen CD3 und CD3 hohe γδ T Zellen so zu verbessern. B-Zellen erkennen Sie als CD3– in Fluorochrom A und CD19+ in Fluorochrom B. Um negative NK-Zellen CD3 von B-Zellen zu trennen, wurde ein Anti-CD56-Antikörper in Fluorochrom A als Anti-CD3 verwendet. Dies ist möglich, weil CD56 auf NK-Zellen auf einem viel niedrigeren Niveau als CD3 auf T-Zellen-5zum Ausdruck gebracht. Zu guter Letzt sind Monozyten über eine Kombination von vorwärts-Side Scatter Eigenschaften und Expression von CD14 in Fluorochrom B. erkennbar
Die Idee der Kombination von bis zu vier Marker mit zwei Fluorochromes hat bereits erfolgreich vor6,7,8versucht worden und wurde in ein klinisches Protokoll verwendet, um bösartige lymphatische Populationen9 identifizieren . Ein früheren Bericht auch kombiniert sieben Markierungen (mit unterschiedlicher Spezifität von den Markern als wir in unser Protokoll verwendet) mit zwei Fluorochromes, aber dieser Ansatz auf eine komplexe Kennzeichnung jedes Antikörpers mit unterschiedliche Höhe der Fluorochrom10verlassen. Dies steht im Gegensatz zu unserer Methode, die im Handel erhältlichen Antikörper verwendet und kann angepasst werden, um die Gerätekonfiguration und profitieren von der neuen Generation von Polymer-Fluorochromes.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optischen Grenzen der meisten fließen Cytometers für die Aufzeichnung von fünf zusätzliche Markierungen ermöglichen komplexe Zellpopulationen zu verhören zu erweitern. Infolgedessen erweiterte immunologische Analysen auf erschwingliche 6-10 Fluorochrom fließen Cytometers durchgeführt werden kann, und 2-3 Fluorochrom Feldgeräte können bemerkenswerte Ergebnisse in Regionen mit begrenzten Ressourcen erreichen. High-End-Geräte können auch von diesem Ansatz profitieren, durch zusätzliche Fluorochromes tiefer Flow-Zytometrie-Analyse durchzuführen und um modulare Fluss durchflusszytometrischen Panels auf mehreren Linien an der gleichen Zeit11zu erstellen. Dies kann potenziell reduzieren die Anzahl der Platten in modularen Immunphänotypisierung Durchflusszytometrie verwendet und Umgang mit Zeit, Kosten und Fehler. Dieser Ansatz eignet sich auch sehr gut bei klinischen Proben mit begrenzten Anzahl von Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll hat sich gezeigt, ganz flexibel und unempfindlich gegen Änderungen in der Färbung, Puffer, Temperatur und peripheren Blutzellen Vorbereitung durch die hohe Expression der Linie Marker auf der Zelloberfläche. Der wichtigste Schritt für den Erhalt qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten ist Antikörper-Titration. Der Hinweis Da die Titration der Antikörper immer während der Installation von einem Fluss durchflusszytometrischen Panel durchgeführt werden sollte wird dieser Sch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett und Haut-Krankheiten, , Prämiennummer P30-AR053503; Die Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina-Irland-Programm für Lunge Gesundheit (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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