Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry
Summary
Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.
Abstract
Immuun cel karakterisering is sterk afhankelijk van multicolor stroom cytometry te identificeren subpopulaties gebaseerd op differentiële expressie van oppervlakte markers. Setup voor een klassieke multicolor panel vereist high-end instrumenten, aangepaste gelabelde antilichamen en zorgvuldige studie ontwerp om te minimaliseren van spectrale overlap. Ontwikkelden we een multiparametric analyse om te identificeren grote menselijke immuun populaties (CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifeer bloed door het combineren van zeven lineage markeringen met behulp van slechts twee fluorochromes. Onze strategie is gebaseerd op de observatie dat lineage markeringen voortdurend worden uitgedrukt in een unieke combinatie van elke celpopulatie. Het combineren van deze informatie met een zorgvuldige titratie van de antistoffen kan onderzoekers graag vijf extra markeringen, uitbreiding van de optische limiet van meeste flow cytometers. Head-to-Head comparison is aangetoond dat de overgrote meerderheid van immuun cel populaties in perifeer bloed kan worden gekarakteriseerd met vergelijkbare nauwkeurigheid tussen onze methode en de klassieke “een fluorescerende-een marker benadering”, hoewel de laatste nog steeds is nauwkeuriger voor het identificeren van populaties zoals NKT cellen en γδ T cellen. Het combineren van zeven markeringen met behulp van twee fluorochromes zorgt voor de analyse van complexe immuun cel populaties en klinische monsters op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en zelfs op 2-3 fluorescerende veld instrumenten in gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt voor het screenen van verschillende cel populaties in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.
Introduction
Stroom cytometry is een techniek die is ontwikkeld om te analyseren van meerdere parameters op enkele deeltjes met een snelheid van enkele duizenden evenementen per tweede1. Voorbeelden van monsters geanalyseerd door stroom cytometry omvatten, maar zijn niet beperkt tot, cellen, kralen, bacteriën, blaasjes en chromosomen. Een fluidic systeem regisseert deeltjes op het punt van de ondervraging waar elk deeltje zijn pad kruist met een of meer lasers, en meerdere parameters worden opgenomen voor verdere analyse. Voorwaartse en zijdelingse verstrooit, gegenereerd door de verstrooiing van het zuivere laserlicht, worden gebruikt voor het identificeren van de doelpopulatie en ophalen van informatie over de relatieve omvang en interne complexiteit/granulariteit van deeltjes, respectievelijk. Alle andere parameters, die goed zijn voor het merendeel van de gegevens in een flow cytometrische analyse, worden afgeleid door fluorescerende-geëtiketteerden sondes die worden herkend en binden aan specifieke doelstellingen op de deeltjes van belang.
Stroom cytometry is een primaire hulpmiddel voor immunologische studies te identificeren en te karakteriseren cel populaties. Om te ontleden de complexiteit van het immuunsysteem, multicolor panelen zijn voortdurend in ontwikkeling om uit te breiden het aantal markeringen gelijktijdig opgenomen voor diepe immunophenotyping voor cel populaties1. Dit leidt tot de ontwikkeling van krachtigere instrumenten en fluorochromes, met recente high-end flow cytometers meer dan 20 TL parameters. Dit resulteert in complexe studie ontwerp als gevolg van fluorescerende spectrale overlap en in hogere kosten in verband met aangepaste antilichaam etikettering en bekwame operatoren. In meerdere gevallen, worden complexiteit en kosten verlaagd door gebruik te maken van afzonderlijke panelen van markers voor andere cel populaties. Deze aanpak, echter is foutgevoelig, vermindert de informatie in elk paneel, en moeilijk toe te passen op monsters met een beperkt aantal cellen kan zijn. Bovendien, verhoging van het aantal markeringen verzet zich tegen diepe immunophenotyping op instrumenten met minder fluorescerende parameters. Eerder ontwikkelden we een kleuring protocol ter identificatie van de grote menselijke immuun populaties (CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten) in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door het combineren van zeven lineage markeringen gebruiken slechts twee fluorochromes in plaats van de zeven nodig met behulp van de traditionele “een fluorescerende-een marker” aanpak (www.hcdm.org)2,3. Ons eerste verslag onderzocht en gevalideerd de notie van het combineren van zeven markers in twee fluorochromes voor diepe immunophenotyping. In dit verslag presenteren wij een stap door stap protocol om te isoleren en vlek perifere bloedcellen, zich te concentreren op het praktische aspect en de stappen om een succesvolle kleuring voor probleemoplossing.
Dit protocol is gebaseerd op de observatie dat geslacht markeringen een constante expressie op het celoppervlak hebben en dat de bevolking van elke cel een exclusieve combinatie van lineage markers heeft. In PBMCs, CD3 expressie immuuncellen onderverdeelt in twee hoofdcategorieën: CD3-positieve T-lymfocyten en CD3-negatieve cellen. Binnen de CD3 positieve deelgroep, CD4+, CD8+ en γδ T cellen kunnen worden gescheiden met behulp van antilichamen die uitsluitend gericht zijn op CD4, CD8 en de γδ receptor. Op een vergelijkbare manier, binnen de CD3 negatieve deelgroep, kunnen B-cellen, NK-cellen en monocyten uniek worden aangeduid met behulp van antilichamen tegen CD19, CD56 en CD14, respectievelijk. In een standaard aanpak voor een fluorescerende-een marker, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19 – CD56 en -TCR γδ antilichamen worden gedetecteerd met zeven verschillende fluorochromes. Onze aanpak combineert anti-CD3 – CD56 en -TCR γδ antilichamen in een fluorescerende (gelabeld voor gemak fluorescerende A) en anti-CD4,-CD8, -CD14 en – CD19 antilichamen in een verschillende fluorescerende (fluorescerende B). Dit is mogelijk door een combinatie van titratie van antilichamen en differentiële antigeen expressie. Beide CD4+ en CD8+ T cellen zijn positief voor het anti-CD3 antilichaam in fluorescerende A, maar zij kunnen worden gescheiden in fluorescerende B maximaliseren van de expressie van de CD8-signaal terwijl het plaatsen, met een ad hoc-titratie, de CD4-signaal tussen de CD8 en de cellen van de positieve-CD4/CD8 dubbel negatief CD3. Γδ T-cellen spreekt hoger niveau van CD3 dan CD4 en CD8 en daarom kunnen zij worden geïdentificeerd als CD3 hoge4. Dit signaal wordt verder versterkt door het labelen van γδ T-cellen in fluorescerende A met een anti-TCR γδ antilichamen, dus verbetering van de scheiding tussen CD3 lage T-cellen en CD3 hoge γδ T cellen. B cellen kunnen worden geïdentificeerd als CD3– in fluorescerende A en CD19+ in fluorescerende B. Als u wilt scheiden CD3 negatieve NK cellen van B-cellen, werd een anti-CD56 antistof gebruikt in fluorescerende A als de anti-CD3. Dit is mogelijk omdat CD56 op NK-cel op een veel lager niveau dan CD3 op T cellen5 uitgedrukt. Ten slotte, monocyten kunnen worden geïdentificeerd via een combinatie van vooruit-kant scatter eigenschappen en expressie van CD14 in fluorescerende B.
Het idee van het combineren van maximaal vier markeringen met behulp van twee fluorochromes heeft al met succes geprobeerd voordat6,7,8, en is gebruikt in een protocol voor klinische te identificeren van kwaadaardige lymfatische populaties9 . Een vorig rapport ook gecombineerd zeven markeringen (met verschillende specificiteit van de markers dan wij in ons protocol gebruikt) met behulp van twee fluorochromes, maar deze aanpak gebaseerd op een complexe etikettering van elke antilichaam met variërende hoeveelheid fluorescerende10. Dit is in tegenstelling tot onze methode die gebruik maakt van verkrijgbare antilichamen en kan worden aangepast aan de configuratie van het instrument en kunt profiteren van de nieuwe generatie van polymeer fluorochromes.
Het algemene doel van deze methodiek is om uit te breiden van de optische grenzen van meeste flow cytometers waardoor de opname van vijf extra markers te ondervragen van complexe cel populaties. Dientengevolge, geavanceerde immunologische analyse kan worden uitgevoerd op betaalbare 6-10 fluorescerende flow cytometers, en 2-3 fluorescerende veld instrumenten kunnen bereiken opmerkelijke resultaten op gebieden met beperkte middelen. High-end instrumenten kunnen ook profiteren van deze aanpak met behulp van extra fluorochromes om diepere stroom cytometry analyse en maken de modulaire stroom cytometrische panelen gericht op verschillende geslachten bij de dezelfde tijd11. Dit kan potentieel het aantal panelen die worden gebruikt in de modulaire immunophenotyping stroom cytometry verminderen en verminderen kosten, fouten en verwerkingstijd. Deze aanpak is ook zeer goed geschikt in het geval van klinische monsters met een beperkt aantal cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier gepresenteerd is aangetoond dat het heel flexibel en ongevoelig voor veranderingen in de kleuring van de buffer, de temperatuur en de perifere bloedcellen voorbereiding als gevolg van de hoge uitdrukking van geslacht markeringen op het celoppervlak. De meest kritische stap voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige, reproduceerbare gegevens is titratie van antilichamen. Van de nota, aangezien de titratie van antilichamen moet altijd worden uitgevoerd tijdens de installatie van een stroom cytometri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het nationale Instituut van artritis en Musculoskeletal en ziekten van de huid, , award nummer P30-AR053503; De Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; Nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekte, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Ierland programma voor de gezondheid van de longen (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
