Forskelsbehandling af syv immun celle Subsets ved to-fluorokrom Flow flowcytometri
Summary
Her præsenterer vi et flow cytometric protokol for at identificere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter i humant perifert blod ved hjælp af kun to fluorokromer i stedet for syv. Med denne tilgang, kan fem ekstra markører registreres på de fleste flow cytometers.
Abstract
Immun celle karakterisering afhængig stærkt af flerfarvet flowcytometri at identificere delpopulationer baseret på differentierede udtryk af overflade markører. Opsætning af en klassiske flerfarvet panel kræver high-end instrumenter, brugerdefinerede mærkede antistoffer og omhyggelig undersøgelse design at minimere spektrale overlapning. Vi udviklede en multiparametric analyse for at identificere større immun befolkningsgrupper (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter) i perifert blod ved at kombinere syv lineage markører ved hjælp af kun to fluorokromer. Vores strategi er baseret på den iagttagelse, at lineage markører konstant er udtrykt i en unik kombination af hver celle befolkning. Ved at kombinere denne information med en omhyggelig titrering af antistoffer gør det muligt for efterforskerne at registrere fem ekstra markører, udvide den optiske grænse for de fleste flow cytometers. Head-to-head sammenligning viste, at langt størstedelen af immun cellepopulationer i perifert blod kan karakteriseres med tilsvarende nøjagtighed mellem vores metode og den klassiske “en fluorokrom-en markør tilgang”, selvom sidstnævnte er stadig mere præcist for at identificere befolkningsgrupper som NKT celler og γδ T celler. Kombinerer syv markører ved hjælp af to fluorokromer giver mulighed for analyse af komplekse immun cellepopulationer og kliniske prøver på overkommelige 6-10 fluorokrom flow cytometers, og selv på 2-3 fluorokrom feltinstrumenter i områder med begrænsede ressourcer. High-end instrumenter kan også drage fordel af denne fremgangsmåde ved hjælp af ekstra fluorokromer til at opnå dybere analyse af handelsstrømmen flowcytometri. Denne tilgang er også meget godt egnet til screening flere cellepopulationer ved kliniske prøver med begrænset antal celler.
Introduction
Flowcytometri er en teknik, der blev udviklet for at analysere flere parametre på én partikler med en hastighed på flere tusinde af begivenheder pr. anden1. Eksempler på prøver analyseret ved flowcytometri omfatter, men er ikke begrænset til, celler, perler, bakterier, vesikler og kromosomer. En fluidic system dirigerer partikler på forhør punkt, hvor hver partikel skærer sin vej med en eller flere lasere, og flere parametre registreres for yderligere analyse. Frem og side scatters, genereret af spredning af ren laserlys, der bruges til at identificere målgruppen og hente oplysninger om den relative størrelse og indre kompleksitet/granulering af partikler, henholdsvis. Alle de andre parametre, der tegner sig for de fleste af data i et flow cytometric analyse, er afledt af fluorokrom-mærket sonder, der genkender og binder til specifikke mål for partikler af interesse.
Flowcytometri er en primære værktøj til at identificere og karakterisere cellepopulationer immunologiske undersøgelser. For at dissekere kompleksiteten af immunsystemet, Multifarve paneler under konstant udvikling for at udvide antallet af markører samtidig registreres for dyb Immunofænotypning af celle populationer1. Dette fører til udvikling af bedre i stand til instrumenter og fluorokromer, med de seneste high-end flow cytometers overstiger 20 fluorescerende parametre. Dette resulterer i komplekse undersøgelse design på grund af fluorokrom spektrale overlapning og højere omkostninger i forbindelse med brugerdefinerede antistof mærkning og kvalificerede operatører. I flere tilfælde reduceres kompleksitet og omkostninger ved at bruge separate paneler af markører for forskellige cellepopulationer. Denne tilgang, men er fejl liggende, reducerer oplysninger i hvert panel, og kan være vanskelig at anvende til prøver med begrænset antal celler. Desuden øge antallet af markører til hinder for dyb Immunofænotypning på instrumenter med færre fluorescerende parametre. Vi tidligere udviklet en farvnings-protokol til at identificere store immun befolkningsgrupper (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B-celler, NK-celler og monocytter) i perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved at kombinere syv lineage markører ved hjælp af kun to fluorokromer i stedet for syv kræves ved hjælp af den traditionelle “en fluorokrom-en markør” tilgang (www.hcdm.org)2,3. Vores indledende rapport undersøgt og godkendt begrebet kombinerer syv markører i to fluorokromer til dyb Immunofænotypning. I denne betænkning præsenterer vi en trin for trin protokol for at isolere og plette perifere blod celler, med fokus på det praktiske aspekt og fejlfindingstrin for at opnå en vellykket farvning.
Denne protokol er baseret på den iagttagelse, at lineage markører har et konstant udtryk på cellens overflade, og at hver celle befolkning har en eksklusiv kombination af lineage markører. I PBMC, CD3 udtryk underinddeler immunceller i to hovedkategorier: CD3-positive T-lymfocytter og CD3-negative celler. Inden for den positive undergruppe i CD3, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan adskilles ved hjælp af antistoffer, der er udelukkende rettet mod CD4 og CD8 γδ receptor. I en sammenlignelig måde i CD3 negative undergruppe, kan B-celler, NK-celler og monocytter identificeres entydigt ved hjælp af antistoffer mod CD19, CD56 og CD14, henholdsvis. I en standard en fluorokrom-en markør tilgang, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, – CD56 og -TCR γδ antistoffer er fundet med syv forskellige fluorokromer. Vores tilgang kombinerer anti-CD3, – CD56 og -TCR γδ antistoffer i et fluorokrom (mærket for bekvemmelighed fluorokrom A) og anti-CD4-CD8, -CD14 og – CD19 antistoffer i en anden fluorokrom (fluorokrom B). Dette er muligt ved en kombination af antistoftitrering og differentieret antigen udtryk. Begge CD4+ og CD8+ T celler er positive for anti-CD3-antistof i fluorokrom A, men de kan adskilles i fluorokrom B maksimering udtryk for CD8 signal samtidig lægge, med en ad hoc-titrering, CD4 signalet mellem CD8 og CD3 positive-CD4/CD8 dobbelt negativ celler. Γδ T celler udtrykker højere niveau af CD3 end CD4 og CD8, og derfor kan identificeres som CD3 høj4. Dette signal er yderligere styrket ved mærkning γδ T-celler i fluorokrom A med en anti-TCR γδ antistoffer, dermed forbedre adskillelse mellem CD3 lav T-celler og CD3 høj γδ T celler. B-celler kan identificeres som CD3– i fluorokrom A og CD19+ i fluorokrom B. For at adskille CD3 negative NK celler fra B-celler, blev en anti-CD56 antistof brugt i fluorokrom A som anti-CD3. Dette er muligt fordi CD56 udtrykt på NK celler på et meget lavere niveau end CD3 på T celler5. Endelig, monocytter kan identificeres via en kombination af fremad-side scatter egenskaber og udtryk af CD14 i fluorokrom B.
Idé om at kombinere op til fire markører ved hjælp af to fluorokromer allerede med held har forsøgt før6,7,8, og er blevet brugt i en klinisk protokol til at identificere maligne lymfatisk populationer9 . En tidligere rapport også kombineret syv markører (med forskellige specificitet fra markører end vi brugte i vores protokol) ved hjælp af to fluorokromer, men denne tilgang har påberåbt sig en kompleks mærkning af hver enkelt antistof med varierende mængde af fluorokrom10. Dette er i modsætning til vores metode, som benytter kommercielt tilgængelige antistoffer og kan tilpasses til konfigurationen af instrument og kan drage fordel af den nye generation af polymer fluorokromer.
Det overordnede mål med denne metode er at udvide de optisk grænserne for de fleste flow cytometers giver mulighed for optagelse af fem ekstra markører til at afhøre komplekse cellepopulationer. Som en konsekvens, avancerede immunologiske analyse kan udføres på overkommelige 6-10 fluorokrom flow cytometers, og 2-3 fluorokrom feltinstrumenter kan nå bemærkelsesværdige resultater i områder med begrænsede ressourcer. High-end instrumenter kan også drage fordel af denne fremgangsmåde ved hjælp af ekstra fluorokromer til at opnå dybere analyse af handelsstrømmen flowcytometri og skabe modulære flow cytometric paneler målretning flere slægter på den samme tid11. Dette kan potentielt reducere antallet af paneler bruges i modulære Immunofænotypning flowcytometri og reducere omkostninger, fejl og håndtering tid. Denne tilgang er også meget godt egnet for kliniske prøver med begrænset antal celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her har vist sig at være ganske fleksible og ufølsomme over for ændringer i farvning buffer, temperatur og perifere blod celle forberedelse på grund af den høje udtryk af lineage markører på cellens overflade. Det mest afgørende skridt for at opnå høj kvalitet, reproducerbare data er antistoftitrering. At bemærke, da titrering af antistoffer bør altid udføres under installationen af et flow cytometric panel, føjer dette trin ikke ekstra bænk-tid til vores to-fluorokrom tilgang. Tit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af det nationale Institut for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme, , award antallet P30-AR053503; De Stabler Foundation, www.stablerfoundation.org; National Institute for allergi og smitsomme sygdomme, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program for lunge sundhed (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
