Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om eiwit niveaus te detecteren en te kwantificeren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese door immunokleuring met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Daarnaast beschrijven we een methode voor het bereiden en cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels van jonge muizen voor immunokleuring.
Abstract
Weefsel immunokleuring biedt zeer specifieke en betrouwbare detectie van eiwitten van belang binnen een bepaald weefsel. Hier beschrijven we een volledig en eenvoudig protocol om eiwit expressie te detecteren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Het protocol bestaat uit het voorbereiden en cryosnijden van weefsels, indirecte immunofluorescentie, beeld verwerving en kwantificering. Daarnaast wordt een methode beschreven voor de bereiding en het cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels voor immunokleuring, waarbij gebruik wordt gemaakt van craniofaciale weefsels en lange botten als voorbeeld. Deze methoden zijn essentieel om de eiwit expressie en morfologische/anatomische veranderingen in verschillende weefsels te bepalen tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels met passende modificaties. Kennis van de histologie en hoge kwaliteit van secties zijn van cruciaal belang om wetenschappelijke conclusies uit experimentele uitkomsten te trekken. Mogelijke beperkingen van deze methodologie omvatten maar zijn niet beperkt tot specificiteit van antilichamen en kwantificerings problemen, die hier ook worden besproken.
Introduction
Het gezicht is een belangrijk onderdeel van de menselijke identiteit, en bestaat uit verschillende soorten weefsels, zoals epitheel, spier, bot, kraakbeen, tand. Deze weefsels zijn afgeleid van alle drie de kiem lagen: Ectoderm, endoderm en mesoderm1,2. Voor een goede patronen en ontwikkeling van craniofaciale weefsels moeten celproliferatie, overlijden en differentiatie sterk worden gecoördineerd en gereguleerd door specifieke signalerings trajecten, zoals WNT-, FGF-, hh-en BMP-trajecten3,4 ,5. Defecten in proliferatie, overleving of differentiatie van cellen zullen leiden tot craniofaciale misvormingen, die behoren tot de vaakst voorkomende aangeboren geboorteafwijkingen. Transgene muizen zijn nuttige hulpmiddelen om mechanismen te bestuderen van craniofaciale morfogenese en pathogenese1,2,3,4,5. Het begrijpen van de veranderingen in craniofaciale structuren tijdens de ontwikkeling en pathogenese zal helpen om de belangrijkste ontwikkelingsprincipes te verduidelijken, evenals de mechanismen van craniofaciale misvormingen1,2,3 ,4,5.
De kleuring van hele Mount of gesectioneerde weefsels met specifieke antilichamen is een onschatbare techniek voor het bepalen van de ruimtelijke verdeling van eiwitten van belang 6. Formeel kan weefsel immunokleuring afhangen van immunohistochemie (IHC) of immunofluorescentie (IF). Vergeleken met het ondoorzichtige reactieproduct dat wordt gegenereerd met een chromogene substraat zoals 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) door IHC, indien het gaat om het gebruik van fluorescerende conjugaten die zichtbaar zijn door fluorescentiemicroscopie. Daarom, als kan duidelijk onderscheid maken tussen positieve cellen van achtergrondruis, en laat afbeeldingen kwantitatief worden geanalyseerd en verbeterd op een eenvoudige manier door software zoals imagej en Adobe Photoshop7,8. De hele Mount kleuring aanpak werkt op kleine blokken weefsel (minder dan 5 mm dik), die driedimensionale informatie over de locatie van eiwitten/antigenen kan bieden zonder de noodzaak voor reconstructie uit de rubrieken9,10 . Echter, in vergelijking met weefsel secties, hele Mount immunokleuring is tijdrovend en vereist grote hoeveelheden antilichaam oplossingen. Niet alle antilichamen zijn compatibel met de basisbenadering voor hele montage. Bovendien zal de onvolledige penetratie van antilichamen resulteren in ongelijke kleuring of valse negatieve kleuring. Hier zullen we ons concentreren op de immunofluorescentie detectie van eiwitten/antigenen op verdeelde weefsels. Voor harde weefsels (bv, hoofd, tand, lang bot), calcium depositie tijdens ontwikkeling/pathogenese maakt het monster moeilijk om sectie en gemakkelijk afgespoeld tijdens immunokleurings behandeling11,12. De meeste van de momenteel beschikbare protocollen decalcify harde weefsels vóór inbedding te maken snijden gemakkelijker, dat is tijdrovend en kan de morfologie en antigenen van monsters vernietigen als onjuist behandeld11,12. Om de problemen te overwinnen, hebben we een aanpak geoptimaliseerd voor het cryosnijden van harde weefsels zonder decalcificatie, wat leidt tot een verbeterde visualisatie van hun morfologie en verdeling van signalering van eiwitten.
Het hier beschreven protocol wordt gebruikt om de Morfometrische en histologische veranderingen in de craniofaciale weefsels van BMP-transgene muizen te bepalen. In het bijzonder omvat het Protocol (1) het oogsten en ontleden van het hoofd weefsel, (2) sectie en immunokleuring van experimentele markers (Ki67, pSmad1/5/9) samen met TUNEL kleuring, (3) beeldvorming van de secties met behulp van fluorescentiemicroscoop, en ten slotte (4) analyseren en kwantificeren van de resultaten. Het protocol voor de voorbereiding en cryosectie harde weefsels zonder decalcificatie wordt ook beschreven13. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor craniofaciale weefsels. Ze zijn ook toepasbaar op andere weefsels van verschillende leeftijden van monsters met passende aanpassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Michigan met betrekking tot de humane verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek. Alle dier procedures die in deze studie worden gebruikt, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan (protocol #PRO00007715).
1. weefsel preparaat
-
Bereiding van embryonale weefsels
- Bereid 1 10 cm schaal en verschillende 3,5 cm gerechten met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 12-goed kweek plaat met 2 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS in elke put voor elke zwangere muis. Plaats alle Petri schalen en de plaat op ijs.
Opmerking: Behandel 4% PFA in een rook afzuigkap. - Dissect embryo's van zwangere muizen in ijskoude PBS met een tang en een schaar zoals eerder beschreven14.
- Kort, euthanas een zwangere muis met CO2, pak de huid onder het midden van de buik met een tang en snijd door de huid alleen, dan zachtjes trekken op de huid om het te scheiden van de onderliggende buikspier wand.
- Vervolgens, snijd in de buikholte na dezelfde lijn van de huid incisie. Verwijder de baarmoeder met een reeks embryo's en verwijder de embryo's door de baarmoederwand voorzichtig weg te snijden. De extraembryonale weefsels zoals de dooier SAC en amnion zullen worden verwijderd.
- Snijd en Isoleer het hoofd van elk embryo.
- Breng elke kop in elke put van een 12-well plaat met 4% PFA met een plastic Transfer pipet of een tang. Repareer monsters in 4% PFA bij 4 °C gedurende 4 uur. Spoel de monsters in PBS bij 4 °C met voorzichtig schudden gedurende 12 uur.
Opmerking: Voor embryo's jonger dan embryonale dag 16,5 (E 16.5), Fixeer je embryo hoofden met 4% PFA direct na afzondering. Voor embryo's bij E 16.5 of later, verwijder de huid en vetweefsel van de kop en spoel meerdere malen in ijskoude PBS voordat fixatie. - Cryoprotect hoofden.
- Breng elke kop over in een nieuwe 12-put met 2 mL 30% sucrose in PBS met behulp van een plastic pipet of een tang. Schud zachtjes op 4 °C totdat het hoofd naar de bodem van de schaal zakt.
- Embed hoofden.
- Breng de cryoprotected kop in een mal met optimale Snijtemperatuur (OCT) compound. Voorbeelden in oktober gedurende enkele minuten. Pas de locatie en de richting van de monsters met de Tang aan.
- Plaats de mal op droogijs om te bevriezen. Bewaar de resulterende cryomolds in een plastic zak bij-80 °C tot u klaar bent voor cryosnijden.
Opmerking: De bijgesneden zijde van de monsters moet de bodem van de insluitings mal zien.
- Bereid 1 10 cm schaal en verschillende 3,5 cm gerechten met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 12-goed kweek plaat met 2 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS in elke put voor elke zwangere muis. Plaats alle Petri schalen en de plaat op ijs.
-
Bereiding van postnatale onverdecalcificeerde harde weefsels
- Euthanize bij 3-weekse of 3-maand oude muis met CO2. Verwijder de huid en vetweefsel. Knip en Isoleer het hoofd of de lange botten van de muis.
- Fix en cryoprotect het hoofd of lange bot van muizen zoals beschreven in stappen 1.1.3 – 1.1.4.
- Insluiten in 8% gelatine op een vergelijkbare manier als stap 1.1.5. Houd de cryomolds in een plastic zak bij-80 °C tot cryosectioning.
Opmerking: Decalcificatie is hier niet nodig. Om 8% gelatine te bereiden, meng 8 g gelatine met 100 mL PBS en kook met behulp van een magnetron. Houd er rekening mee dat het mengsel gemakkelijk kookt.
2. cryosnijden
- Stel cryostaat temperatuur in op-18 °C voor zachte weefsels ingebed in OCT of-25 °C en lager voor niet-ontharcificeerde harde weefsels ingebed in gelatine. Houd de monsters in de cryostaat kamer gedurende ongeveer 30 minuten om naar de temperatuur van de cryostaat te gaan.
- Verdrijven van het blok van de cryomold. Vries het blok op de preparaat boorkop (tissue houder) via montage met een LGO druppel. Houd de bijgesneden zijde van het monster het verst van de klauwplaat (tegenover de operator).
- Laad de op het blok gemonteerde Chuck op de cryostaat-objecthouder. Pas de meshouder aan om de hoek van het blad 3 ° – 5 ° ten opzichte van het monster te maken.
- Verzamel 10 μm secties op gecoate Microscoop dia's. Droge delen volledig op RT, dan bewaren ze bij-80 °C.
3. histologische kleuring en microscopische beeldvorming
- Immunofluorescentie kleuring
- Neem dia's van-80 °C. Houd dia's bij RT voor 1 uur naar lucht-secties. Spoel de glijbanen in 0,1% PBST (0,1% polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether in PBS; Zie tabel met materialen) driemaal gedurende 5 min elk om de LGO en permeabilize secties te wassen.
- Optioneel, uitvoeren antigeen ophalen (optioneel).
- Voorverwarm citraat buffer (10 mM Natriumcitraat pH 6) in de kleurings schaal met stoom-of waterbad tot 95 – 100 °C. Dompel de glijbanen in de citraat buffer, inbroed gedurende 10 min.
- Neem de kleurings schaal van Steamer of waterbad naar RT. koel de glaasjes bij RT gedurende 20 minuten of langer15.
Opmerking: Als alternatieven, gebruik tris-EDTA-buffer (10 mM tris-basis, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) of EDTA-buffer (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) voor het ophalen van warmte-geïnduceerde antigeen. Gebruik een snelkookpan, magnetron of waterbad voor het ophalen van warmte-geïnduceerde antigeen, naast de hete Steamer. Een enzym-geïnduceerde antigeen opvraging met trypsine of pepsine is een ander alternatief. Optimaliseer de concentratie en behandelingstijd van enzymatische opvraging om beschadiging van secties te voorkomen. Optimaliseer de antigeen-Ophaalmethode voor elke antilichaam/antigeen-combinatie.
- Inbroed elke dia met 200 μL blokkerende oplossing (5% Donkey serum verdund in 0,1% PBST) bij RT gedurende 30 minuten, en verwijder vervolgens de blokkerende oplossing zonder te spoelen.
- Inbroed elke glijbaan met 100 μL primair antilichaam of antilichamen verdund in blokkerende oplossing voor 1 uur bij RT of O/N bij 4 °C. Spoel dia's met PBS driemaal gedurende 10 minuten per RT.
- Inbroed elke glijbaan met 100 μL secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing voor 1 uur bij RT. Spoel dia's in PBS driemaal gedurende 10 minuten per RT. Bescherm dia's tegen licht.
- Koppel dia's.
- Voeg twee druppels anti-fade medium toe met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) op de glijbaan. Dan bedekken met een dekslip.
- Bewaren bij 4 °C in het donker tot het beeld klaar is.
Opmerking: Als alternatief, label de kernen met DAPI of Hoechst 33324 kleurstof verdund 1:2000 in PBS op RT eerste, dan mount met glycerol.
- Terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end labeling (TUNEL) kleuring.
Opmerking: Dubbel-streng DNA met 3 '-hydroxyl Termini (3 ' OH DNA Termini) zal vormen tijdens apoptosis in de cel. Hier bieden we een protocol dat het gratis 3 ' OH DNA Termini in situ etiketteer via het labelen van DNA fragmenten met de digoxigenin-nucleotide met behulp van terminale deoxynucleotidyl Transferase (TdT) door specifieke kleuring met een commerciële Kit (Zie tabel van materialen ).- Optioneel, vlekken secties met primaire en Alexa Fluor-488 gelabelde secundaire antilichamen voorafgaand aan de TUNEL kleuring. Spoel de dia's in PBS driemaal gedurende 10 minuten per stuk.
Opmerking: Deze stap is optioneel voor een dubbele kleuring van een eiwit en TUNEL in dezelfde dia. - Inbroed elke dia met 100 μL Proteïnurie K (10 μg/mL in 10 mM tris pH 7,5 en 5 mM EDTA) gedurende 5 min bij RT. Spoel de dia's met PBS driemaal gedurende 10 minuten per RT.
Opmerking: Pas de incubatietijd en-temperatuur van proteinase K aan voor elk weefseltype. Voor 10 μm delen van de embryo hoofden, vastgesteld op 4% PFA, inbroed gedurende 5 minuten bij RT. In aanvulling op de methode met behulp van proteinase K, gebruik van alternatieve behandelingen indien nodig, met inbegrip van (1) vers bereide 0,1% polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether, 0,1% Natriumcitraat, 10 min bij 37 °C; (2) 0,25% – 0,5% pepsine in HCl (pH 2) of 0,25% trypsine, 10 min bij 37 °C; en (3) bestraling van de magnetron met 0,1 M citraat buffer (pH 6). - Breng 200 μL blokkerende oplossing (5% Donkey serum verdund in 0,1% PBST) aan op elke dia, inbroed bij RT gedurende 30 minuten, tik op de blokkerende oplossing zonder te spoelen.
- Breng 50 μL van de equilibratie buffer van de kit aan op elke dia bij RT gedurende ten minste 10 sec. Druk de buffer uit zonder te spoelen.
- Bereid reactiemengsel (werk sterkte TdT-enzym) door het mengen van TdT-enzym met de reactiebuffer geleverd door de kit bij de verhouding van 3:7. Breng 50 μL van het reactiemengsel aan op elke dia en inbroed bij 37 °C gedurende 1 uur. Druk de buffer uit zonder te spoelen.
- Breng 200 μL van de stop buffer (1:30 verdund in ddH2O) die door de kit aan elke dia wordt geleverd, vervolgens INBROED bij RT gedurende 10 min. Spoel DIA'S met PBS drie keer gedurende 10 minuten per stuk.
- Etiket met Rhodamine antilichamen.
- Breng 50 μL pre-warmed (RT) anti-digoxigenine geconjugeerde (Rhodamine) (1:1 verdund in blokkerende oplossing) aan op elke dia. Inincuberen bij RT gedurende 30 minuten in het donker.
- Spoel dia's met PBS driemaal gedurende 10 minuten per stuk. Koppel dia's als stap 3.1.6.
- Optioneel, vlekken secties met primaire en Alexa Fluor-488 gelabelde secundaire antilichamen voorafgaand aan de TUNEL kleuring. Spoel de dia's in PBS driemaal gedurende 10 minuten per stuk.
4. Imaging acquisitie
- Gebruik positieve controles (weefsels positief voor het doel antigeen) om de signaal etikettering en negatieve controles te controleren (laat het primaire antilichaam, Isotype-controle of weefsel negatief voor het doel antigen weg) om de achtergrond van beelden onder de fluorescerende Microscoop.
- Stel de apparatuur en camera condities (belichtingen en andere algemene instellingen) in voorbeeld vorming op basis van de signaalintensiteit van negatieve en positieve controles.
Opmerking: Deze voorwaarden variëren met (1) camera's en microscopen die worden gebruikt voorbeeld vorming, (2) antilichamen, en (3) weefsels voor elk experiment. Gemeenschappelijke omstandigheden die worden gebruikt voor craniofaciale weefsels zijn ISO 200 met een blootstellingstijd variërend van 1/100 s tot 1 s afhankelijk van de kwaliteit en specificiteit van antilichamen. Passende vergroingen variëren afhankelijk van de grootte van de monsters en het doel van de experimenten. - Verkrijg afbeeldingen met conventionele epifluorescentie Microscoop of confocale Microscoop. Verzamel afbeeldingen (inclusief die van de bijbehorende besturingselementen) in dezelfde omstandigheden voor elk kleurkanaal. Sla afbeeldingen op met dezelfde indeling (TIFF is het beste om informatie te bewaren).
5. fluorescentie kwantificering
Opmerking: Het statistisch vergelijken van de kleuring tussen verschillende groepen zal in veel gevallen meer informatief zijn. Kwantificeer met de immunofluorescentie beelden het relatieve niveau van het eiwit door de signaal dichtheid te meten, positieve cellen te tellen of positieve gebieden te berekenen. Voor statistische analyse is het minimum aantal biologisch onafhankelijke monsters 3. Een typische methode is om ten minste drie secties van elk monster te genereren en afbeeldingen te maken voor ten minste drie representatieve gebieden in elke sectie.
-
Kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie met ImageJ
- Open de software en gebruik analyse ≫ Stel metingen in om te controleren of alleen het gebied en de geïntegreerde dichtheid zijn geselecteerd. Gebruik bestands > geopend om te analyseren afbeeldingen te openen.
- Gebruik de werkbalk om het vierkant-of cirkelpictogram uiterst links te selecteren. Selecteer met het gereedschap selecteren het gebied dat u op de afbeelding wilt analyseren. Gebruik analyse > meting om de uitlezen van het geselecteerde gebied en de geïntegreerde dichtheid in het resultatenvenster te verkrijgen. Selecteer een regio naast een positieve cel die geen fluorescentie heeft om de achtergrond te lezen.
- Herhaal stap 5.1.2 om andere afbeeldingen te analyseren. Aanpassing van het gebied dat moet worden geanalyseerd om overeen te laten gaan met dat van de eerste afbeelding.
- Kopieer alle gegevens in het resultatenvenster en plak deze in een spreadsheet wanneer u klaar bent met analyseren.
- Bereken de gecorrigeerde intensiteit van de fluorescentie (CTCF) als geïntegreerde dichtheid — (oppervlakte van de geselecteerde cel x gemiddelde fluorescentie van achtergrond aflezingen). Vergelijk het verschil tussen de gecorrigeerde totale celfluorescentie tussen de monsters en maak een grafiek.
-
Kwantificering van het aantal positieve cellen van fluorescerende afbeeldingen met ImageJ
- Handmatige celtelling.
- Gebruik imagej > plug-ins > analyse om de invoegtoepassing voor de celteller te installeren.
- Gebruik bestands > geopend om te analyseren afbeeldingen te openen. Gebruik Plugins > analyse > teller om het venster teller en het resultatenvenster te openen.
Opmerking: De teller van de cel werkt niet op stapels. Voor het tellen van stapels, plugin plot z axis profile, gebruik dan Image ≫ stacks > plot z axis profile om de intensiteit van een bewegende ROI te bewaken met behulp van een deeltje tracking tool. Deze tool kan handmatig of automatisch zijn. - Klikken op een van de knoppen onder in het itemvenster om het tellen te initiëren. Klik direct op een cel/object om te tellen tot de afwerking.
- Klik op de knop resultaten in het venster aantal . Het totale aantal cellen dat wordt geteld, wordt weergegeven in het resultaten venster. Sla het resultaatlog op als spreadsheet en analyseer.
- Geautomatiseerde celtelling.
- Gebruik bestands > geopend om te analyseren afbeeldingen te openen. Converteer de RGB-afbeelding naar een afbeelding in grijstinten voordat u verdergaat.
- Gebruik afbeelding > pas > drempel aan om alle gebieden te selecteren die moeten worden geteld.
- Gebruik analyseren ≫ deeltjes analyseren om het aantal cellen/deeltjes te krijgen. Stel een bereik in van de geldige deeltjesgrootte (bijvoorbeeld 100-oneindig) in plaats van de standaardwaarde 0-oneindig om cellen/deeltjes binnen een bepaald bereik te tellen. Sla het resultaatlog op als spreadsheet en analyseer.
Opmerking: om andere informatie van de afbeelding te krijgen, gaat u naast gebied naar analyseren > metingen instellen en selecteert u het vakje naast de benodigde informatie.
- Handmatige celtelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryonale craniofaciale weefsel secties
Naar aanleiding van de bovenstaande stappen, hoofden werden ontleed van de controle (P0-CRE) of Mutant (constitutief geactiveerd Bmpr1a in neurale Crest cellen, P0-CRE; caBmpr1a) embryo's op embryonale dag (E) 16,5 of 18,5. Na de fixatie in 4% PFA voor 4 h, werden monsters ingesloten in de in oktober en cryogesectioneerde coronally. De resulteerden waren immunogekleurd met antilichamen tegen pSmad1/5/9 (downstream BMP signalerings factoren) of Ki67 (een celproliferatie marker) zonder antigeen opvraging volgens het protocol. Zoals weergegeven, waren pSmad1/5/9 (Figuur 1a) en Ki67 (figuur 1c) positief in de voorste botten van controle embryo's. In gemuteerde embryo's werd de concentratie van pSmad1/5/9 verhoogd (Figuur 1b), terwijl die van Ki67 werd verlaagd (figuur 1d) in de voorste botten. De celdood in die monsters werd ook gecontroleerd volgens het protocol. Zoals blijkt, werden meer apoptotische cellen waargenomen in de voorste botten van mutanten embryo's dan die van controle embryo's (Figuur 1e, F).
Undecalcified craniofaciale weefsels of lange botten secties
Naar aanleiding van de bovenstaande stappen voor undecalcified harde weefsels, hoofden van 3 weken oude muizen (P0-CRE; mTmG (membraan-tomaat en membraan GFP)) werden vastgesteld met 4% PFA en ingebed in 8% gelatine. Coronale cryosecties werden gewassen met PBST en gemonteerd met anti-fade medium met DAPI. Figuur 2a , B aantonen dat gelatine niet interfereert met fluorescerende signalen van sectioneren weefsels.
Hoofden en dijbenen van 3 weken-oude of 3 maand-oude muizen werden gebruikt om te controleren of gelatine ingebed undecalcified weefsels zijn goed voor als. De hele hoofden en dijbenen werden verwerkt en gesectioneerd volgens het protocol. De resulteerde secties werden gebruikt voor SOX9 immunokleuring (Figuur 3) of OSX en E11/Podoplanin dubbele immunokleuring (Figuur 4). Zoals getoond, werden goede kwaliteits secties verkregen uit de meeste van de 3 weken harde weefsels, met inbegrip van de trabeculaire en de corticale compartimenten van het dijbeen (Figuur 3a, B, figuur 4a– D), de voorste botten (figuur 4e, F), de snijtanden (figuur 3e, F, figuur 4i, J), nasale weefsels (figuur 3c, D), en de schedel met inbegrip van de nasale premaxilla hecht en de omringende botten (figuur 4G, H ) van het hoofd. Terwijl, met 3-maand-oude monsters, goede kwaliteit secties werden alleen verkregen in sommige van de harde weefsels, met inbegrip van de trabeculaire compartimenten van het dijbeen (figuur 3G, H, figuur 4k, L), nasale weefsels (figuur 3i , J), en de schedel met inbegrip van de nasale premaxilla hecht en de omringende botten (figuur 4m, N) van het hoofd. Zoals weergegeven in Figuur 3, werden SOX9 positieve cellen specifiek gedetecteerd in de chondrocyten van de groei plaat(Figuur 3b) en het gewricht (figuur 3H) uit het dijbeen en het neustussenschot (figuur 3D, J). In de 3 weken oude incisor werd SOX9 aangetroffen in de mesenchymale cellen (figuur 3F). OSX en E11 dubbele kleuringsresultaten toonden aan dat OSX werd aangetroffen in osteoblasten, terwijl E11 werd aangetroffen in osteocyten van botten uit het dijbeen en het hoofd (figuur 4b, D, H, L, N). In de 3-weekse incisor was OSX positief in odontoblasten, terwijl E11 positief was in de follikel mesenchymale cellen (figuur 4J). Deze resultaten geven aan dat ondecalcified harde weefsels ingebed met gelatine goed behouden antigeen functies.
Figuur 1: voorbeelden van if-resultaten van pSmad1/5/9, Ki67 of TUNEL in controle embryo's en Mutant embryo's met verbeterde bmp-activiteit. Constitutief geactiveerde Bmpr1a (caBmpr1a) muizen werden gekruist met P0-CRE muizen te verhogen BMP signalering activiteit in neurale Crest cellen (nccs). Hoofden van de controle (P0-CRE; caBmpr1a+/+) en Mutant (P0-CRE; caBmpr1aFX/+) embryo's werden ontleed bij e 16.5 of e 18.5, vastgesteld met 4% PFA voor 4h, cryoprotected met 30% sucrose voor 1 dag, ingebed in OCT, en cryosectioneerd bij-18 °C. Secties van het frontale bot (vergelijkbaar niveau met het oog) werden gebruikt voor immunodetectie tegen pSmad1/5/9, Ki67 of TUNEL kleuring. A, B) pSmad1/5/9 (groene) kleurings patronen in de voorste beenderen van de controle (a) of de Mutant (b) embryo's bij e 16.5. (C, D) Ki67 (groen) kleurings patronen in de voorste botten van de controle (C) of Mutant (D) embryo's bij e 18.5. (E, F) TUNEL (rode) kleurings patronen in de voorste botten van de controle (e) of Mutant (F) embryo's bij E 18.5. Nuclei waren gekleurd met DAPI (blauw). FB = frontaal bot, B = hersenen. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: voorbeelden van mTmG reporter signaal resultaten van undecalcified weefsels in het hoofd. Hoofden van 3 weken oude P0-CRE muizen met membraan-tomaat en membraan GFP (mtmg) reporter werden ontleed, opgelost met 4% PFA voor 4h, cryoprotected met 30% sucrose voor 2 dagen, ingebed in 8% gelatine, en cryosectionent bij-25 ° c. Hoofdsecties tonen duidelijk GFP (groen, CRE recombinatie positief) en tomaat (rood, CRE recombinatie negatief) signaal in het nasale bot en de neus weefsels (A, B). Nuclei waren gekleurd met DAPI (blauw). NB = nasaal bot, N = nasale weefsels, NS = nasale septum. Schaal staven = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: voorbeelden van SOX9 immunokleuring resultaten van ondecalcified weefsels in het hoofd en de femora. Hoofden en dijbenen werden ontleed van 3 weken of 3 maanden oude muizen, opgelost met 4% PFA voor 4h, cryoprotected met 30% sucrose voor 2 dagen, ingebed in 8% gelatine, en cryosectionent bij-25 ° c. Slides werden gebruikt voor immunodetectie tegen SOX9 (rood). Nuclei waren gekleurd met DAPI (blauw) (B, D, F, H, J). Aangrenzende delen van die weefsels werden gebruikt voor hematoxyline & eosine (H & E) kleuring (a, C, e, G, I). Pijlkoppen in A en B duiden op groei plaat en in G en H, articulaire kraakbeen. Pijlen in A en G geven trabeculaire botten en in C, D, I en J, nasale septum. DM = Dental Mesenchyme, DE = tandheelkundige epitheel, FM = follikel Mesenchyme. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: voorbeelden van OSX en E11 dubbele immunokleuring resultaten van undecalcified weefsels in het hoofd en de femora. Hoofden en dijbenen werden ontleed van 3 weken oude of 3 maanden oude muizen, opgelost met 4% PFA voor 4h, cryoprotected met 30% sucrose voor 2 dagen, ingebed in 8% gelatine, en cryosectioneerd bij-25 °c. Secties werden gebruikt voor dubbele immunokleuring met antilichamen tegen OSX (rood) en E11/Podoplanin (groen). Nuclei waren gekleurd met DAPI (blauw) (B, D, F, H, J, L, N). Aangrenzende delen van die weefsels werden gebruikt voor H & E kleuring (A, C, E, G, I, K, M). Pijlen in A, B, K en L duiden op trabeculaire compartimenten van het dijbeen; C en D, corticale compartimenten van het dijbeen; en in E en F, de voorste botten. Pijlpunten in A en B duiden op een groei plaat. BM = beenmerg, N = nasale weefsels, DM = tandheelkundige mesenchym, de = tandheelkundige epitheel, FM = follikel Mesenchyme, NPS = nasale bovenkaaks hecht. De voorste botten (E, F) en de nasale premaxilla hecht en omringende botten (G, H, M, N) worden ook getoond. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van de muis hoofd en undecalcified bot weefsels, en cryosnijden voor immunokleuring van celproliferatie, celdood, en BMP-signalering markers. We geven ook een gedetailleerd beeld van de strategie voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens van immunofluorescentie beelden. Deze methoden kunnen ook van toepassing zijn op andere weefsels met passende aanpassingen.
De voorwaarden voor weefsel bereiding variëren afhankelijk van de grootte en het type weefsels. De fixatie en cryoprotection tijd hebben meestal enkele uren nodig om te overnachten. Na fixatie kan het weefsel ook in paraffine worden ingebed en met een microtoom16worden verdeeld. Hoewel zowel paraffine als OCT goed werken voor immunokleuring, zijn er enkele verschillen tussen hen. Paraffineblokken kunnen gedurende meerdere jaren bij RT worden bewaard, terwijl de OCT-blokken 1 jaar bij-80 °C zijn. Paraffine behoudt weefsel morfologie, terwijl ijs kristal gevormd tijdens de LGO insluiten kan negatieve invloed hebben op weefselstructuren. Paraffine maskeert soms epitopen van antigenen, terwijl Oct enzym activiteiten en antigeen epitopen bewaart. Daarom is er geen antigeen-opvraging nodig voor de meeste antilichamen indien vastgesteld in 4% PFA voor slechts 4 uur of minder en ingebed in OCT. Het is echter nog steeds mogelijk om betere resultaten te krijgen door antigeen te verkrijgen, als positieve controles geen goede kleuringsresultaten in cryosecties vertonen.
Zowel Hoechst Dye als DAPI kunnen worden gebruikt voor nucleaire contra-kleuring. Ze hebben gelijkenissen, want beide (1) zijn UV-opgewonden, kleine groef bindende chemicaliën om signalen te zenden die evenredig zijn aan het totale DNA-gehalte, en (2) worden blootgesteld aan foto-bleking na een lange blootstelling. Hoechst-kleurstoffen worden echter meestal gebruikt voor de kleuring van DNA-inhoud in levende cellen vanwege hun hoge permeabiliteit. DAPI wordt meestal gebruikt voor het kleuring van DNA in vaste cellen vanwege de lage membraan permeabiliteit. Daarnaast genereert DAPI een sterker en stabieler signaal dan Hoechst.
Goede controles zijn essentieel voor IF. De specificiteit van elk nieuw antilichaam moet worden bevestigd door de Western Blot-analyse, indien van toepassing. De optimale werkconcentratie van een bepaald primair antilichaam moet worden bepaald door het gebruik van seriële verdunningen. Er moet een positieve controle (weefsel of cel waaruit het eiwit/antigeen blijkt) worden opgenomen om het IF-proces en de specificiteit van antilichamen te controleren. Er moet ook een negatieve controle worden opgenomen, bijvoorbeeld afwezigheid van het primaire antilichaam, of de vervanging van normale IgG van dezelfde soort voor het primaire antilichaam, of weefsels die negatief zijn voor het doel antigeen. Bij het nemen van Foto's moet het monster zonder secundaire antilichamen (achtergrondcontrole) zelfstandig worden onderzocht met elk kanaal om de grenzen van de signaalversterking en de offset te bepalen die moeten worden aangepast voor de uiteindelijke beeldvorming. Voor de detectie van meerdere labels moeten achtergrond besturingselement en single-gelabelde besturingselementen worden voorbereid om te voorkomen dat spectrale overlap artefacten. Alle kanalen die zullen worden gebruikt om een beeld van een monster met meerdere labels te verkrijgen, moeten worden onderworpen aan onafhankelijke achtergrondcorrectie, omdat het niveau van autofluorescentie in elk kanaal aanzienlijk varieert.
We bieden ook het protocol voor de voorbereiding en cryosectioning van ondecalcified harde weefsels ingebed in gelatine. Voor de in de LGO ingesloten gedecalcificeerde harde weefsels, zullen de meeste van de harde weefsel secties worden losgekoppeld van een glij bril tijdens immunokleurings procedures, vanwege hun lage adhesie karakter op de glijbaan. De kleefband die is ontworpen om cryosnijden te vergemakkelijken, helpt bij het genereren van goede kwaliteits secties. Maar deze secties zijn gemakkelijk beschadigd wanneer de tape afbladderen. Voor gelatine ingesloten weefsels, is er geen noodzaak voor een tape-transfersysteem voor het genereren van goede kwaliteit secties. Als insluitings medium kan gelatine het monster goed infiltreren, hoewel het een lagere viscositeit heeft in vergelijking met Oct. gelatine is gebruikt in andere histologische toepassingen, zoals hersenweefsel17,18 en ultradunne delen van cellen voor immunocytochemie19. Hier, gelatine werd gebruikt om undecalcified bot insluiten, die blokken gemakkelijker te cryosectie genereert dan OCT. Er zijn verschillende kleine tips om goede delen van gelatine ingebed undecalcified harde weefsels. De kritieke stap is het insluiten met gelatine in plaats van OCT. Voor een betere penetratie, houd monsters in 30% sucrose een dag na de monsters zinken naar de bodem. Het is even belangrijk om de temperatuur lager dan normaal te stellen bij ongeveer-25 °C. Een ultrascherp mes is niet nodig. Hoewel een lagere Cryo-temperatuur (-25 °C) enkele verbeteringen aanbrengt voor het cryosnijden van in oktober ingesloten, niet-decalcificeerde harde weefsels, is het nog steeds moeilijk om een goede integriteit van weefselstructuren te krijgen. Zoals weergegeven in Figuur 2, Figuur 3en Figuur 4, werden goede kwaliteits secties van toepassing voor immunokleuring verkregen uit gelatine ingesloten harde weefsels (bijv. trabeculaire botten, corticale botten, schedel botten, neus weefsels en incisor). Deze resultaten bewees dat gelatine-insluiting de preparaat-integriteit van harde weefsel secties aanzienlijk verbetert, maar verbetert ook de hechting van de secties op een Slide bril. Bovendien behoudt gelatine antigeen functies en vertoont compatibiliteit met fluorescerende signalen en immunokleuring. Deze techniek werkt echter alleen goed voor maximaal 3 maanden oude samples. Mogelijke verbeteringen van deze methode zijn (1) om de monsters verder te ontleden om het doelweefsel van andere delen te scheiden om de structuur van het weefsel eenvoudig te maken (in het geval van tanden, moet de onderkaak of maxilla worden gedissneden en in plaats van het hele hoofd worden vastgezet) en (2) 10% EDTA gebruiken om weefsels te decalcify voor slechts 2 – 3 dagen voor cryoprotection. Deze korte tijd van decalcificatie zal de immunokleurings resultaten niet in gevaar brengen. Een andere zorg is dat gelatine, als niet-waterige insluitings media, niet gemakkelijk kan worden verwijderd uit dia's, wat kan leiden tot een hogere achtergrond afhankelijk van kleurings methoden (bijv. H & E kleuring).
Immunokleurings resultaten zijn niet gemakkelijk te kwantificeren, dus ze worden meestal semi-kwantitatief gebruikt. Moeilijkheden en beperkingen van de kwantificering van immunokleuring van craniofaciale weefsels omvatten maar zijn niet beperkt tot de volgende: (1) het is moeilijk om het te tellen gebied te definiëren als gevolg van de complexiteit van de structuur van craniofaciale weefsels; (2) het is moeilijk om het gelabelde gebied of gelabelde cellen te definiëren vanwege de niet-lineaire aard van de immunokleuring; (3) er is beperkte informatie beschikbaar over het dynamische bereik van het signaal; (4) het is moeilijk om de intensiteit van signalen tussen beelden of groepen te vergelijken als gevolg van het vervagen van het fluorescerende signaal tijdens beeld verwerving; en (5) de signaal achtergrond kan significant veranderen tussen antilichamen, dia's en monsters. Om de betrouwbaarheid van de kwantificerings resultaten te verhogen, moet het experiment zorgvuldig en strikt worden uitgevoerd. Alle monsters moeten onder dezelfde voorwaarden worden verwerkt. Tijdens de immunokleuring zijn verschillende besturingselementen vereist om de signaal achtergrond te evalueren en het positieve gebied of de cellen voor het signaal te definiëren. Neem overtuigende en representatieve afbeeldingen om het te tellen gebied duidelijk te laten zien en gelabelde cellen met een goed contrast. Bovendien moeten tijdens de beeld verwerving de camera-instelling en de instelling van de apparatuur consistent blijven.
Samen, presenteren we een eenvoudig standaardprotocol voor immunofluorescentie op muis craniofaciale weefsels, vooral voor undecalcified harde weefsels. Immunokleurings analyse van craniofaciale weefsels zal niet alleen helpen om het mechanisme van morfogenese tijdens de ontwikkeling te begrijpen, maar ook de veranderingen tijdens de pathogenese illustreren. Bovendien kan immunokleuring ook worden gebruikt om het expressie patroon van andere signalering van liganden, receptoren of andere fenotypische markers te bestuderen, naast celproliferatie, celdood en het BMP-signalerings traject. De kritieke stappen van een immunokleurings experiment moeten echter op gepaste wijze worden aangepast voor elk antigeen/antilichaam of weefsel om specifieke kleuring en geminimaliseerde niet-specifieke achtergrond signalen te krijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01DE020843 to Y.M.), de International FOP Association (Y.M.), en een subsidie-in-Aid van de National Natural Science Foundation of China (31500788 tot J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C.
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
