Summary
Denne protokol beskriver brugen af silicium nanowires til intracellulær optisk bio-modulering af celle i en enkel og nem at udføre metode. Teknikken er meget tilpasningsdyg til forskellige celletyper og kan bruges til in vitro såvel som in vivo applikationer.
Abstract
Myofibroblasts kan spontant internalisere silicium nanowires (SiNWs), hvilket gør dem til et attraktivt mål for bioelektroniske applikationer. Disse celle-silicium hybrider tilbyder blyfri optisk modulering kapaciteter med minimal tivitet til normal celle adfærd. De optiske kapaciteter opnås ved de fototermiske og fotoelektriske egenskaber af SiNWs. Disse hybrider kan høstes ved hjælp af standard væv kultur teknikker og derefter anvendes til forskellige biologiske scenarier. Vi demonstrerer her, hvordan disse hybrider kan bruges til at studere den elektriske kobling af hjerteceller og sammenligne, hvordan myofibroblaster par til hinanden eller til kardiomyocytter. Denne proces kan udføres uden særligt udstyr ud over et fluorescerende mikroskop med koblet laserlinje. Også vist er brugen af en specialbygget MATLAB rutine, der gør det muligt kvantificering af calcium formering inden for og mellem de forskellige celler i kulturen. Myofibroblaster er vist sig at have en langsommere elektrisk respons end kardiomyocytter. Desuden myofibroblast intercellulær formering viser lidt langsommere, men sammenlignelige hastigheder til deres intracellulære hastigheder, hvilket tyder passiv formering gennem hul kryds eller nanorør. Denne teknik er meget fleksibel og kan nemt anvendes til andre cellulære arenaer, for in vitro samt in vivo eller ex vivo undersøgelser.
Introduction
Alle biologiske organismer bruger elektricitet, i form af ioner, til at regulere den cellulære adfærd. Cellemembraner indeholder forskellige typer af specifikke ionkanaler, der muliggør passiv og aktiv transport af ioner. Disse ioner regulerer funktionerne af excitable celler, såsom neuronal aktivitet og skelet-og hjertemusklen kontraktilitet. Men bioelektricitet spiller også en vigtig rolle i ikke-excitable celler, der regulerer mange cellulære funktioner såsom celleproliferation1, neuroimmunity2,3,4, og stamceller differentiering5.
I de seneste årtier har bioelektriciteten vakt stigende interesse, hvilket har bidraget til udviklingen af en lang række teknologier til bioelektroniske grænseflader. Mikroelektrode patch pipetter er guldstandarden for intracellulær optagelse og stimulering6. I denne metode trækkes en glaspipette under særlige forhold for at danne en skarp kant med en porestørrelse på få mikron. Denne pipette er fyldt med en buffer, og pipetten giver mulighed for direkte kontakt med bufferen med den intracellulære diskenhed. Dette resulterer i en bioelektrisk grænseflade, der giver ekstremt høje signal til støj forhold, præcis kontrol over cellulære elektriske aktivitet, og ekstremt høj tidsmæssig opløsning. Selv om denne metode er et ekstremt kraftfuldt værktøj, som for nylig blev nedskaleret til en nano-pipettekonfiguration 7, er det forbundet med flere vigtige tekniske begrænsninger. Cytosolfortyndingseffekten8, samt mekaniske vibrationer, begrænser dens nytte til kortsigtede forhør, og det kræver dyrt specialiseret udstyr og et højt niveau af tekniske færdigheder. Desuden begrænser dens bulkiness antallet af celler, der kan registreres eller stimuleres samtidigt, og på grund af dens invasive, det kan ikke omkonfigureres i hele et eksperiment. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet mikroelektrodearrays, men elektrodernes størrelse begrænser den rumlige opløsning samt intracellulær adgang. Nanoelektrodearrayer gør det muligt for intracellulær optagelse og stimulering , men kræver slibende elektroporation for at få adgang til cytosol9,10. Desuden er alle disse metoder substratbundet og er derfor begrænset til in vitro-cellekulturer eller til eksterne overfladiske celler uden adgang til celler, der er inde i et 3-dimensionelt (3D) væv.
Optogenetik11 er almindeligt anvendt til at løse disse 3D og in vivo begrænsninger. Men optogenetiske metoder er baseret på urolige af lysaktiverede plasmamembranionkanaler, der distribueres ved plasmamembranen, hvilket begrænser 3D-rumlige opløsning12 og intracellulære kapaciteter.
Vi har for nylig vist, at silicium nanowires (SiNWs) kan bruges til at udføre intracellulære bioelektriske forhør med submicron rumlig opløsning med forskellige ikke-excitable celler, nemlig hjerte myofibroblaster og oligodendrocytes13. Desuden brugte vi disse SiNWs til at udføre ex-vivo celle specifik forhør i en 3D hjertevæv, at undersøge, hvordan hjerteceller elektrisk par in vivo14. En stor fordel ved denne metode er dens enkelhed; det kræver ingen genetisk modifikation eller voluminøse instrumentering. Mange celler vil spontant internalisere foto-responsive SiNWs uden behov for sonikering eller elektroporation15. Desuden vil de spontant undslippe endosomal indkapsling og danne en problemfri integration med cytosol og intracellulære organeller13,15. Disse celle-SiNWs kompositter, betegnes celle-silicium hybrider, besidder den dynamiske, bløde og alsidige karakter af den oprindelige celle, samt de optoelektriske kapaciteter af SiNWs. Efter hybridisering, cellen-SiNW hybrid kan høstes ved hjælp af standard væv kultur teknikker og anvendes til forskellige anvendelser såsom intracellulære bioelektriske stimulation; undersøgelse af intercellulær bioelektrisk kobling in vitro og for in vivo celle specifik forhør. Som en effektiv stimulering kræver co-lokalisering af høj optisk effekt tætheder og SiNWs, kan man opnå høj rumlig opløsning både i 2D og 3D. I denne protokol beskriver vi i detaljer metoden, samt hvordan resultaterne kan analyseres. Fokus er lagt på den intra- og intercellulære undersøgelse in vitro, men in vivo gennemførelsen af denne metode kan udnyttes direkte til mange andre biologiske scenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For at sikre overholdelse af etiske standarder blev alle dyreprocedurer i forbindelse med isolering af kardiomyocytter fra gnavere først godkendt af University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Derudover blev alle dyreforsøg udført i fuld overensstemmelse med vejledning fra University of Chicago IACUC.
1. Fremstilling af hybrider af cellen-SiNWs
- Isoler primære kardiomyocytter (CMs) ved hjælp af et kommercielt kit i overensstemmelse med producentens retningslinjer.
- Forbered komplet DMEM for primær celle isolation suppleret med 10% varme-inaktiveret føtal kvæg serum, 1% penicillin-streptomycin, og 1% L-glutamin.
- For at isolere myofibroblast (MFs) fra MFs-CMs suspension, pre-plade de isolerede celler på et væv kultur fad (celler isoleret fra 2 hjerter fra trin 1,1. pr 100 mm parabol) for 1 h. Som CMs har brug for en fibronectin eller kollagen behandlet overflade til at overholde, kun MFs vil knytte til væv kultur overflade.
- Aspirere den berigede CMs celle suspension. Disse CMs kan bruges til heterosulære koblingseksperimenter som beskrevet i afsnit 3. Skyl MFs med DMEM at fjerne eventuelle resterende VM'er fra MFs parabol.
- Tilføj frisk kultur medium til GIF'er og give dem mulighed for at formere sig, indtil de er ~ 80% sammenløb (2-4 dage). Skift mediet hver anden dag.
- Når cellerne er klar (80% sammenløb), forberede SiNWs for hybridisering trin nedenfor (trin 1.7).
BEMÆRK: Mange typer af SiNWs kan bruges til dette. I dette eksperiment, SiNWs, der blev dyrket ved kemisk damp deposition (CVD) med en core-shell p-i-n junction konfiguration blev brugt som beskrevet tidligere16. Under CVD vækst, er SiNWs dyrkes på en silicium wafer substrat, og i sidste ende holdes som silicium chips dækket med SiNWs. - Skær en 3 mm x 3 mm chip fra en wafer med CVD dyrket SiNWs ved hjælp af en diamant skriver. Brug skarpe kraftbecer til at håndtere waferen og minimer det overfladeareal, der berøres med krafterne, da dette kan bryde sinws.
- Steriliser chippen ved at skylle den med 70% ethanol og lade ethanolen tørre i 30 minutter under UV-lys i en biosikkerhed laminar flow hætte.
- Overfør chippen til et sterilt mikrocentrifugerør, og skyl overskydende ethanol ved hjælp af komplette kulturmedier.
- Tilsæt 1 ml kulturmedier og soniker chippen i sonikeringsbad i 1-10 min. Medierne bør vende overskyet som SiNWs frigives til medierne.
BEMÆRK: Sonikeringstid og -effekt skal optimeres til forskellige sonikatorer eller forskellige celler, da kortere varigheder og lavere effekter vil give længere sinws. - Tilsæt SiNWs suspension i 5 ml af kultur medier og frø det på 100 mm væv kultur parabol med MFs. Tillad SiNWs at internalisere i 4 timer og skyl den overskydende SiNWs off 5x med medier. Tillad delvist internaliserede SiNWs at fuldføre internaliseringen ved at give dem mulighed for at sidde i yderligere 1 time før brug.
BEMÆRK: Forskellige celletyper kan have brug for forskellige sinws koncentration og / eller internalisering gange. - Kollagenbelægningsopløsningen forberedning ved at fortynde kollagenstrømsopløsningen (3 mg/ml) med steril 20 mM eddikesyre i et forhold på 1:50. Der tilsættes 0,5 ml belægningsopløsning til en 35 mm glasbundsskål, og den kan sidde i 1 time i 37 °C. Opløsningen fjernes og skylles med steril PBS.
- Høst celle-SiNWs hybrider ved at behandle cellerne med 3 ml trypsin i 2 min ved 37 °C. Tilsæt 10 ml kulturmedier, og skyl hybriderne kraftigt ved pipettering. Centrifuge cellerne forsigtigt ved 200 x g i 5 min for at undgå at beskadige cellerne med de internaliserede SiNWs. Fjern overskydende medier, suspendere celler med 1 ml medier og frø dem på kollagen behandlet glas bund parabol.
BEMÆRK: Hybriderne kan sås alene, for at undersøge intracellulær eller intercellulær kobling eller med CMs at undersøge hetero-cellulære kobling in vitro. - Der foretages en endelig verifikation af SiNW-internaliseringen ved mærkning af cellernes cytosol (calcein-AM, 4 μM) og membran (membranmarkør, 2 μM) i 30 minutter ved 37 °C, og cellerne ved hjælp af konfokal mikroskopi skal mærkes. Da SiNWs er meget reflekterende, reflekteret lys kan bruges i stedet for fluorescens at visualisere dem.
2. Udarbejdelse af celler til intra- og intercellulære undersøgelser
- Forbered kollagen belægning løsning som i 1,12
- For intracellulær elektrisk stimulation, kultur hybrider med lav såning tætheder. Brug et standard hemocytometer til at tælle celler fra afsnit 1.11. og frø 50.000 celler på en 35 mm glas bund skål i kultur medier. Ved intercellulære undersøgelser anvendes højere celletætheder (500.000 celler pr. skål). Til intercellulær kobling mellem COM'er og MF'er, samkultur hybrider med frisk isolerede CO'er.
- Tillad celler at vedhæfte natten før du udfører optiske stimulationsforsøg. Ved intercellulære undersøgelser skal cellerne tillade 48 timer ved 37 °C at udtrykke intercellulære mellemrumskryds, før forsøget udføres.
- Der tilsættes 50 μL DMSO til 50 μg DMSO til 50 μg Fluo-4 AM ved fremstilling af calciumfølsomme farvestofbestand (kan opbevares i -20 °C) ved tilsætning af 50 μL DMSO til 50 μg Fluo-4 AM. Farvningsopløsningen klargøringsopløsningen ved at fortynde 1 μL farvestof i 1 ml DMEM.
- Aspirere kulturmediet fra celler og tilsæt 1 ml farvningsopløsning. Lad farvestoffet internalisere i celler i 20-30 min. ved 37 °C. Aspirere farvestoffet og skyl to gange med steril PBS.
- Tilsættes endelig 1 ml forvarmtet fenolrødfri DMEM Media, og intracellulær Fluo-4 kan gennemgå afsetærelse i 30 minutter i 37 °C.
- Overfør celler til mikroskop til billeddannelse og stimulering.
3. Optisk billeddannelse og stimulering
- Forvarm en befugtet mikroincubator til 37 °C og boble luft-CO2 blanding (95:5).
- Brug et mikroskop med en kollimeret laserlinje koblet ind i lysvejen for calciumbilleddannelse og optisk stimulation.
BEMÆRK: Et scanningskonfokalt mikroskop er den mest ligetil løsning på grund af dets punktstimuleringsfunktioner. Men denne procedure kan gøres ved hjælp af enhver standard florescence mikroskop ved at koble en kollimeret laserstråle ind i uendelighed plads af lysvejen ved hjælp af en stråle splitter. Enhver mikroskop mål er designet således, at en collimated laser passeret gennem det vil være fokuseret på en diffraktion begrænset laser spot på brændplanet. Laserbølgelængden skal være tæt på ophidselseslyset, så det vil blive afspejlet af det dichroic spejl og passeret af excitation filter. - Visualiser sinws og bestemme stimulation site ved hjælp af brightfield mikroskopi, transmitteret lys, eller reflekterende lys. Derefter omkonfigurere lysvejen til fluorescenstilstand, samtidig med at stimuleringspunktet bevares på siNW's foruddefinerede placering.
- Valider den optimale stimuleringseffekt og pulslængde for hver SiNW-størrelse og celletype for at minimere fototermiske skader på stimulerede celler. For en typisk stimulationsprotokol udføres en baseline-registrering på 2-10 s af den intracellulære calciumaktivitet. Derefter anvende en enkelt laser puls på 1-10 mW effekt og 1-10 ms varighed (svarende til 30-300 kW/mm2) for at stimulere SiNW, og registrere den resulterende calcium bølge for en anden 2-10 s.
BEMÆRK: Det er vigtigt at optimere den optiske effekt og pulslængde for hver SiNW størrelse og celler. Dette er nødvendigt for at minimere fototermisk skade på de stimulerede celler. - Overfør om nødvendigt de optagede film af den optiske stimulering til yderligere analyse.
4. Videobehandling
- Visualiser ændringer i Fluo-4 fluorescens ved hjælp af "dF over F" makro17 til rådighed for ImageJ18, som beregner ændringen i fluorescens tæller for hver pixel, og normaliserer med den gennemsnitlige værdi af hvile baseline. Konverter outputtet (floating point-format) til 8 bit til videre behandling.
- Betyr dF/F-filmen yderligere ved hjælp af detselektive medianfilter" Fjern outliers ", der er tilgængeligt i ImageJ. Definer parametre for at fjerne pixel, hvor deres værdi er mere end 10 over medianværdien i en radius på 2 pixel, og erstat den pågældende pixelværdi med medianen.
- Beregn det optiske flow i hver ramme via Lucas-Kanade algoritmen, som implementeret i Matlab Computer Vision værktøjskassen. Udgangen af denne funktion var en vektor felt, der indeholder x- og y-komponenter af det optiske flow på hvert punkt i hvert billede (kode er tilgængelig i supplerende fil 1).
BEMÆRK: Det gennemsnitlige optiske flow i en celle , <ν>, svarer til udviklingen af calciumfflux i en celle. Forskellen mellem det optiske flow, Δ<ν>, giver det tidspunkt, hvor calciumsignalering blev aktiveret, ved at identificere, hvor signalet blev maksimeret. Derudover er størrelsen af Δ<ν> ved sit maksimum korreleret med den hastighed, hvormed calciumbølgefronten skrider frem gennem cellen. - Calciumtransmissionens intercellulære hastighed beregnes i henhold til følgende ligning.
vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
hvor tmax,j og tmax,i er aktiveringstidspunktet for henholdsvis cellerne j og i, og rij er afstanden mellem cellernes centroider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metodes evne til at give direkte adgang til den intracellulære cytosol afhænger af siNW's spontane internalisering i cellerne. Selv om SiNWs vil gennemgå spontan internalisering i mange celletyper15, nogle celler, såsom kardiomyocytter og neuroner, skal sinws at blive behandlet for at give deres internalisering19. I denne protokol beskriver vi internaliseringsprocessen for p-i-n SiNWs med en diameter på 200-300 nm og ~1-3 μm langt ind i hjerte-Fs. Figur 1A viser, hvordan SiNWs dukkede op under transmitteret lysmikroskopi. Ved hjælp af standardfase kontrastoptik var sammenløbets celler let synlige. Men, SiNWs var knap synlige, hvilket gør deres steder umuligt at definere. Således brugte vi mørkt feltmikroskopi, hvor kun reflekterende objekter kan ses, og baggrunden er mørk. I denne kontrast kan cellerne imidlertid ikke ses, da de ikke er reflekterende. For at vise placeringen af SiNW i cellerne, overlejrede vi billederne sammen, så den perinuclear arrangement af SiNWs i cellerne er tydelig. Selv om den colocalization af SiNWs og celler er synlige, er det stadig vigtigt at kontrollere, at SiNWs faktisk er internaliseret i cellerne, og ikke hviler på plasmamembranen. Til dette formål brugte vi konfokal mikroskopi (Figur 1B), hvor cytosolen blev plettet med calcein-AM (grøn) og plasmamembranen med en membranmarkør (rød). Den intracellulære placering af SiNWs var derefter indlysende. Bemærk, at dette trin er yderst vigtigt for at kontrollere den intracellulære placering af SiNWs, især når en ny celletype (eller linje) anvendes. Men efter internaliseringen er etableret for de farvede celler, bør andre prøver anvendes til stimuleringsproceduren. Selv om det ikke er omfattet af denne demonstration, er det også vigtigt at nævne, at i tilfælde, hvor SNWs ikke er internaliseret, kan bioelektriske processer stadig undersøges på en lignende, ekstracellulær måde16. Efter cellerne er hybridiseret med SiNWs, de kan bruges til at udføre bioelektriske undersøgelser.
Her demonstrerer vi brugen af denne metode til at sammenligne den homocellulære MF-MF elektriske kobling med heterosululære kobling af MF'er til CMs. Efter cellerne blev hybridiseret med SiNWs, hybriderne blev seedet med CMs og kulturperler. Det er vigtigt at begrænse kulturtiden, så de voksende GIF'er ikke overbefolker kulturen. Figur 2 viser et repræsentativt eksempel på et sådant eksperiment. Co-dyrkede celler var fyldt med calcium følsomt farvestof (Fluo-4), og cellerne blev afbildet under en roterende disk konfokal mikroskop. Før du anvender nogen laser puls, en brightfield billede blev opnået for at identificere placeringen af en SiNW, der vil blive stimuleret. Derefter blev der optaget en kort baseline video, så de spontant slå-CMs og de hvilende MF'er kan identificeres (Supplerende Video 1 og Supplerende Video 2). I dette eksperiment blev den identificerede SiNW stimuleret med en enkelt punktslaserpuls (640 nm, 1 ms, 4 mW). Cellerne blev konstant afbildet før og efter stimuleringen for at visualisere calciumdynamikken ved optisk stimulation. Da celler i kulturen er meget forskellige i deres lysstyrke (Supplerende Video 1), blev livevideoerne behandlet i dF/F-videoer med blå til rød pseudofarve (supplerende video 2), så calciumsignalerne bliver klarere. I denne metode sammenlignes hver pixel med sin egen hviletilstand, før stimuleringen blev anvendt. De repræsentative billeder i figur 2C viser calciumformeringen inden for MFs-COM'ernes co-kultur og kan analyseres yderligere for at studere den intercellulære elektriske kobling mellem de forskellige celler samt den intracellulære calciumdynamik.
Figur 3A viser en måde at repræsentere calciumffluksen af hele synsfeltet i et enkelt billede. Ved at analysere dF/ F-videoerne viser vi det tidspunkt, hvor de forskellige celler var begejstrede, hvilket blev bestemt af det punkt, hvor ændringen i det gennemsnitlige optiske flow når sit maksimum. På denne måde kan man se, hvordan calciumflux formeret fra celle til celle. Et specialbygget MATLAB-script (supplerende fil 1) blev skrevet og brugt til at beregne det optiske flow og til at hjælpe med at identificere aktiveringstidspunktet i hvert celleområde (figur 3B). Den intercellulære formeringshastighed kan derefter bestemmes ved at måle afstanden mellem centroiderne i hver celle og dividere med tidsforskellen i deres aktivering. Der kan foretages en lignende analyse, der erstatter afstanden med antallet af vejkryds. til vores formål, afstanden metriske mere trofast præsenterer transmissionshastigheden, da det også tegner sig for den tid, der bruges i intra-cellulære formering, som er ikke-ubetydelig. Figur 3C viser, hvordan de intracellulære hastigheder blev bestemt: For hver celle blev der trukket en linje i calciumsformationens retning, og der blev genereret en kymografi ved at afbilde intensitetstidsprofilen langs denne linje. Vi monterer en linje til forsiden af aktiveringsbølgen i kymograph, således at hældningen af linjen repræsenterede den modsatte af den intracellulære formeringshastighed. Figur 3D opsummerer de forskellige hastigheder (inter- og intracellulære) for de forskellige celler i samkulturen. Alle de data, der er repræsenteret i denne graf, stammer fra den enkelte video af et enkelt repræsentativt synsfelt, der blev præsenteret her.
Figur 1: SiNWs internaliseret i MFs. (A) Fase kontrast billede af MFs behandlet med SiNWs viser sammenløbet celler (venstre). Darkfield billede viser SiNWs spredt i synsfeltet (i midten), mens overlejring af de to billeder (til højre) viser perinuclear arrangement af SiNWs inden for MFs. Skalastænger er 20 μm.(B) Repræsentativt konfokalt billede (venstre, skalabjælken er 10 μm) og 3 forskellige n-z tværsnit, der svarer til de 3 stiplede linjer (højre, Skalastænger er 5 μm) viser den indre del af en MF og SiNW, der er klart inde i cytosol. Cytosolen er grøn (Calcein-AM), membranen rød (cellemaske), og SiNWs hvid (refleksion). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Calcium formering i MF-CM co-kultur. (A) Illustration af et typisk stimulationsforsøg. MFs med internaliserede SiNWs stimuleres med en laserpuls, mens calciumffluksen overvåges af et calciumfølsomt farvestof. (B)Et lyst feltbillede af cellerne viser den internaliserede SiNW inde i en af MF'erne (til venstre) og et repræsentativt fluorescensbillede af calciumfarven (højre). Den stimulerede SiNW er fremhævet af en lyserød pilespids. (C)En co-kultur af MFs og COMs blev fyldt med calcium følsomme farvestof og en SiNW blev stimuleret med en laser puls (640 nm, 1 ms, 4 mW). Calciumstrømmen blev overvåget af Fluo-4 intensiteten (topbilleder), og en dF/F-video blev afledt af den (nederste billeder). DF/F-algoritmen gør visualiseringen af calciumflux klarere, da den sammenligner intensiteten af hver pixel med sin egen baseline, hvilket viser ændringen og ikke den faktiske intensitet. Skalabarer er 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse pf dF/F-videoerne fra figur 2. (A) calcium formering kan visualiseres via en optisk kortlægning billede, hvor farven koder for tid pixel var ophidset (hvilket betyder stigning i calcium koncentration og Fluo-4 relativ intensitet). Den optiske kortlægning kan gøres for forskellige tidsrammer, dvs korte (1,1 s, top billede) eller længere (5,5 s, nederste billede) varigheder. Skalastænger er 20 μm. (B) Repræsentative eksempler til beregning af cellecelletransmissionshastighed. Begge celler er MF'er her, men den samme beregning kan udføres med MF-CM transmission. Graferne viser sporene for det gennemsnitlige optiske flow (i midten) og differentialet (nederst) for hver celle. Cellecelletransmissionen kan derefter beregnes ved hjælp afT-max for begge celler samt deres centroider, som beskrevet i teksten. Røde stjerner betegner to CMs med begrænset MF-CM kobling og dermed manglende reaktion på optisk stimulation. Skalastængerne er 20 μm. (C) MF'ernes intracellulære calciumfluxhastighed stammer fra hældningen af en kymograph genereret ved udskæring af de farvede linjer. Kymographs repræsenterer intensitet langs linjen (x akse) og tid (y akse), således at stejlere skråninger svarer til højere hastigheder. Skalabarer er 20 μm.(D)MFs-MFs og MFs-CMs inter-cellular hastigheder, samt MFs 'intra-cellulære hastigheder kan udledes af B og C henholdsvis og afbildet til sammenligning (p-værdi<0.0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video 1: Effekten af MF-SiNW hybrid optisk stimulation af Fluo-4. CMs-hastigheden illustreres før og efter stimuleringen til sammenligning. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Supplerende Video 2: Effekten af MF-SiNW hybrid optisk stimulation af dF / F video, der stammer fra Fluo-4 videoer. CMs-hastigheden illustreres før og efter stimuleringen til sammenligning. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Supplerende figur Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist her en enkel måde at udføre intracellulær elektrisk stimulation af celler. I denne demonstration brugte vi MFs, der blev prehybridized med SiNWs, derefter co-kulturperler med CMs. Generelt har de fleste prolifererende celler tendens til at internalisere SiNWs, som tillader brug af denne metode med mange andre celletyper. Desuden, mens vi demonstrerede den intracellulære stimulation af celler, de samme principper kan bruges til at udføre ekstracellulær stimulation af celler. Dette kan gøres ved at blokere endosomal kaskader15 af celler, der spontant vil internalisere dem, eller ved hjælp af celler, der ikke internalisere SiNWs. For eksempel, selv om CMs blev anset for at internalisere nogle nanostrukturer20,21, de ikke spontant internalisere SiNWs15. De SiNWs anvendes her blev syntetiseret ved hjælp af en kemisk damp deposition (CVD) apparat. Der henvises til yderligere ressourcer vedrørende den detaljerede procedure for sinws syntese, som kan findes andetsteds16. Efter at have fået SiNWs, deres håndtering og brug er enkle, og kræver ikke nogen sofistikeret eller dyrt udstyr, der ikke er let tilgængelige i en standard bio-medicinsk lab. Den SiNWs kan nemt ses ved hjælp af standard darkfield mikroskopi (Figur 1), hvilket gør det nemt for brugeren at følge internaliseringsprocessen og bestemme den relevante SINW koncentration og behandling varighed, der er nødvendig for en vellykket internalisering. Det anbefales også stærkt at bestemme den nøjagtige endelige placering af SiNWs efter internalisering trin er færdig. Dette kan gøres ved kommercielt tilgængelige farvestoffer, der anvendes til levende døde analyser (såsom Calcein-AM, der anvendes her) og konfokal mikroskopi (Figur 1B). Dette trin er vigtigt, når en anden linje af celler bruges for første gang, og cellen-SiNW interaktion er uklar. Forskellige celler kan internalisere SiNW under forskellige forhold, dvs. Men efter internaliseringsprocessen er karakteriseret for en given celle, kan denne verifikationsprocedure springes over, mens der udføres mekanistiske bio-elektriske undersøgelser.
Efter cellerne er hybridiseret med SiNWs, de kan høstes ved standard væv kultur teknikker og anvendes til bioelektriske undersøgelser. I denne protokol brugte vi MFs-SiNWs hybrider til at undersøge, hvordan MF'er elektrisk par til andre MFs, eller til CMs in vitro. Men, Det er vigtigt at bemærke, at denne procedure kan bruges til at udføre in vivo assays samt. For eksempel, i en tidligere undersøgelse fra vores laboratorium vi brugte denne metode til at undersøge, hvordan MFs elektrisk par til VM in vivo og sammenligne det med deres kobling in vitro14. Da denne proces kræver nogle mere tekniske kapaciteter, er det ikke beskrevet i denne protokol, men detaljerne kan findes i vores tidligere undersøgelse. Her viser vi, hvordan hybridcellerne kan bruges til at lære, hvordan calcium formerer sig intra- og intercellulært inden for samkulturen (Figur 2A). For at starte eksperimentet bestemmes placeringen af en SiNW for punktstimulering. Selv om SiNWs er knap synlige ved hjælp af fase kontrast, er det vigtigt at nævne, at standard brightfield (uden fase eller darkfield kontrast) vil også give deres visualisering (Figur 2B), uden behov for fluorescerende mærkning eller specialiserede mikroskopiteknikker. Efter at have identificeret en SiNW af interesse, kan man anvende en optisk puls til elektrisk stimulere cellen. Før stimulering anvendes, baseline registrering af cellerne viser spontan elektrisk aktivitet i fire forskellige grupper af PM'er, som synes at være unsynkroniseret i deres elektriske aktivitet (Supplerende video 1 Og Supplerende video 2). Desuden kan der ses 8 forskellige MF'er uden spontan elektrisk aktivitet. Repræsentative calciumfarve- og dF/F-billeder viser udbredelsen af calcium i hele kulturen ved optisk stimulering (Figur 2COg Supplerende video 1 Og Supplerende video 2). Disse live videoer kan analyseres yderligere for at lære den elektriske kobling af de forskellige celler i synsfeltet (Figur 3). For det første optisk kortlægning af videoen (Figur 3A) viser rækkefølgen af celler, der stimuleres af den optiske puls. Tidsbjælkerne til højre er i forhold til første ramme efter den optiske stimulation blev anvendt. Da KLIMA'ernes reaktion på stimuleringen er meget hurtigere end FOR MF'erne, udførte vi den optiske kortlægning to gange med forskellige tidsrammer. Den første blev udført for at vise den hurtige CMs svar, således at farveområdet dækker 1,1 s efter stimulation. Dette viser den rækkefølge, hvori de forskellige VM'er og de første MF'er er begejstrede for stimuleringen. Men da der er MFs, der er længere nede ad formeringsstien, vises deres excitation timing ikke i denne kortlægning. Den samme analyse blev således udført i længere tid, hvilket giver færre oplysninger om det oprindelige svar, men klart viser den mellemliggende tid og langsommere reaktion af DE'er, der er nedstrøms fra excitationsstedet. Ved hjælp af vores specialbyggede algoritme var vi i stand til at give en reproducerbar kvantitativ analyse af den maksimale calciumflux timing, som vi brugte som reference, sammen med cellens afstand fra stimulering, for at bestemme den intercellulære formeringshastighed til denne celle. Dette blev udført på både CM'er og MF'er, således at den klare forskel mellem den passive (MF-MF) og forstærket (MF-CM) formering kan måles. Desuden kan det tydeligt påvises, at den elektriske aktivitet af to CMs (røde stjerner i Figur 3B) påvirkes ikke af den optiske stimulering. Dette kan tilskrives det faktum, at ikke alle celler er lige koblet til en anden inden for kulturen. Denne teknik gør det muligt for brugeren at identificere, hvilke celler i synsfeltet der rent faktisk er koblet til den stimulerede celle, og hvilke der ikke er. Derudover var vi i stand til at bestemme overførselsretningen i hver celle og indstille en parallel linje, der blev brugt til at udlede en kymograph, der beskriver overgrænsning i den pågældende celle. Dette blev anvendt til at bestemme den intracellulære calciumfflukshastighed i henhold til kymografiens hældning (Figur 3C). Da alle intra- og intercellulære hastigheder blev kompileret, stod det klart, at KLIMA'ernes respons var betydeligt hurtigere end mf'ernes reaktion på den optiske stimulation. Samtidig blev det konstateret, at MF'ernes intracellulære hastigheder var lidt hurtigere, men kan sammenlignes med MF-MF intercellulære formeringshastigheder. Denne observation tyder på, at i modsætning til den forstærkede elektriske kobling mellem MF'er til VM'er, den intercellulære elektriske kobling mellem MF'er er passiv, og baseret på diffusion af calcium gennem det intracellulære volumen, og derefter intercellulære gap-kryds22,23 eller tunneling nanorør24, fungerer som en flaskehals, der bremser formeringshastigheden. SiNWs evne til at transduce den optiske stimulation til en bioelektrisk forhør kan tilskrives den fotoanodiciske og fotokatodiske reaktion ved p-n krydset af SiNWs, eller til den fototermiske reaktion på grund af den lave varmekapacitet af SiNWs13. Selv om andre nanoskalapartikler kan transduce optisk stimulation25, er de normalt indkapslet i en endosomal konvolut26, hvilket begrænser deres evne til at kommunikere direkte med intracellulære organeller til lokal forhør. Det er vigtigt at indse, at den høje optiske tæthed af stimulation kan resultere i cellulære skader på grund af den fototermiske effekt. Således er det vigtigt at optimere magt og puls længde, således at en sådan effekt vil blive undgået. For følsomme celler er det dog muligt at undersøge, hvordan calcium spreder sig mellem de andre celler i kulturen, selv om der påføres lokale termiske skader på den stimulerede celle.
Et andet centralt aspekt af denne analysemetode er, at alle data i figur 3D blev indsamlet fra en enkelt video af et enkelt synsfelt inden for denne kultur. Selv om de indsamlede data anvendte et enkelt synsfelt, var de stadig stærke nok til at opnå statistisk signifikans, hvilket viser denne metodologis styrke og effektivitet. At analysere og studere mere delikate og subtile effekter, en meget større datasæt kan nemt genereres ved at stimulere andre celler inden for samme kultur. For et glas bund fad med effektiv diameter på 10 mm, kan man finde mere end 2000 synsfelter til at analysere. Som et simpelt punkt laser stimulation skal indstilles, bør hver stimulation eksperiment tage mindre end 1 min til at udføre. Dette vil gøre det muligt for mange mekanistiske undersøgelser, der skal udføres på en måde, der er utilgængelige ved hjælp af traditionelle teknikker såsom patch-clamp, eller mikroelektrode array med foruddefinerede elektrode positioner. Desuden giver nanoskalastørrelsen af de sinws, der anvendes heri, mulighed for stimulering med ekstremt høj rumlig opløsning. Med hensyn til den tidsmæssige opløsning, vil det blive bestemt af det mikroskop, der anvendes til billeddannelse / simulering. I denne sammenhæng, ved hjælp af billeddannelse vil resultere i lav tidsmæssig opløsning, dette kan forbedres ved hjælp af mere tidsfølsomme elektrofysiologi teknikker, såsom patch klemme eller mikro-elektroder arrays. Selvom SiNWs anses for at være bioabsorberbare på lang sigt, har vi aldrig bemærket nogen mærkbar nedbrydning inden for tidsrammen på op til 7 dage, hvilket vil tillade dets anvendelse for de fleste in vitro-undersøgelser.
Samlet set brugte vi en enkel og ligetil teknik til at udføre en in vitro bio-elektrisk undersøgelse af hjerteceller. Vi viser, hvordan vi kan studere de forskellige måder forskellige celler er koblet til hinanden og beskrev en reproducerbar måde at kvantificere calcium formering og hastighed. Teknikken kan tilpasses andre celletyper, samt til in vivo og ex vivo indstillinger. Det er baseret på standard fluorescens mikroskopi og en koblet laser, der er bredt tilgængelige for standard biomedicinske laboratorier, og der er ikke behov for specialiseret udstyr. Teknikken kan nemt mestres og kan tillade indsamling af store datasæt i minimal tid, i forhold til tilgængelige teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
