Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van silicium nanodraden voor intracellulaire optische bio-modulatie van cellen in een eenvoudige en eenvoudig uit te voeren methode. De techniek is zeer aanpasbaar aan diverse celtypes en kan zowel in vitro als in vivo toepassingen worden gebruikt.
Abstract
Myofibroblasts kunnen siliciumnanodraden (SiNWs) spontaan internaliseren, waardoor ze een aantrekkelijk doelwit zijn voor bio-elektronische toepassingen. Deze cel-silicium hybriden bieden loodloze optische modulatie mogelijkheden met minimale verstoring van normaal celgedrag. De optische mogelijkheden worden verkregen door de fotothermale en foto-elektrische eigenschappen van SiNWs. Deze hybriden kunnen worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en vervolgens worden toegepast op verschillende biologische scenario's. We laten hier zien hoe deze hybriden kunnen worden gebruikt om de elektrische koppeling van hartcellen te bestuderen en te vergelijken hoe myofibroblasts met elkaar koppelen of met cardiomyocyten. Dit proces kan worden bereikt zonder speciale apparatuur buiten een fluorescerende microscoop met gekoppelde laserlijn. Ook getoond is het gebruik van een op maat gemaakte MATLAB routine die het mogelijk maakt de kwantificering van calcium voortplanting binnen en tussen de verschillende cellen in de cultuur. Myofibroblasts blijken een tragere elektrische respons te hebben dan die van cardiomyocyten. Bovendien vertoont de myofibroblast intercellulaire voortplanting iets langzamer, hoewel vergelijkbare snelheden als hun intracellulaire snelheden, wat wijst op passieve voortplanting door gapverbindingen of nanobuisjes. Deze techniek is zeer aanpasbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op andere cellulaire arena's, voor zowel in vitro als in vivo of ex vivo onderzoeken.
Introduction
Alle biologische organismen gebruiken elektriciteit, in de vorm van ionen, om het cellulaire gedrag te reguleren. Celmembranen bevatten verschillende soorten specifieke ionenkanalen waardoor het passieve en actieve transport van ionen mogelijk is. Deze ionen regelen de functies van prikkelbare cellen, zoals neuronale activiteit en skelet- en hartspiercontractiliteit. Bio-elektriciteit speelt echter ook een belangrijke rol in niet-prikkelbare cellen, waarbij veel cellulaire functies worden geregeld, zoals celproliferatie1, neuro-immuniteit2,3,4en stamceldifferentiatie5.
In de afgelopen decennia heeft het gebied van de bio-elektrische sector een toenemende belangstelling getrokken, wat heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van tal van technologieën voor bio-elektronische interfaces. Microelectrode patchpipets zijn de gouden standaard van intracellulaire opname en stimulatie6. In deze methode wordt een glazen pipet getrokken onder specifieke omstandigheden om een scherpe rand te vormen met een poriegrootte van enkele micron. Deze pipet is gevuld met een buffer en de pipet maakt direct contact van de buffer met het intracellulaire volume mogelijk. Dit resulteert in een bio-elektrische interface die extreem hoge signaal-ruisverhoudingen, nauwkeurige controle over cellulaire elektrische activiteit en extreem hoge temporele resolutie oplevert. Hoewel deze methode is een zeer krachtig instrument, die onlangs werd opgeschaald naar een nano-pipet configuratie7, het wordt geassocieerd met een aantal belangrijke technische beperkingen. Het cytosol verdunningseffect 8 ,evenalsmechanische trillingen, beperkt zijn nut tot korte termijn ondervragingen, en het vereist dure gespecialiseerde apparatuur en een hoog niveau van technische vaardigheid. Bovendien beperkt de omvangrijkheid het aantal cellen dat tegelijkertijd kan worden geregistreerd of gestimuleerd, en vanwege de invasieve werking ervan kan het niet opnieuw worden geconfigureerd tijdens een experiment. Om deze beperkingen te overwinnen, werden micro-elektroden arrays ontwikkeld, maar de grootte van de elektroden beperkt de ruimtelijke resolutie en intracellulaire toegang. Nanoelectrode arrays maken intracellulaire opname en stimulatie mogelijk, maar vereisen schurende elektrovissing om toegang te krijgen tot de cytosol9,10. Bovendien zijn al deze methoden substraatgebonden en zijn dus beperkt tot in vitro celculturen, of tot externe oppervlakkige cellen, zonder toegang tot cellen die zich in een 3-dimensionaal (3D) weefsel bevinden.
Optogenetica11 wordt veel gebruikt om deze 3D- en in vivo-beperkingen aan te pakken. Optogenetische methoden zijn echter gebaseerd op de verstoringen van lichtgeactiveerde plasmamembraanionkanalen die op het plasmamembraan worden verdeeld, waardoor de 3D ruimtelijke resolutie12 en intracellulaire vermogens worden beperkt.
We hebben onlangs aangetoond dat silicium nanodraden (SiNWs) kan worden gebruikt om intracellulaire bio-elektrische ondervraging uit te voeren met submicron ruimtelijke resolutie met verschillende niet-excitable cellen, namelijk cardiale myofibroblasten en oligodendrocyten13. Bovendien gebruikten we deze SiNW's om ex-vivo celspecifieke ondervragingen uit te voeren binnen een 3D-hartweefsel, om te onderzoeken hoe hartcellen elektrisch in vivo14koppelen. Een groot voordeel van deze methodologie is de eenvoud; het vereist geen genetische modificatie of omvangrijke instrumentatie. Veel cellen zullen spontaan fotoresponsieve SiNWs internaliseren zonder dat er sonicatie of elektroporatienodig is 15. Bovendien zullen ze spontaan ontsnappen aan de endosomale inkapseling en een naadloze integratie vormen met de cytosol en intracellulaire organellen13,15. Deze cel-SiNWs composieten, genoemd cel-silicium hybriden, bezitten de dynamische, zachte en veelzijdige aard van de oorspronkelijke cel, evenals de optoelectric mogelijkheden van de SiNWs. Na hybridisatie kan de cel-SiNW hybride worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals intracellulaire bio-elektrische stimulatie; het bestuderen van intercellulaire bio-elektrische koppeling in vitro; en voor in vivo celspecifieke ondervraging. Aangezien een effectieve stimulatie co-lokalisatie van hoge optische vermogensdichtheden en SiNWs vereist, kan men een hoge ruimtelijke resolutie bereiken, zowel in 2D als in 3D. In dit protocol beschrijven we in detail de methodologie, evenals hoe de resultaten kunnen worden geanalyseerd. De focus ligt op het intra- en intercellulair onderzoek in vitro, maar de in vivo implementatie van deze methodologie kan direct worden gebruikt voor vele andere biologische scenario's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Om ervoor te zorgen dat de ethische normen worden nageleefd, werden alle dierprocedures met betrekking tot het isoleren van cardiomyocyten uit knaagdierenharten voor het eerst goedgekeurd door de University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Bovendien werden alle dierproeven uitgevoerd in volledige overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Chicago IACUC.
1. Bereiding van cel-SiNWs hybriden
- Isoleer primaire cardiomyocyten (CMs) met behulp van een commerciële kit volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Bereid volledige DMEM voor op primaire celisolatie aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 1% L-glutamine.
- Om myofibroblast (MF's) te isoleren van de MFS-CMs suspensie, pre-plate de geïsoleerde cellen op een weefselkweekschotel (cellen geïsoleerd van 2 harten vanaf stap 1.1. per 100 mm schotel) voor 1 uur. Aangezien CMs een fibronectine of collageen behandeld oppervlak nodig hebben om zich aan te hechten, zullen alleen MF's zich hechten aan het weefselcultuuroppervlak.
- Aspirate de verrijkte CMs cel suspensie. Deze CMs kunnen worden gebruikt voor hetero-cellulaire koppeling experimenten zoals beschreven in sectie 3. Spoel de MF's met DMEM om eventuele resterende CMs uit de MF's schotel te elimineren.
- Voeg verse cultuur medium aan MF's en laat ze vermenigvuldigen totdat ze ~ 80% confluent (2-4 dagen). Verander het medium om de andere dag.
- Wanneer de cellen klaar zijn (80% confluent), bereid SiNWs voor op de hybridisatiestap hieronder (stap 1.7).
LET OP: Hiervoor kunnen veel soorten SiNW's worden gebruikt. In dit experiment werden SiNW's gebruikt die werden gekweekt door chemische dampdepositie (CVD) met een core-shell p-i-n-junction configuratie zoals eerder beschreven16. Tijdens de CVD-groei worden de SiNW's geteeld op een siliciumwafersubstraat en worden ze uiteindelijk bewaard als siliciumchips bedekt met SiNWs. - Snijd een 3 mm x 3 mm chip uit een wafer met CVD gekweekte SiNWs met behulp van een diamant scribe. Gebruik scherpe tangen om de wafer te hanteren en het oppervlak te minimaliseren dat wordt aangeraakt met de tangen, omdat dit de SiNWs kan breken.
- Steriliseer de chip door het te spoelen met 70% ethanol en laat de ethanol te drogen voor 30 min onder UV-licht in een bioveiligheid laminaire stroom kap.
- Breng de chip in een steriele microcentrifuge buis en spoel overtollige ethanol met behulp van complete cultuur media.
- Voeg 1 mL cultuur media en sonicate de chip in sonicatie bad voor 1-10 min. De media moeten worden troebel als SiNWs worden vrijgegeven in de media.
OPMERKING: Sonicatietijd en -vermogen moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende sonicators of verschillende cellen, omdat kortere duur en lagere bevoegdheden langere SiNW's zullen opleveren. - Voeg de SiNWs suspensie toe aan 5 mL cultuurmedia en zet deze op de 100 mm weefselkweekschaal met MF's. Laat de SiNWs 4 uur internaliseren en spoel de overtollige SiNWs 5x af met media. Laat gedeeltelijk geïnternaliseerde SiNWs de internalisatie voltooien door ze nog 1 uur te laten zitten voor gebruik.
OPMERKING: Verschillende celtypen kunnen verschillende SiNWs-concentratie- en/of internalisatietijden nodig hebben. - Bereid collageen coating oplossing door het verdunnen van collageen voorraad oplossing (3 mg/mL) met steriele 20 mM azijnzuur bij een verhouding van 1:50. Voeg 0,5 mL coatingoplossing toe aan een glazen bodemschotel van 35 mm en laat hem 1 uur in 37 °C zitten. Verwijder de oplossing en spoel de schotel af met steriele PBS.
- Oogst de cel-SiNWs hybriden door de cellen te behandelen met 3 mL trypsine gedurende 2 min bij 37 °C. Voeg 10 mL cultuurmedia toe en spoel de hybriden krachtig af door pipetten. Centrifugeer de cellen voorzichtig op 200 x g gedurende 5 minuten om te voorkomen dat de cellen beschadigen met de geïnternaliseerde SiNWs. Verwijder overtollige media, schort cellen op met 1 mL-media en zaai ze op de met collageen behandelde glazen bodemschaal.
OPMERKING: De hybriden kunnen alleen worden gezaaid, om intracellulaire of intercellulaire koppeling te onderzoeken of met CMs om hetero-cellulaire koppeling in vitro te onderzoeken. - Voer een laatste verificatie uit van de sinw-internalisatie door de cytosol (calcein-AM, 4 μM) en membraan (membraanmarkering, 2 μM) gedurende 30 minuten bij 37 °C te labelen en de cel te immeren met behulp van confocale microscopie. Omdat SiNWs sterk reflecterend zijn, kan gereflecteerd licht worden gebruikt in plaats van fluorescentie om ze te visualiseren.
2. Bereiding van cellen voor intra- en intercellulaire onderzoeken
- Bereid collageen coating oplossing zoals in 1.12
- Voor intracellulaire elektrische stimulatie, kweekhybriden met lage zaaidichtheid. Gebruik een standaard hemocytometer om cellen te tellen van sectie 1.11. en zaad 50.000 cellen op een 35 mm glazen bodem schotel in cultuur media. Voor intercellulaire onderzoeken, gebruik maken van hogere celdichtheden (500.000 cellen per schotel). Voor intercellulaire koppeling tussen CMs en MF's, co-cultuur van de hybriden met vers geïsoleerde CMs.
- Laat cellen 's nachts hechten voordat u optische stimulatie-experimenten uitvoert. Voor intercellulair onderzoek moet de cellen 48 uur bij 37 °C intercellulaire hiaatverbindingen uitdrukken voordat het experiment wordt uitgevoerd.
- Bereid calciumgevoelige kleurstofvoorraadoplossing voor (kan in -20 °C worden bewaard) door 50 μL DMSO toe te voegen aan 50 μg Fluo-4 AM. Bereid kleuringsoplossing voor door 1 μL kleurstof in 1 mL DMEM te verdunnen.
- Aspirate de cultuur medium uit cellen en voeg 1 mL van kleuring oplossing. Laat kleurstof 20-30 minuten in cellen internaliseren bij 37 °C. Spoel de kleurstof aan en spoel twee maal met steriele PBS.
- Voeg ten slotte 1 mL voorverwarmde fenolrode vrije DMEM Media toe en laat de intracellulaire Fluo-4 gedurende 30 minuten ontsterificeren in 37 °C.
- Breng cellen naar de microscoop voor beeldvorming en stimulatie.
3. Optische beeldvorming en stimulatie
- Verwarm een bevochtigde microincubator voor tot 37 °C en lucht-CO2 mengsel (95:5).
- Gebruik een microscoop met een collimated laserlijn gekoppeld aan het lichtpad voor calcium beeldvorming en optische stimulatie.
OPMERKING: Een scanning confocale microscoop is de meest eenvoudige optie vanwege de puntstimulatie mogelijkheden. Echter, deze procedure kan worden gedaan met behulp van een standaard florescentie microscoop door het koppelen van een collimated laserstraal in de oneindigheid ruimte van het licht pad met behulp van een bundel splitter. Elke microscoop doelstelling is zo ontworpen dat een collimated laser doorgegeven zal worden gericht op een diffractie beperkte laser plek op het brandpuntsvlak. De lasergolflengte moet dicht bij het excitatielicht zijn, dus het zal worden gereflecteerd door de dichroic spiegel en doorgegeven door het excitatiefilter. - Visualiseer de SiNWs en bepaal de stimulatiesite met behulp van brightfield microscopie, uitgezonden licht of reflecterend licht. Vervolgens u het lichtpad opnieuw configureren naar de fluorescentiemodus, met behoud van het stimulatiepunt op de vooraf gedefinieerde locatie van de SiNW.
- Valideer het optimale stimulatievermogen en de pulslengte voor elk SiNW-formaat en celtype, om fotothermale schade aan gestimuleerde cellen te minimaliseren. Voer voor een typisch stimulatieprotocol een basisregistratie van 2-10 s uit van de intracellulaire calciumactiviteit. Breng vervolgens een enkele laserpuls van 1-10 mW vermogen en 1-10 ms duur (wat overeenkomt met 30-300 kW/mm2)om de SiNW te stimuleren, en neem de resulterende calciumgolf voor nog eens 2-10 s.
OPMERKING: Het is essentieel om de optische kracht en pulslengte voor elke SiNW-grootte en cellen te optimaliseren. Dit is nodig om fotothermale schade aan de gestimuleerde cellen te minimaliseren. - Breng de opgenomen films van de optische stimulatie, indien nodig, voor verdere analyse.
4. Videoverwerking
- Visualiseer veranderingen in fluorescentie fluorescentie met behulp van de "dF over F" macro17 beschikbaar voor ImageJ18, die de verandering in fluorescentie telt voor elke pixel berekent, en normaliseert door de gemiddelde waarde van de rustbasislijn. Converteer de uitvoer (floating point format) naar 8 bits voor verdere verwerking.
- Verwerk de dF/F-film verder met behulp van deselectievemediane filter " Verwijderen " die beschikbaar is in ImageJ. Definieer parameters om pixels te verwijderen waarvan de waarde meer dan 10 boven de mediaanwaarde in een straal van 2 pixels ligt en vervang die pixelwaarde door de mediaan.
- Bereken de optische stroom in elk frame via het Lucas-Kanade algoritme, zoals geïmplementeerd in de Matlab Computer Vision toolbox. De uitvoer van deze functie was een vectorveld met de x- en y-componenten van de optische stroom op elk punt in elke afbeelding (code is beschikbaar in aanvullend bestand 1).
OPMERKING: De gemiddelde optische stroom binnen een cel, <ν>, komt overeen met de ontwikkeling van calciumflux binnen een cel. Het differentieel van de optische stroom, Δ<ν> biedt het tijdstip waarop calciumsignalering werd geactiveerd, door te bepalen waar het signaal werd gemaximaliseerd. Bovendien is de omvang van Δ<ν> maximaal gecorreleerd aan de snelheid waarmee het calciumgolffront door de cel vordert. - Bereken de intercellulaire snelheid van calciumtransmissie volgens de volgende vergelijking.
vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
waar tmax, j en t max, ik zijn de tijden van activering voor cellen j en i, respectievelijk, en r ij is de afstand tussen de centroids van de cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen van deze methode om directe toegang tot de intracellulaire cytosol mogelijk te maken, hangt af van de spontane internalisering van de SiNW in de cellen. Hoewel SiNWs spontane internalisatie zal ondergaan in vele celtypen15, zullen sommige cellen, zoals cardiomyocyten en neuronen, de SiNWs moeten worden behandeld om hun internalisatie19mogelijk te maken. In dit protocol beschrijven we het internalisatieproces van p-i-n SiNWs met een diameter van 200-300 nm en ~1-3 μm lang in cardiale MF's. Figuur 1A laat zien hoe de SiNWs verschenen onder uitgezonden lichtmicroscopie. Met behulp van standaard fase contrast optica, de confluent cellen waren gemakkelijk zichtbaar. Echter, de SiNWs waren nauwelijks zichtbaar, waardoor hun locaties onmogelijk te definiëren. Zo gebruikten we donkere veldmicroscopie, waar alleen reflecterende objecten kunnen worden gezien en de achtergrond donker is. In dit contrast, echter, kunnen de cellen niet worden gezien, aangezien zij niet weerspiegelend zijn. Om de locatie van de SiNW in de cellen weer te geven, hebben we de beelden bij elkaar geplaatst, zodat de perinucleaire opstelling van de SiNWs in de cellen duidelijk is. Hoewel de colocalisatie van de SiNWs en cellen duidelijk is, is het nog steeds belangrijk om te controleren of de SiNWs inderdaad geïnternaliseerd zijn in de cellen en niet op het plasmamembraan rusten. Hiervoor gebruikten we confocale microscopie(figuur 1B),waarbij de cytosol werd bevlekt met calcein-AM (groen) en het plasmamembraan met een membraanmarkering (rood). De intracellulaire locatie van de SiNWs was toen duidelijk. Houd er rekening mee dat deze stap uiterst belangrijk is om de intracellulaire locatie van de SiNWs te verifiëren, vooral wanneer een nieuw celtype (of lijn) wordt gebruikt. Echter, nadat de internalisatie is vastgesteld voor de gekleurde cellen, moeten andere monsters worden gebruikt voor de stimulatieprocedure. Hoewel het niet binnen het toepassingsgebied van deze demonstratie valt, is het ook belangrijk te vermelden dat in gevallen waarin SiNW's niet geïnternaliseerd zijn, bio-elektrische processen nog steeds op een vergelijkbare, extracellulaire manier kunnen worden onderzocht16. Nadat de cellen zijn gehybridiseerd met de SiNWs, kunnen ze worden gebruikt om bio-elektrische studies uit te voeren.
Hier tonen we het gebruik van deze methode om de homo-cellulaire MF-MF elektrische koppeling te vergelijken met de hetero-cellulaire koppeling van MF's aan CMs. Nadat de cellen werden gehybridiseerd met de SiNWs, werden de hybriden gezaaid met CMs en gekweekt. Het is belangrijk om de cultuurtijd te beperken, zodat de zich verspreidende MF's de cultuur niet overbevolken. Figuur 2 toont een representatief voorbeeld van een dergelijk experiment. Co-gekweekte cellen werden geladen met calcium gevoelige kleurstof (Fluo-4) en de cellen werden afgebeeld onder een draaiende schijf confocale microscoop. Voor het toepassen van een laser puls, een brightfield beeld werd verkregen om de locatie van een SiNW die zal worden gestimuleerd te identificeren. Vervolgens werd een korte baseline video opgenomen, zodat de spontaan kloppende CMs en de rustende MF's kunnen worden geïdentificeerd (Aanvullende Video 1 en Aanvullende Video 2). In dit experiment werd de geïdentificeerde SiNW gestimuleerd met een enkele puntlaserpuls (640 nm, 1 ms, 4 mW). De cellen werden voortdurend afgebeeld voor en na de stimulatie om de calciumdynamiek te visualiseren op optische stimulatie. Als cellen in de cultuur sterk verschillen in hun helderheid(Aanvullende Video 1), de live video's werden verwerkt tot dF / F video's met blauw tot rode pseudocolor(Aanvullende Video 2), zodat de calcium signalen duidelijker zal zijn. In deze methode wordt elke pixel vergeleken met zijn eigen rusttoestand voor basislijn, voordat de stimulatie werd toegepast. De representatieve afbeeldingen in figuur 2C tonen de calciumvoortplanting binnen de co-cultuur van de MFS-CMs aan en kunnen verder worden geanalyseerd om de intercellulaire elektrische koppeling tussen de verschillende cellen en de intracellulaire calciumdynamiek te bestuderen.
Figuur 3A toont een manier om de calciumflux van het hele gezichtsveld in één afbeelding weer te geven. Door de dF/F-video's te analyseren, tonen we de tijd waarop de verschillende cellen opgewonden waren, wat werd bepaald door het punt waarop de verandering in de gemiddelde optische stroom zijn maximum bereikt. Op deze manier kan men zien hoe de calciumstroom zich voortplantte van cel naar cel. Een op maat gemaakt MATLAB-script(Aanvullend bestand 1) werd geschreven en gebruikt om de optische stroom te berekenen en om te helpen bij het identificeren van de tijd van activering binnen elke celregio(figuur 3B). De intercellulaire voortplantingssnelheid kan vervolgens worden bepaald door de afstand tussen de centroids van elke cel te meten en te delen door het tijdsverschil in hun activering. Een soortgelijke analyse kan worden uitgevoerd die afstand vervangt door het aantal kruispunten; voor onze doeleinden, de afstand metrische meer getrouw presenteert de transmissiesnelheid als het ook goed is voor de tijd doorgebracht in intra-cellulaire voortplanting, die niet te verwaarlozen. Figuur 3C laat zien hoe de intracellulaire snelheden werden bepaald: voor elke cel werd een lijn getrokken in de richting van calciumpropagië en werd een kymograaf gegenereerd door het intensiteitstijdprofiel langs die lijn uit te stipt. We passen een lijn aan de voorkant van de activeringsgolf in de kymograaf, zodanig dat de helling van de lijn de inverse van de intracellulaire voortplantingssnelheid vertegenwoordigde. Figuur 3D vat de verschillende snelheden (inter- en intra-cellulair) voor de verschillende cellen in de co-cultuur samen. Alle gegevens die in deze grafiek worden weergegeven, zijn afgeleid van de enkele video van één representatief gezichtsveld dat hier werd gepresenteerd.
Figuur 1: SiNWs geïnternaliseerd in MF's. (A) Fase contrastbeeld van MF's behandeld met SiNWs tonen confluent cellen (links). Darkfield beeld toont de SiNWs verspreid in het gezichtsveld (midden), terwijl het superinponeren van de twee beelden (rechts) toont de perinuclear regeling van de SiNWs binnen de MF's. Schaalbalken zijn 20 μm. (B) Representatieve confocale afbeelding (links, Schaalbalk is 10 μm) en 3 verschillende n-z dwarsdoorsnedes die overeenkomen met de 3 stippellijnen (rechts, Schaalbalken zijn 5 μm) tonen het binnenste deel van een MF en de SiNW die duidelijk in de cytosol zitten. De cytosol is groen (Calcein-AM), het membraan rood (celmasker) en de SiNWs wit (reflectie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Calciumvermeerdering in de co-cultuur van MF-CM. (A) Illustratie van een typisch stimulatie-experiment. MF's met geïnternaliseerde SiNW's worden gestimuleerd met een laserpuls, terwijl de calciumflux wordt gecontroleerd door een calciumgevoelige kleurstof. (B) Een helder veldbeeld van de cellen toont de geïnternaliseerde SiNW in een van de MF's (links) en een representatief fluorescentiebeeld van de calciumkleurstof (rechts). De gestimuleerde SiNW wordt gemarkeerd door een roze pijlpunt. (C) Een co-cultuur van MF's en CMs werd geladen met calciumgevoelige kleurstof en een SiNW werd gestimuleerd met een laserpuls (640 nm, 1 ms, 4 mW). De calciumstroom werd gecontroleerd door de Fluo-4 intensiteit (bovenste beelden) en een dF / F video werd afgeleid van het (onderste beelden). Het dF/F-algoritme maakt de visualisatie van de calciumflux duidelijker, omdat het de intensiteit van elke pixel vergelijkt met zijn eigen basislijn, waardoor de verandering wordt weergegeven, en niet de werkelijke intensiteit. Schaalbalken zijn 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Analyse pf de dF/F-video's uit figuur 2. (A) de calcium voortplanting kan worden gevisualiseerd via een optische mapping beeld, waar de kleurcodes voor de tijd van de pixel was opgewonden (wat betekent toename van de calciumconcentratie en Fluo-4 relatieve intensiteit). De optische mapping kan worden gedaan voor verschillende tijdframes, dat wil zeggen korte (1,1 s, bovenste afbeelding) of langere (5,5 s, onderste afbeelding) duur. Schaalbalken zijn 20 μm. (B) Representatieve voorbeelden voor het berekenen van de celceltransmissiesnelheid. Beide cellen zijn MF's hier, maar dezelfde berekening kan worden uitgevoerd met MF-CM transmissie. De grafieken tonen de sporen voor de gemiddelde optische stroom (midden) en het differentieel (onder) voor elke cel. De celceltransmissie kan vervolgens worden berekend met behulp van de Tmax voor zowel cellen als hun centroids, zoals beschreven in de tekst. Rode sterretjes duiden twee CMs aan met beperkte MF-CM koppeling en dus gebrek aan respons op optische stimulatie. Schaalbalken zijn 20 μm. (C) de intracellulaire calciumstroomsnelheid van de MFs werd afgeleid van de helling van een kymograaf gegenereerd door het snijden van de gekleurde lijnen. De kymografen vertegenwoordigen intensiteit langs de lijn (x-as) en tijd (y-as), zodat steilere hellingen overeenkomen met hogere snelheden. Schaalbalken zijn 20 μm. (D) De MFS-MFS en MFS-CMs intercellulaire snelheden, evenals de intracellulaire snelheden van de MF's kunnen worden afgeleid uit respectievelijk B en C en kunnen worden uitgezet voor vergelijking (p-value<0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1: Effect van de MF-SiNW hybride optische stimulatie door Fluo-4. Het CMs-tarief wordt voor en na de stimulatie voor vergelijking geïllustreerd. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende video 2: Effect van de MF-SiNW hybride optische stimulatie door de dF /F video, afgeleid van de Fluo-4 video's. Het CMs-tarief wordt voor en na de stimulatie voor vergelijking geïllustreerd. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende figuur Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben hier een eenvoudige manier aangetoond om intracellulaire elektrische stimulatie van cellen uit te voeren. In deze demonstratie gebruikten we MF's die werden gefhybridiseerd met SiNWs, vervolgens co-gekweekt met CMs. In het algemeen hebben de meeste zich vermenigvuldigende cellen de neiging om SiNWs te internaliseren, waardoor het gebruik van deze methode met vele andere celtypen mogelijk is. Bovendien, terwijl we de intracellulaire stimulatie van cellen hebben aangetoond, kunnen dezelfde principes worden gebruikt om extracellulaire stimulatie van cellen uit te voeren. Dit kan worden gedaan door endosomale cascades15 cellen te blokkeren die ze spontaan internaliseren of door cellen te gebruiken die SiNWs niet internaliseren. Hoewel bijvoorbeeld cms sommige nanostructuren20,21interniseerden , internaliseren ze SiNWs15niet pontanously internaliseren. De SiNW's die hier werden gebruikt werden gesynthetiseerd met behulp van een chemische dampafzetting (CVD) apparaat. Raadpleeg aanvullende middelen met betrekking tot de gedetailleerde procedure voor sinws synthese, die elders kan worden gevonden16. Na het verkrijgen van SiNWs, hun behandeling en gebruik zijn eenvoudig, en vereisen geen geavanceerde of dure apparatuur die niet direct beschikbaar is in een standaard bio-medisch lab. De SiNWs zijn gemakkelijk te zien met behulp van standaard darkfield microscopie(figuur 1),waardoor het gemakkelijk is voor de gebruiker om het internalisatieproces te volgen en de juiste SINW-concentratie en behandelingsduur te bepalen die nodig is voor een succesvolle internalisatie. Het wordt ook ten zeerste aanbevolen om de exacte uiteindelijke locatie van de SiNWs te bepalen nadat de internalisatiestap is voltooid. Dit kan worden gedaan door commercieel verkrijgde kleurstoffen die worden gebruikt voor levende-dode tests (zoals Calcein-AM, hier gebruikt) en confocale microscopie(figuur 1B). Deze stap is belangrijk wanneer een andere celregel voor het eerst wordt gebruikt en de interactie cel-SiNW onduidelijk is. Verschillende cellen kunnen SiNW internaliseren onder verschillende omstandigheden, d.w.z. tijd, concentratie en grootteverdeling. Echter, nadat het internalisatieproces wordt gekenmerkt voor een bepaalde cel, kan deze verificatieprocedure worden overgeslagen tijdens het uitvoeren van mechanistische bio-elektrische studies.
Nadat de cellen zijn gehybridiseerd met de SiNWs, kunnen ze worden geoogst door standaard weefselkweektechnieken en worden gebruikt voor bio-elektrische onderzoeken. In dit protocol gebruikten we MFS-SiNWs hybriden om te onderzoeken hoe MF's elektrisch koppelen aan andere MF's, of aan CMs in vitro. Het is echter belangrijk op te merken dat deze procedure kan worden gebruikt om in vivo tests ook uit te voeren. Zo gebruikten we in een eerdere studie van ons lab deze methode om te bestuderen hoe MF's in vivo elektrisch koppelen aan CMs en dat te vergelijken met hun koppeling in vitro14. Aangezien dit proces wat meer technische mogelijkheden vereist, wordt het niet beschreven in dit protocol, maar de details zijn te vinden in onze vorige studie. Hier laten we zien hoe de hybride cellen kunnen worden gebruikt om te leren hoe calcium zich intra- en intercellulair voortplant binnen de co-cultuur (Figuur 2A). Om het experiment te beginnen, wordt de locatie van een SiNW bepaald voor puntstimulatie. Hoewel SiNWs nauwelijks zichtbaar zijn met behulp van fasecontrast, is het belangrijk om te vermelden dat standaard brightfield (zonder fase of darkfield contrast) ook hun visualisatie mogelijk maakt (Figuur 2B), zonder dat u fluorescerende etikettering of gespecialiseerde microscopietechnieken nodig heeft. Na het identificeren van een SiNW van belang, kan men een optische puls toepassen om de cel elektrisch te stimuleren. Voordat stimulatie wordt toegepast, toont de basisregistratie van de cellen spontane elektrische activiteit in vier verschillende groepen CMs, die ongesynchroniseerd lijken te zijn in hun elektrische activiteit (Aanvullende video 1 En Aanvullende video 2). Bovendien zijn er 8 verschillende MF's zonder spontane elektrische activiteit te zien. Representatieve calciumkleurstof en dF/F-beelden tonen de voortplanting van calcium in de hele cultuur op optische stimulatie (Figuur 2CEn Aanvullende video 1 En Aanvullende video 2). Deze live video's kunnen verder worden geanalyseerd om de elektrische koppeling van de verschillende cellen op het gebied van weergave te leren (Figuur 3). Ten eerste, optische mapping van de video (Figuur 3A) toont de volgorde van cellen die worden gestimuleerd door de optische puls. De tijdbalken aan de rechterkant zijn relatief ten opzichte van het eerste frame nadat de optische stimulatie is toegepast. Omdat de reactie van de CMs op de stimulatie veel sneller is dan die van de MF's, hebben we de optische mapping twee keer uitgevoerd, met verschillende tijdsframes. De eerste werd uitgevoerd om de snelle CMs-respons weer te geven, zodat het kleurbereik 1,1 s beslaat na de stimulatie. Dit toont de volgorde waarin de verschillende CMs en de eerste MF's enthousiast zijn over de stimulatie. Aangezien er echter MF's zijn die verder stroomafwaarts van het voortplantingspad zijn, wordt hun excitatietiming niet weergegeven in deze toewijzing. Dezelfde analyse werd dus voor een langere duur uitgevoerd, die minder details geeft over de oorspronkelijke respons, maar toont duidelijk de vertragingstijd en de tragere respons aan van MF's die stroomafwaarts van de excitatiesite zijn. Met behulp van ons op maat gemaakte algoritme konden we een reproduceerbare kwantitatieve analyse geven van de maximale calciumfluxtiming, die we als referentie gebruikten, samen met de afstand van de cel tot de stimulatie, om de intercellulaire voortplantingssnelheid naar die cel te bepalen. Dit werd uitgevoerd op zowel de CMs als de MF's, zodat het duidelijke verschil tussen de passieve (MF-MF) en versterkte (MF-CM) voortplanting kan worden gemeten. Bovendien kan duidelijk worden aangetoond dat de elektrische activiteit van twee CMs (rode sterretjes in Figuur 3B) worden niet beïnvloed door de optische stimulatie. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat niet alle cellen gelijk zijn gekoppeld aan een andere binnen de cultuur. Deze techniek stelt de gebruiker in staat om te bepalen welke cellen in het gezichtsveld inderdaad zijn gekoppeld aan de gestimuleerde cel, en welke niet. Bovendien konden we de voortplantingsrichting binnen elke cel bepalen en een parallelle lijn instellen die werd gebruikt om een kymograaf af te leiden die de voortplanting in die cel beschrijft. Dit werd gebruikt om de intracellulaire calciumfluxsnelheid te bepalen, afhankelijk van de helling van de kymograaf (Figuur 3C). Toen alle intra- en intercellulaire snelheden werden samengesteld, was het duidelijk dat de respons van de CMs aanzienlijk sneller was dan die van de reactie van de MF's op de optische stimulatie. Tegelijkertijd bleken de intracellulaire snelheden van de MF's iets sneller te zijn, maar vergelijkbaar met de intercellulaire voortplantingssnelheden van de MF-MF. Deze observatie suggereert dat in tegenstelling tot de versterkte elektrische koppeling tussen MF's naar CMs, de intercellulaire elektrische koppeling tussen de MF's passief is, en gebaseerd op diffusie van calcium door het intracellulaire volume, en vervolgens intercellulaire gap-junctions22,23 of tunneling nanobuisjes24, handelen als een knelpunt dat de voortplantingssnelheid vertraagt. Het vermogen van de SiNWs om de optische stimulatie om te leiden naar een bio-elektrische ondervraging kan worden toegeschreven aan de fotoanodische en fotocathodische reactie op de p-n-verbinding van de SiNWs, of aan de fotothermale reactie als gevolg van de lage warmtecapaciteit van de SiNWs13. Hoewel andere nanoschaaldeeltjes optische stimulatie kunnen25, worden zij gewoonlijk ingekapseld in een endosomale envelop26, het beperken van hun vermogen om rechtstreeks te communiceren met intracellulaire organellen voor lokale ondervraging. Het is belangrijk om te beseffen dat de hoge optische dichtheid van de stimulatie kan leiden tot cellulaire schade als gevolg van het fotothermale effect. Het is dus belangrijk om de kracht en pulslengte te optimaliseren, zodat een dergelijk effect wordt vermeden. Echter, voor gevoelige cellen, is het mogelijk om te bestuderen hoe het calcium zich voortplant tussen de andere cellen in de cultuur, zelfs als lokale thermische schade wordt toegepast op de gestimuleerde cel.
Een ander belangrijk aspect van deze analysemethodologie is dat alle gegevens in figuur 3D zijn verzameld uit één video van één gezichtsveld binnen die cultuur. Ondanks het gebruik van één gezichtsveld waren de verzamelde gegevens nog steeds sterk genoeg om statistische significantie te verkrijgen, wat de sterkte en efficiëntie van deze methodologie aantoont. Om meer delicate en subtiele effecten te analyseren en te bestuderen, kan een veel grotere gegevensset gemakkelijk worden gegenereerd door andere cellen binnen dezelfde cultuur te stimuleren. Voor een glazen bodemschotel met een effectieve diameter van 10 mm, kan men meer dan 2000 gezichtsvelden te analyseren. Aangezien een eenvoudige puntlaserstimulatie moet worden ingesteld, moet elk stimulatie-experiment minder dan 1 minuut in nemen om uit te voeren. Hierdoor kunnen veel mechanistische studies worden uitgevoerd op een manier die ontoegankelijk zijn met behulp van traditionele technieken zoals patch-clamp, of micro-elektroden array met vooraf gedefinieerde elektrode posities. Bovendien zorgt de nano-schaalgrootte van de Hierin gebruikte SiNWs voor stimulatie met een extreem hoge ruimtelijke resolutie. Wat betreft de temporele resolutie, zal het worden bepaald door de microscoop die wordt gebruikt voor de beeldvorming / simulatie. In deze context zal het gebruik van beeldvorming resulteren in een lage temporele resolutie, dit kan worden verbeterd door gebruik te maken van meer tijdgevoelige elektrofysiologietechnieken, zoals patchklem of micro-elektrodenarrays. Hoewel SiNWs worden beschouwd als bioabsorbeerbaar op de lange termijn, hebben we nooit gemerkt een merkbare afbraak binnen het tijdsbestek van maximaal 7 dagen, die het gebruik ervan voor de meeste in vitro studies zal toestaan.
Over het algemeen gebruikten we een eenvoudige en rechttoe rechtaan techniek om een in vitro bio-elektrisch onderzoek van hartcellen uit te voeren. We laten zien hoe we de verschillende manier waarop verschillende cellen aan elkaar gekoppeld zijn kunnen bestuderen en beschreven een reproduceerbare manier om calciumpropagiering en -snelheid te kwantificeren. De techniek is aanpasbaar aan andere celtypen, evenals aan in vivo en ex vivo instellingen. Het is gebaseerd op standaard fluorescentie microscopie en een gekoppelde laser die in grote lijnen beschikbaar zijn voor standaard biomedische laboratoria, en er is geen behoefte aan gespecialiseerde apparatuur. De techniek kan eenvoudig onder de knie worden en kan het verzamelen van grote datasets in minimale tijd mogelijk maken, in vergelijking met beschikbare technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
