Summary
Questo protocollo descrive l'uso di nanofili di silicio per la biomodulazione ottica intracellulare delle cellule in un metodo semplice e facile da eseguire. La tecnica è altamente adattabile a diversi tipi di cellule e può essere utilizzata sia per applicazioni in vitro che in vivo.
Abstract
I miofibroblasti possono interiorizzare spontaneamente i nanofili di silicio (SiNWs), rendendoli un bersaglio attraente per le applicazioni bioelettroniche. Questi ibridi cell-silicon offrono capacità di modulazione ottica senza piombo con una perturbazione minima rispetto al normale comportamento cellulare. Le capacità ottiche sono ottenute dalle proprietà fototermiche e fotoelettriche dei SiNW. Questi ibridi possono essere raccolti utilizzando tecniche standard di coltura tissutale e quindi applicati a diversi scenari biologici. Dimostriamo qui come questi ibridi possono essere usati per studiare l'accoppiamento elettrico delle cellule cardiache e confrontare come i miofibroblasti si accoppiano tra loro o con i cardiomiociti. Questo processo può essere realizzato senza apparecchiature speciali oltre un microscopio fluorescente con linea laser accoppiata. È inoltre mostrato l'uso di una routine MATLAB personalizzata che consente la quantificazione della propagazione del calcio all'interno e tra le diverse cellule nella coltura. I miofibroblasti hanno una risposta elettrica più lenta di quella dei cardiomiociti. Inoltre, la propagazione intercellulare del miofibroblasto mostra velocità leggermente più lente, anche se paragonabili alle loro velocità intracellulari, suggerendo la propagazione passiva attraverso giunzioni gap o nanotubi. Questa tecnica è altamente adattabile e può essere facilmente applicata ad altre arene cellulari, sia per indagini in vitro che in vivo o ex vivo.
Introduction
Tutti gli organismi biologici usano l'elettricità, sotto forma di ioni, per regolare il comportamento cellulare. Le membrane cellulari contengono vari tipi di canali ionici specifici che consentono il trasporto passivo e attivo degli ioni. Questi ioni governano le funzioni delle cellule eccitabili, come l'attività neuronale e la contrattilità muscolare scheletrica e cardiaca. Tuttavia, la bioelettricità svolge anche un ruolo importante nelle cellule non eccitabili, governando molte funzioni cellulari come la proliferazionecellulare 1,la neuroimmunità2,3,4e la differenziazione delle cellule staminali5.
Negli ultimi decenni, il campo della bioelettricità ha attirato un crescente livello di interesse, che ha contribuito allo sviluppo di numerose tecnologie per le interfacce bioelettroniche. Le pipette patch microelettrode sono il gold standard della registrazione intracellulare e dellastimolazione 6. In questa metodologia, una pipetta di vetro viene tirata in condizioni specifiche per formare un bordo affilato con una dimensione dei pori di pochi micron. Questa pipetta viene riempita con un tampone e la pipetta consente il contatto diretto del buffer con il volume intracellulare. Ciò si traduce in un'interfaccia bioelettrica che produce rapporti segnale/rumore estremamente elevati, un controllo preciso sull'attività elettrica cellulare e una risoluzione temporale estremamente elevata. Sebbene questa metodologia sia uno strumento estremamente potente, che è stato recentemente ridimensionato in una configurazione nano-pipetta7, è associato a diverse importanti limitazioni tecniche. L'effetto di diluizione del citosolo 8 , così come le vibrazioni meccaniche, limita la sua utilità agli interrogatori a breve termine e richiede costoseattrezzaturespecializzate e un alto livello di abilità tecnica. Inoltre, la sua ingombrantità limita il numero di cellule che possono essere registrate o stimolate contemporaneamente e, a causa della sua invasività, non può essere riconfigurata durante un esperimento. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati array di microelettrodi, ma la dimensione degli elettrodi limita la risoluzione spaziale e l'accesso intracellulare. Gli array di nanoelettrodi consentono la registrazione e la stimolazione intracellulare, ma richiedono l'elettroporazione abrasiva per accedere al citosol9,10. Inoltre, tutte queste metodologie sono legate al substrato e sono quindi limitate a colture cellulari in vitro, o a cellule superficiali esterne, senza accesso a cellule che si trovano all'interno di un tessuto tridimensionale (3D).
L'optogenetica11 è ampiamente utilizzata per affrontare queste limitazioni 3D e in vivo. Tuttavia, i metodi optogenetici si basano sulle perturbazioni dei canali ionici a membrana plasmatica attivati dalla luce che sono distribuiti alla membrana plasmatica, limitando la risoluzione spaziale3D 12 e le capacità intracellulari.
Recentemente abbiamo dimostrato che i nanofili di silicio (SiNW) possono essere utilizzati per eseguire interrogatori bioelettrici intracellulari con risoluzione spaziale submicrona con diverse cellule non eccitabili, vale a dire miofibroblasti cardiaci e oligodendrociti13. Inoltre, abbiamo utilizzato questi SiNW per eseguire un interrogatorio specifico per cellule ex-vivo all'interno di un tessuto cardiaco 3D, per indagare come le cellule cardiache si accoppiano elettricamente in vivo14. Uno dei principali vantaggi di questa metodologia è la sua semplicità; non richiede alcuna modificazione genetica o strumentazione ingombrante. Molte cellule interiorizzeranno spontaneamente i SiNW foto-reattivi senza bisogno di sonicazione o elettroporazione15. Inoltre, sfuggiranno spontaneamente all'incapsulamento endosomico e formeranno una perfetta integrazione con il citosol e gli organelli intracellulari13,15. Questi compositi cell-SiNWs, definiti ibridi cell-silicon, possiedono la natura dinamica, morbida e versatile della cella originale, così come le capacità optoelettriche dei SiNW. Dopo l'ibridazione, l'ibrido cellula-SiNW può essere raccolto utilizzando tecniche standard di coltura tissutale e utilizzato per varie applicazioni come la stimolazione bioelettrica intracellulare; studiare l'accoppiamento bioelettrico intercellulare in vitro; e per l'interrogatorio specifico della cellula in vivo. Poiché una stimolazione efficace richiede la co-localizzazione di densità di potenza ottiche elevate e SiNW, si può ottenere un'alta risoluzione spaziale sia in 2D che in 3D. In questo protocollo descriviamo in dettaglio la metodologia, così come come i risultati possono essere analizzati. L'attenzione è rivolta all'indagine intra- e intercellulare in vitro, ma l'implementazione in vivo di questa metodologia può essere utilizzata direttamente per molti altri scenari biologici.
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Protocol
Per garantire il rispetto degli standard etici, tutte le procedure animali relative all'isolamento dei cardiomiociti dai cuori dei roditori sono state approvate per la prima volta dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Chicago. Inoltre, tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in completa conformità con le indicazioni dell'Università di Chicago IACUC.
1. Preparazione di ibridi cell-SiNWs
- Isolare i cardiomiociti primari (MIC) utilizzando un kit commerciale seguendo le linee guida del produttore.
- Preparare dmem completo per l'isolamento delle cellule primarie integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore, l'1% di penicillina-streptomicina e l'1% di L-glutammina.
- Per isolare il miofibroblasto (IF) dalla sospensione MFs-CMs, pre-placcare le cellule isolate su un piatto di coltura tissutale (cellule isolate da 2 cuori dal passo 1.1. per piatto da 100 mm) per 1 h. Poiché le macchine virtuali necessitano di una fibronectina o di una superficie trattata con collagene per aderire, solo le IF si attaccheranno alla superficie di coltura tissutale.
- Aspirare la sospensione cellulare delle macchine virtuali arricchite. Queste macchine virtuali possono essere utilizzate per esperimenti di accoppiamento eterocellulare come descritto nella sezione 3. Risciacquare i file MFs con DMEM per eliminare eventuali macchine virtuali rimanenti dal piatto delle IF.
- Aggiungi un mezzo di coltura fresco alle IF e consenti loro di proliferare fino a quando non sono ~80% confluenti (2-4 giorni). Cambia il mezzo a giorni nostri.
- Quando le celle sono pronte (80% confluenti), preparare i SiNW per il passaggio di ibridazione riportato di seguito (passaggio 1.7).
NOTA: molti tipi di SiNW possono essere utilizzati per questo. In questo esperimento, i SiNW coltivati mediante deposizione chimica di vapore (CVD) con una configurazione di giunzione p-i-n del guscio centrale sono stati utilizzati come descrittoin precedenza 16. Durante la crescita del CVD, i SiNW vengono coltivati su un substrato di wafer di silicio e vengono infine conservati come chip di silicio coperti da SiNW. - Tagliare un chip da 3 mm x 3 mm da un wafer con SiNW coltivati in CVD utilizzando uno scriba di diamanti. Utilizzare forcep affilati per gestire il wafer e ridurre al minimo l'area di superficie toccata con le forcep, in quanto ciò potrebbe rompere i SiNW.
- Sterilizzare il truciolo risciacquarlo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare l'etanolo per 30 minuti sotto la luce UV in una cappa a flusso laminare biosicurezza.
- Trasferire il chip in un tubo di microcentrifugo sterile e risciacquare l'etanolo in eccesso utilizzando mezzi di coltura completi.
- Aggiungere 1 mL di mezzi di coltura e sonicare il chip in bagno di sonicazione per 1-10 minuti. I supporti dovrebbero diventare nuvolosi man mano che i SiNW vengono rilasciati nei supporti.
NOTA: il tempo e la potenza di sonicazione dovrebbero essere ottimizzati per diversi sonicatori o celle diverse, poiché durate più brevi e potenze inferiori produrranno SiNW più lunghi. - Aggiungere la sospensione SiNWs in 5 mL di mezzi di coltura e seminarla sul piatto di coltura tissutale da 100 mm con MFs. Consentire ai SiNW di internalizzare per 4 ore e risciacquare i SiNW in eccesso da 5x con i supporti. Consentire ai SiNW parzialmente internalizzati di completare l'internalizzazione consentendo loro di sedersi per altre 1 h prima dell'uso.
NOTA: diversi tipi di cellule potrebbero aver bisogno di diversi tempi di concentrazione e/o internalizzazione dei SiNW. - Preparare la soluzione di rivestimento del collagene diluire la soluzione di stock di collagene (3 mg/mL) con acido acetico sterile da 20 mM con un rapporto di 1:50. Aggiungere una soluzione di rivestimento da 0,5 mL a un piatto inferiore in vetro da 35 mm e lasciare riposare per 1 h in 37 °C. Rimuovere la soluzione e sciacquare la piastra con PBS sterile.
- Raccogliere gli ibridi cellule-SiNWs trattando le cellule con 3 mL di tripside per 2 minuti a 37 °C. Aggiungere 10 mL di mezzi di coltura e risciacquare vigorosamente gli ibridi pipettando. Centrifugare delicatamente le cellule a 200 x g per 5 minuti per evitare di danneggiare le cellule con i SiNW internalizzati. Rimuovere i mezzi in eccesso, sospendere le cellule con mezzi da 1 mL e seminarle sul piatto inferiore in vetro trattato con collagene.
NOTA: Gli ibridi possono essere seminati da soli, per indagare l'accoppiamento intracellulare o intercellulare o con LE per indagare l'accoppiamento eterocellulare in vitro. - Eseguire una verifica finale dell'internalizzazione del SiNW etichettando il citosol delle cellule (calceina-AM, 4 μM) e la membrana (marcatore di membrana, 2 μM) per 30 minuti a 37 °C e utilizzando la microscopia confocale. Poiché i SiNW sono altamente riflettenti, la luce riflessa può essere utilizzata al posto della fluorescenza per visualizzarli.
2. Preparazione di cellule per indagini intra e intercellulari
- Preparare la soluzione di rivestimento del collagene come in 1.12
- Per la stimolazione elettrica intracellulare, gli ibridi di coltura con basse densità di semina. Utilizzare un emocitometro standard per contare le cellule della sezione 1.11. e semina 50.000 cellule su un piatto inferiore in vetro da 35 mm nei mezzi di coltura. Per le indagini intercellulari, utilizzare densità cellulari più elevate (500.000 cellule per piatto). Per l'accoppiamento intercellulare tra macchine virtuali eMF, co-coltura degli ibridi con MACCHINE appena isolate.
- Consentire alle cellule di attaccarsi durante la notte prima di eseguire esperimenti di stimolazione ottica. Per le indagini intercellulari, consentire a 48 ore a 37 °C che le cellule esprima le giunzioni intercellulari gap prima che l'esperimento sia condotto.
- Preparare la soluzione di stock di coloranti sensibili al calcio (può essere conservata in -20 °C) aggiungendo 50 μL di DMSO a 50 μg Fluo-4 AM. Preparare la soluzione di colorazione diluendo 1 μL di colorante in 1 mL di DMEM.
- Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule e aggiungere 1 mL di soluzione di colorazione. Lasciare che il colorante si interiorizzi nelle cellule per 20-30 minuti a 37 °C. Aspirare il colorante e risciacquare due volte con PBS sterile.
- Infine, aggiungere 1 mL di DMEM Media senza fenolo-rosso prerifapidto e lasciare che il Fluo-4 intracellulare subisca la deesterificazione per 30 minuti in 37 °C.
- Trasferire le cellule al microscopio per l'imaging e la stimolazione.
3. Imaging ottico e stimolazione
- Preririorre un microincubatore umidificato a 37 °C e una miscela aria bolla-CO2 (95:5).
- Utilizzare un microscopio con una linea laser collimata accoppiata nel percorso della luce per l'imaging del calcio e la stimolazione ottica.
NOTA: Un microscopio confocale a scansione è l'opzione più semplice grazie alle sue capacità di stimolazione puntiforme. Tuttavia, questa procedura può essere eseguita utilizzando qualsiasi microscopio a florescence standard accoppiando un raggio laser collimato nello spazio infinito del percorso della luce usando uno splitter a fascio. Qualsiasi obiettivo del microscopio è progettato in modo che un laser collimato passato attraverso di esso si concentri su un punto laser limitato di diffrazione sul piano focale. La lunghezza d'onda del laser dovrebbe essere vicina alla luce di eccitazione, quindi sarà riflessa dallo specchio dicroico e passata dal filtro di eccitazione. - Visualizza i SiNW e determina il sito di stimolazione utilizzando la microscopia a campo luminoso, la luce trasmessa o la luce riflettente. Quindi, riconfigurare il percorso della luce in modalità fluorescenza, mantenendo il punto di stimolazione nella posizione predefinita del SiNW.
- Convalidare la potenza di stimolazione ottimale e la lunghezza dell'impulso per ogni dimensione e tipo di cella SiNW, per ridurre al minimo i danni fototermici alle cellule stimolate. Per un tipico protocollo di stimolazione, eseguire una registrazione di base di 2-10 s dell'attività del calcio intracellulare. Quindi, applicare un singolo impulso laser di potenza di 1-10 mW e durata di 1-10 ms (corrispondente a 30-300 kW / mm2) per stimolare il SiNW e registrare l'onda di calcio risultante per altri 2-10 s.
NOTA: È essenziale ottimizzare la potenza ottica e la lunghezza dell'impulso per ogni dimensione e celle SiNW. Questo è necessario per ridurre al minimo i danni fototermici alle cellule stimolate. - Trasferire i filmati registrati della stimolazione ottica, se necessario, per ulteriori analisi.
4. Elaborazione video
- Visualizzare le modifiche nella fluorescenza Fluo-4 utilizzando la macro "dF over F"17 disponibile per ImageJ18, che calcola la variazione del numero di fluorescenza per ogni pixel e si normalizza in base al valore medio della linea di base di riposo. Convertire l'output (formato a virgola mobile) in 8 bit per un'ulteriore elaborazione.
- Elaborare ulteriormente il filmato dF/F utilizzando il filtromediano selettivo " Remove outliers" disponibile in ImageJ. Definire i parametri per rimuovere i pixel in cui il loro valore è superiore a 10 al valore mediano in un raggio di 2 pixel e sostituire tale valore in pixel con la mediana.
- Calcola il flusso ottico in ogni fotogramma tramite l'algoritmo Lucas-Kanade, come implementato nella cassetta degli attrezzi Matlab Computer Vision. L'output di questa funzione era un campo vettoriale contenente i componenti x e y del flusso ottico in ogni punto di ogni immagine (il codice è disponibile nel file complementare 1).
NOTA: Il flusso ottico medio all'interno di una cellula, <ν>, corrisponde allo sviluppo del flusso di calcio all'interno di una cellula. Il differenziale del flusso ottico, Δ<ν> fornisce il momento in cui è stata attivata la segnalazione del calcio, identificando dove il segnale è stato massimizzato. Inoltre, la magnitudine di Δ<ν> al suo massimo è correlata alla velocità con cui il fronte dell'onda di calcio progredisce attraverso la cellula. - Calcola la velocità intercellulare della trasmissione del calcio secondo la seguente equazione.
vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
dove tmax,j e tmax,i sono i tempi di attivazione per le cellule j e i, rispettivamente, e r ij è la distanza tra i centroidi delle cellule.
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Representative Results
La capacità di questa metodologia di consentire l'accesso diretto al citosolo intracellulare dipende dall'internalizzazione spontanea del SiNW nelle cellule. Sebbene i SiNW subiranno l'internalizzazione spontanea inmolti tipi di cellule 15, alcune cellule, come cardiomiociti e neuroni, avranno bisogno che i SiNW siano trattati per consentire la loro internalizzazione19. In questo protocollo descriviamo il processo di internalizzazione dei SiNW p-i-n con un diametro di 200-300 nm e ~1-3 μm di lunghezza in MFs cardiaci. La Figura 1A dimostra come i SiNW siano apparsi sotto microscopia a luce trasmessa. Usando l'ottica standard a contrasto di fase, le celle confluenti erano facilmente evidenti. Tuttavia, i SiNW erano appena visibili, rendendo le loro posizioni impossibili da definire. Quindi, abbiamo usato la microscopia a campo scuro, dove solo gli oggetti riflettenti possono essere visti e lo sfondo è scuro. In questo contrasto, tuttavia, le cellule non possono essere viste, in quanto non sono riflettenti. Per mostrare la posizione del SiNW nelle celle, abbiamo sovrapposto le immagini insieme, in modo che la disposizione perinucleare dei SiNW all'interno delle cellule sia evidente. Sebbene la colocalizzazione dei SiNW e delle cellule sia evidente, è comunque importante verificare che i SiNW siano effettivamente internalizzati all'interno delle cellule e non poggiano sulla membrana plasmatica. A tal fine, abbiamo usato la microscopia confocale (Figura 1B), in cui il citosolo era macchiato di calceina-AM (verde) e la membrana plasmatica con un marcatore di membrana (rosso). La posizione intracellulare dei SiNW era quindi evidente. Si noti che questo passaggio è estremamente importante per verificare la posizione intracellulare dei SiNW, specialmente quando viene utilizzato un nuovo tipo di cella (o linea). Tuttavia, dopo che l'internalizzazione è stata stabilita per le celle macchiate, altri campioni devono essere utilizzati per la procedura di stimolazione. Sebbene non rientra nell'ambito di questa dimostrazione, è anche importante ricordare che nei casi in cui i SiNW non sono internalizzati, i processi bioelettrici possono ancora essere esaminati in modo simile ed extracellulare16. Dopo che le cellule sono state ibridate con i SiNW, possono essere utilizzate per eseguire studi bioelettrici.
Qui dimostriamo l'uso di questa metodologia per confrontare l'accoppiamento elettrico MF-MF omocellulare con l'accoppiamento eterocellulare delle IF con le MACCHINE. Dopo che le celle sono state ibridate con i SiNW, gli ibridi sono stati seminati con MACCHINE e coltivati. È importante limitare il tempo di coltura in modo che i FILE proliferano non sovrappopolano la cultura. La figura 2 mostra un esempio rappresentativo di tale esperimento. Le cellule co-coltivate erano cariche di colorante sensibile al calcio (Fluo-4) e le cellule erano immagini al microscopio confocale a disco rotante. Prima di applicare qualsiasi impulso laser, è stata ottenuta un'immagine a campo luminoso per identificare la posizione di un SiNW che verrà stimolato. Successivamente, è stato registrato un breve video di base, in modo da poter identificare le macchine virtuali che battono spontaneamente e le IF a riposo (Video supplementare 1 e Video supplementare 2). In questo esperimento, il SiNW identificato è stato stimolato con un impulso laser a singolo punto (640 nm, 1 ms, 4 mW). Le cellule sono state costantemente immagini prima e dopo la stimolazione per visualizzare la dinamica del calcio sulla stimolazione ottica. Poiché le cellule in coltura differiscono notevolmente nella loro luminosità (Supplementary Video 1), i video in diretta sono stati elaborati in video dF / F con pseudocolore dal blu al rosso (Video supplementare 2), in modo che i segnali di calcio siano più chiari. In questo metodo, ogni pixel viene confrontato con il proprio stato di riposo di base, prima dell'applicazione della stimolazione. Le immagini rappresentative della Figura 2C dimostrano la propagazione del calcio all'interno della co-coltura MFs-CMs e possono essere ulteriormente analizzate per studiare l'accoppiamento elettrico intercellulare tra le diverse cellule, così come la dinamica del calcio intracellulare.
La figura 3A dimostra un modo per rappresentare il flusso di calcio dell'intero campo visivo in una singola immagine. Analizzando i video dF/F, mostriamo il momento in cui le diverse celle erano eccitate, che è stato determinato dal punto in cui il cambiamento nel flusso ottico medio raggiunge il suo massimo. In questo modo, si può vedere come il flusso di calcio si propagava da una cellula all'altra. È stato scritto e utilizzato uno script MATLAB personalizzato (File supplementare 1) per calcolare il flusso ottico e per aiutare a identificare il tempo di attivazione all'interno di ciascuna regione cellulare (Figura 3B). La velocità di propagazione intercellulare può quindi essere determinata misurando la distanza tra i centroidi di ogni cellula e dividendo per la differenza di tempo nella loro attivazione. Un'analisi simile può essere condotta che sostituisce la distanza con il numero di incroci di giunzione; per i nostri scopi, la metrica della distanza presenta più fedelmente la velocità di trasmissione in quanto rappresenta anche il tempo trascorso nella propagazione intracellulare, che non è trascurabile. La figura 3C mostra come sono state determinate le velocità intracellulari: per ogni cellula è stata tracciata una linea nella direzione della propagazione del calcio e un cimografo è stato generato tracciando il profilo del tempo di intensità lungo quella linea. Adattiamo una linea alla parte anteriore dell'onda di attivazione nel kymografo, in modo che la pendenza della linea rappresentasse l'inverso della velocità di propagazione intracellulare. La figura 3D riassume le diverse velocità (inter- e intracellulari) per le diverse cellule nella co-coltura. Tutti i dati rappresentati in questo grafico sono stati ricavati dal singolo video di un singolo campo visivo rappresentativo che è stato presentato qui.
Figura 1: SiNW internalizzati in IF. (A) L'immagine di contrasto di fase degli MF trattati con SiNW mostra celle confluenti (a sinistra). L'immagine di Darkfield mostra i SiNW dispersi nel campo visivo (al centro), mentre sovrapponendo le due immagini (a destra) mostra la disposizione perinucleare dei SiNW all'interno dei MF. Le barre di scala sono 20 μm. (B) Immagine confocale rappresentativa (a sinistra, la barra di scala è 10 μm) e 3 diverse sezioni trasversali n-z che corrispondono alle 3 linee tratteggiate (a destra, le barre di scala sono 5 μm) mostrano la parte interna di un MF e il SiNW che sono chiaramente all'interno del citosol. Il citosolo è verde (Calcein-AM), la membrana rossa (maschera cellulare) e il bianco SiNWs (riflesso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Propagazione del calcio nella cocoltura MF-CM. (A) Illustrazione di un tipico esperimento di stimolazione. I MF con SiNW internizzati vengono stimolati con un impulso laser, mentre il flusso di calcio è monitorato da un colorante sensibile al calcio. (B) Un'immagine di campo luminoso delle cellule mostra il SiNW interiorizzato all'interno di uno dei MF (a sinistra) e un'immagine rappresentativa di fluorescenza del colorante al calcio (a destra). Il SiNW stimolato è evidenziato da una punta di freccia rosa. (C) Una cocoltura di MC e MC è stata caricata con colorante sensibile al calcio e un SiNW è stato stimolato con un impulso laser (640 nm, 1 ms, 4 mW). Il flusso di calcio è stato monitorato dall'intensità Fluo-4 (immagini in alto) e da esso è stato derivato un video dF /F (immagini in basso). L'algoritmo dF/F rende più chiara la visualizzazione del flusso di calcio, in quanto confronta l'intensità di ogni pixel con la propria linea di base, mostrando così il cambiamento e non l'intensità effettiva. Le barre di scala sono di 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi dei video dF/F della figura 2. (A) la propagazione del calcio può essere visualizzata tramite un'immagine di mappatura ottica, in cui i codici colore per il tempo in cui il pixel era eccitato (il che significa aumento della concentrazione di calcio e intensità relativa fluo-4). La mappatura ottica può essere eseguita per diversi periodi di tempo, cioè brevi (1,1 s, immagine superiore) o più lunghi (5,5 s, immagine inferiore). Le barre di scala sono 20 μm. (B) Esempi rappresentativi per il calcolo della velocità di trasmissione cellulare-cella. Entrambe le celle sonoMF qui, ma lo stesso calcolo può essere eseguito con la trasmissione MF-CM. I grafici mostrano le tracce per il flusso ottico medio (al centro) e il differenziale (in basso) per ogni cella. La trasmissione cella-cella può quindi essere calcolata usando il Tmax per entrambe le celle e i loro baricentro, come descritto nel testo. Gli asterischi rossi denotano due MACCHINE con accoppiamento MF-CM limitato e quindi mancanza di risposta alla stimolazione ottica. Le barre di scala sono 20 μm. (C) la velocità del flusso di calcio intracellulare delle IF è stata derivata dalla pendenza di un cimografo generato dall'affezione delle linee colorate. I cimografi rappresentano l'intensità lungo la linea (asse x) e il tempo (asse y), in modo che i pendii più ripidi corrispondano a velocità più elevate. Le barre di scala sono 20 μm. (D) Le velocità intercellulari MFs-MFs e MFs-CMs, così come le velocità intracellulari dei MFs possono essere derivate rispettivamente da B e C e tracciate per il confronto (p-value<0.0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Effetto della stimolazione ottica ibrida MF-SiNW di Fluo-4. Il tasso di MACCHINE viene illustrato prima e dopo la stimolazione per il confronto. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Video supplementare 2: Effetto della stimolazione ottica ibrida MF-SiNW dal video dF/F, derivato dai video Fluo-4. Il tasso di MACCHINE viene illustrato prima e dopo la stimolazione per il confronto. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Figura complementare Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
Abbiamo dimostrato qui un modo semplice per eseguire la stimolazione elettrica intracellulare delle cellule. In questa dimostrazione sono stati utilizzati file MF preibridizzati con SiNW, quindi co-coltivati con le macchine virtuali. In generale, la maggior parte delle cellule prolifere ha la tendenza a internalizzare i SiNW, il che consente l'uso di questa metodologia con molti altri tipi di cellule. Inoltre, mentre abbiamo dimostrato la stimolazione intracellulare delle cellule, gli stessi principi possono essere utilizzati per eseguire la stimolazione extracellulare delle cellule. Questo può essere fatto bloccando le cascate endosomiche15 di cellule che le interiorizzeranno spontaneamente o usando cellule che non interiorizzano i SiNW. Ad esempio, sebbene siano state trovate macchine virtuali per internalizzare alcune nanostrutture20,21, non interiorizzano spontanly SiNWs15. I SiNW qui utilizzati sono stati sintetizzati utilizzando un apparato chimico di deposizione di vapore (CVD). Fare riferimento a risorse aggiuntive relative alla procedura dettagliata per la sintesi sinws, che può essere trovata altrove16. Dopo aver ottenuto i SiNW, la loro manipolazione e utilizzo sono semplici e non richiedono apparecchiature sofisticate o costose che non siano prontamente disponibili in un laboratorio bio-medico standard. I SiNW possono essere facilmente visti utilizzando la microscopia standard a campo scuro (Figura 1), che rende facile per l'utente seguire il processo di internalizzazione e determinare la concentrazione e la durata del trattamento SINW appropriate necessarie per un'internalizzazione riuscita. Si consiglia inoltre vivamente di determinare l'esatta posizione finale dei SiNW al termine della fase di internalizzazione. Ciò può essere fatto mediante coloranti disponibili in commercio utilizzati per saggi morti vivi (come Calcein-AM, usato qui) e microscopia confocale(Figura 1B). Questo passaggio è importante quando viene utilizzata per la prima volta una linea diversa di celle e l'interazione cella-SiNW non è chiara. Celle diverse potrebbero interiorizzare SiNW in condizioni diverse, ad esempio tempo, concentrazione e distribuzione delle dimensioni. Tuttavia, dopo che il processo di internalizzazione è caratterizzato per una determinata cella, questa procedura di verifica può essere saltata durante l'esecuzione di studi bioe elettrici meccanici.
Dopo che le cellule sono state ibridate con i SiNW, possono essere raccolte con tecniche standard di coltura tissutale e utilizzate per indagini bioelettriche. In questo protocollo, abbiamo utilizzato gli ibridi MFs-SiNWs per indagare come le IF si accoppiano elettricamente ad altri IF o alle macchine virtuali in vitro. Tuttavia, è importante notare che questa procedura può essere utilizzata anche per eseguire saggi in vivo. Ad esempio, in uno studio precedente del nostro laboratorio abbiamo usato questa metodologia per studiare come le IF si accoppiano elettricamente alle MACCHINE in vivo e confrontarla con il loro accoppiamento in vitro14. Poiché questo processo richiede alcune funzionalità più tecniche, non è descritto in questo protocollo, ma i dettagli possono essere trovati nel nostro studio precedente. Qui, mostriamo come le cellule ibride possono essere utilizzate per imparare come il calcio si propaga intra- e intercellularmente all'interno della co-coltura (Figura 2A). Per iniziare l'esperimento, la posizione di un SiNW viene determinata per la stimolazione puntile. Sebbene i SiNW siano appena visibili usando il contrasto di fase, è importante menzionare che il campo luminoso standard (senza contrasto di fase o campo scuro) consentirà anche la loro visualizzazione (Figura 2B), senza alcuna necessità di etichettatura fluorescente o tecniche specializzate di microscopia. Dopo aver identificato un SiNW di interesse, si può applicare un impulso ottico per stimolare elettricamente la cellula. Prima dell'applicazione della stimolazione, la registrazione basale delle cellule mostra attività elettrica spontanea in quattro diversi gruppi di MACCHINE, che sembrano non essere sincronizzate nella loro attività elettrica (Video supplementare 1 E Video supplementare 2). Inoltre, si possono vedere 8 diversi MF senza attività elettrica spontanea. Le immagini rappresentative del colorante di calcio e del dF/F mostrano la propagazione del calcio in tutta la coltura dopo la stimolazione ottica (Figura 2CE Video supplementare 1 E Video supplementare 2). Questi video in diretta possono essere ulteriormente analizzati per apprendere l'accoppiamento elettrico delle diverse cellule nel campo visivo (Figura 3). In primo luogo, la mappatura ottica del video (Figura 3A) mostra la sequenza di cellule stimolate dall'impulso ottico. Le barre del tempo a destra sono relative al primo fotogramma dopo l'applicazione della stimolazione ottica. Poiché la risposta delle macchine virtuali alla stimolazione è molto più veloce di quella delle IF, abbiamo eseguito la mappatura ottica due volte, con tempi diversi. Il primo è stato eseguito per mostrare la risposta rapida delle macchine virtuali, in modo che la gamma di colori copra 1,1 s dopo la stimolazione. Questo mostra l'ordine in cui le diverse MACCHINE e i primi MF sono eccitati dalla stimolazione. Tuttavia, poiché ci sono FILE che si trovano più a valle del percorso di propagazione, la loro temporizzazione di eccitazione non viene visualizzata in questo mapping. Pertanto, la stessa analisi è stata eseguita per una durata più lunga, che fornisce meno dettagli sulla risposta iniziale, ma dimostra chiaramente il tempo di ritardo e la risposta più lenta degli MF che si trovano a valle del sito di eccitazione. Utilizzando il nostro algoritmo personalizzato, siamo stati in grado di fornire un'analisi quantitativa riproducibile della massima temporizzazione del flusso di calcio, che abbiamo usato come riferimento, insieme alla distanza della cellula dalla stimolazione, per determinare la velocità di propagazione intercellulare a quella cellula. Questa operazione è stata eseguita sia sulle MACCHINE che sulle IF, in modo da poter misurare la netta differenza tra la propagazione passiva (MF-MF) e amplificata (MF-CM). Inoltre, si può chiaramente dimostrare che l'attività elettrica di due MACCHINE (asterischi rossi in Figura 3B) non sono influenzati dalla stimolazione ottica. Ciò può essere attribuito al fatto che non tutte le cellule sono ugualmente accoppiate a un'altra all'interno della coltura. Questa tecnica consente all'utente di identificare quali cellule nel campo visivo sono effettivamente accoppiate alla cella stimolata e quali no. Inoltre, siamo stati in grado di determinare la direzione di propagazione all'interno di ogni cella e impostare una linea parallela che è stata utilizzata per derivare un kymografo che descrive la propagazione all'interno di quella cella. Questo è stato usato per determinare la velocità del flusso di calcio intracellulare, in base alla pendenza del kymograph (Figura 3C). Quando sono state compilate tutte le velocità intra e intercellulari, era chiaro che la risposta delle macchine virtuali era significativamente più veloce di quella della risposta delle IF alla stimolazione ottica. Contemporaneamente, le velocità intracellulari delle IF sono state trovate leggermente più veloci, ma paragonabili alle velocità di propagazione intercellulare MF-MF. Questa osservazione suggerisce che a differenza dell'accoppiamento elettrico amplificato tra IMF e le MACCHINE, l'accoppiamento elettrico intercellulare tra le IF è passivo, e basato sulla diffusione del calcio attraverso il volume intracellulare, e quindi le giunzioni intercellulari gap22,23 o nanotubi a tunneling24, agendo come un collo di bottiglia che rallenta la velocità di propagazione. La capacità dei SiNW di trasdurre la stimolazione ottica ad un interrogatorio bioelettrico può essere attribuita alla reazione fotoanodica e fotocatodica alla giunzione p-n dei SiNW, o alla reazione fototermica dovuta alla bassa capacità termica dei SiNW13. Sebbene altre particelle su scala nanometrica possano trasdurre la stimolazione ottica25, di solito sono incapsulati in una busta endosomiale26, limitando la loro capacità di interfacciarsi direttamente con gli organelli intracellulari per l'interrogatorio locale. È importante rendersi conto che l'alta densità ottica della stimolazione può causare danni cellulari dovuti all'effetto fototermico. Pertanto, è importante ottimizzare la potenza e la lunghezza dell'impulso in modo da evitare un tale effetto. Tuttavia, per le cellule sensibili, è possibile studiare come il calcio si propaga tra le altre cellule nella coltura, anche se il danno termico locale viene applicato alla cellula stimolata.
Un altro aspetto chiave di questa metodologia di analisi è che tutti i dati mostrati nella figura 3D sono stati raccolti da un singolo video di un singolo campo visivo all'interno di tale cultura. Nonostante utilizzasse un unico campo visivo, i dati raccolti erano ancora abbastanza forti da ottenere un significato statistico, il che dimostra la forza e l'efficienza di questa metodologia. Per analizzare e studiare effetti più delicati e sottili, un set di dati molto più grande può essere facilmente generato stimolando altre cellule all'interno della stessa coltura. Per un piatto inferiore in vetro con diametro effettivo di 10 mm, si possono trovare più di 2000 campi visivo da analizzare. Poiché è necessario impostare una semplice stimolazione laser a punti, ogni esperimento di stimolazione dovrebbe richiedere meno di 1 minuto per funzionare. Ciò consentirà di eseguire molti studi meccanicistici in modo inaccessibile utilizzando tecniche tradizionali come patch-clamp o array di microelettrodi con posizioni di elettrodi predefinite. Inoltre, la dimensione su scala nanometrica dei SiNW utilizzati nel presente documento consente una stimolazione con una risoluzione spaziale estremamente elevata. Per quanto riguarda la risoluzione temporale, sarà determinata dal microscopio utilizzato per l'imaging/simulazione. In questo contesto, l'uso dell'imaging si tradurrà in una bassa risoluzione temporale, questo può essere migliorato utilizzando tecniche di elettrofisiologia più sensibili al tempo, come patch clamp o array di micro-elettrodi. Sebbene i SiNW siano considerati bioassorbibili a lungo termine, non abbiamo mai notato alcuna degradazione evidente entro un periodo di tempo fino a 7 giorni, che ne consentirà l'uso per la maggior parte degli studi in vitro.
Nel complesso, abbiamo utilizzato una tecnica semplice e diretta per eseguire un'indagine bioe elettrica in vitro sulle cellule cardiache. Mostriamo come possiamo studiare il diverso modo in cui le diverse cellule sono accoppiate l'una all'altra e descritto un modo riproducibile per quantificare la propagazione e la velocità del calcio. La tecnica è adattabile ad altri tipi di cellule, nonché a ambienti in vivo ed ex vivo. Si basa sulla microscopia a fluorescenza standard e su un laser accoppiato che sono ampiamente disponibili per i laboratori biomedici standard e non c'è bisogno di apparecchiature specializzate. La tecnica può essere facilmente padroneggiata e può consentire la raccolta di grandi set di dati in tempi minimi, rispetto alle tecniche disponibili.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dall'Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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