Summary
Этот протокол описывает использование кремниевых нанопроводов для внутриклеточной оптической биомодулации клетки простым и простым в работе методом. Техника очень адаптируется к различным типам клеток и может быть использована для in vitro, а также in vivo приложений.
Abstract
Миофибробласты могут спонтанно интернализировать кремниевые нанопроводы (SiNWs), что делает их привлекательной мишенью для биоэлектронного применения. Эти клеточные кремниевые гибриды предлагают бесхитные оптические возможности модуляции с минимальным возмущением к нормальному поведению клеток. Оптические возможности получены по фототермальным и фотоэлектрическим свойствам SiNWs. Эти гибриды могут быть собраны с использованием стандартных методов культуры тканей, а затем применяются к различным биологическим сценариям. Мы демонстрируем здесь, как эти гибриды могут быть использованы для изучения электрической связи сердечных клеток и сравнить, как миофибробласты пара друг с другом или кардиомиоцитов. Этот процесс может быть выполнен без специального оборудования за флуоресцентный микроскоп с соединенной лазерной линии. Также показано использование специально построенной matLAB рутины, которая позволяет количественное распространение кальция внутри и между различными клетками в культуре. Миофибробласты, как показано, имеют более медленный электрический ответ, чем у кардиомиоцитов. Кроме того, межклеточное размножение миофиброласта показывает несколько более медленные, хотя и сопоставимые скорости с их внутриклеточными скоростями, что предполагает пассивное распространение через разрывные соединения или нанотрубки. Этот метод очень адаптируется и может быть легко применен к другим клеточным аренам, для in vitro, а также in vivo или ex vivo исследований.
Introduction
Все биологические организмы используют электричество в виде ионов для регулирования клеточного поведения. Клеточные мембраны содержат различные типы специфических ионных каналов, позволяющих пассивно и активно транспортировать ионы. Эти ионы регулируют функции возбудимых клеток, таких как нейронная активность и скелетная и сердечная соток. Тем не менее, биоэлектричность также играет важную роль в невозбудимых клетках, регулирующих многие клеточные функции,такие как пролиферацией клеток 1,нейроиммунностью 2,3,4и дифференциацией стволовыхклеток 5.
В последние десятилетия область биоэлектричества привлекла все более высокий уровень интереса, что способствовало развитию многочисленных технологий биоэлектронных интерфейсов. Microelectrode патч пипетки являются золотым стандартом внутриклеточной записи и стимуляции6. В этой методологии, стеклянная пипетка вытащил при определенных условиях, чтобы сформировать острый край с поры размером несколько микрон. Эта пипетка заполнена буфером, а пипетка позволяет напрямую контактировать буфера с внутриклеточным объемом. Это приводит к биоэлектрический интерфейс, который дает чрезвычайно высокий сигнал к шуму отношения, точный контроль над клеточной электрической активности, и чрезвычайно высокое временное разрешение. Хотя эта методология является чрезвычайно мощным инструментом, который недавно был сокращен до нано-пипеткиконфигурации 7, это связано с несколькими важными техническими ограничениями. Эффект разбавленияцитозолом 8,а также механические вибрации, ограничивает его полезность краткосрочными допросами, и требует дорогостоящего специализированного оборудования и высокого уровня технических навыков. Кроме того, его громоздкость ограничивает количество клеток, которые могут быть записаны или стимулированы одновременно, и из-за его инвазивности, он не может быть перенастроен на протяжении всего эксперимента. Для преодоления этих ограничений были разработаны массивы микроэлектродов, но размер электродов ограничивает пространственное разрешение, а также внутриклеточный доступ. Nanoelectrode массивы позволяют внутриклеточной записи и стимуляции, но требуют абразивного электропорации для доступа кцитозолу 9,10. Кроме того, все эти методологии связаны субстратами и, таким образом, ограничиваются культурами клеток в пробирке или внешними поверхностными клетками, не имеют доступа к клеткам, которые находятся внутри трехмерной (3D) ткани.
Optogenetics11 широко используется для решения этих 3D и in vivo ограничений. Однако оптогенетические методы основаны на возмущениях светоактивных плазменных мембранных ионных каналов, которые распространяются на плазменной мембране, ограничивая 3Dпространственное разрешение 12 и внутриклеточные возможности.
Недавно мы показали, что кремниевые нанопроводы (SiNWs) могут быть использованы для выполнения внутриклеточного биоэлектрического допроса с субмикроном пространственного разрешения с различными невозбудимыми клетками, а именно сердечными миофибробластами и олигодендроцитами13. Кроме того, мы использовали эти SiNWs для выполнения экс-vivo клеток конкретных допроса в 3D сердечной ткани, чтобы исследовать, как сердечные клетки электрически пара in vivo14. Основным преимуществом этой методологии является ее простота; он не требует каких-либо генетических изменений или громоздких приборов. Многие клетки спонтанно интернализировать фото-реакции SiNWs без необходимости звуковой или электропорации15. Кроме того, они спонтанно избежит эндосомной инкапсуляции и образуют бесшовную интеграцию с цитозолом и внутриклеточнымиорганеллами 13,15. Эти клеточные-SiNWs композиты, называются клеточно-силиконовыми гибридами, обладают динамичным, мягким и универсальным характером оригинальной клетки, а также оптометическими возможностями SiNWs. После гибридизации гибрид cell-SiNW может быть собран с использованием стандартных методов культуры тканей и использован для различных применений, таких как внутриклеточная биоэлектрическая стимуляция; изучение межклеточной биоэлектрической связи в пробирке; и для in vivo ячейки конкретных допросов. Поскольку эффективная стимуляция требует совместной локализации высокой плотности оптической мощности и SiNWs, можно достичь высокого пространственного разрешения как в 2D, так и в 3D. В этом протоколе мы подробно описываем методологию, а также то, как можно анализировать результаты. Основное внимание уделяется внутриклеточному и межклеточному исследованию in vitro, однако внедрение этой методологии может быть непосредственно использовано для многих других биологических сценариев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для обеспечения соблюдения этических стандартов все процедуры для животных, связанные с изоляцией кардиомиоцитов от сердца грызунов, были впервые одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Чикагского университета (IACUC). Кроме того, все эксперименты на животных были проведены в полном соответствии с руководством Чикагского университета IACUC.
1. Подготовка гибридов cell-SiNWs
- Изолировать первичные кардиомиоциты (СМ) с помощью коммерческого комплекта в соответствии с руководящими принципами производителя.
- Подготовка полного DMEM для первичной изоляции клеток дополняется 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% пенициллин-стрептомицин, и 1% L-глутамин.
- Чтобы изолировать миофибробласт (MFs) от подвески MFs-CMs, предварительно пластины изолированных клеток на ткани культуры блюдо (клетки изолированы от 2 сердца от шага 1,1. на 100 мм блюдо) на 1 ч. По мере того как CMs нужно fibronectin или поверхность обработанной коллагена для того чтобы придерживаться, только MFs прикрепят к поверхности культуры ткани.
- Аспирировать обогащенную подвеску клеток CMs. Эти CMs могут быть использованы для гетеро-клеточных экспериментов связи, как описано в разделе 3. Промыть MFs с DMEM для устранения любых оставшихся CMs из MFs блюдо.
- Добавьте свежую культурную среду в MFs и позвольте им размножаться до тех пор, пока они не будут 80% стечены (2-4 дня). Изменение среды через день.
- Когда клетки будут готовы (80% слияние), подготовить SiNWs для гибридизации шаг ниже (шаг 1.7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие типы SiNWs могут быть использованы для этого. В этом эксперименте, SiNWs, которые были выращены путем химического осаждения пара (CVD) с основной оболочки p-i-n конфигурации соединения были использованы, как описаноранее 16. Во время роста CVD, SiNWs выращиваются на кремниевой пластины субстрата, и в конечном итоге хранятся в качестве кремниевых чипов, покрытых SiNWs. - Вырезать 3 мм х 3 мм чип из пластины с CVD выросли SiNWs с помощью алмазного писца. Используйте острые типсы для обработки пластины и свести к минимуму площадь поверхности, которая коснулась с типсами, так как это может сломать SiNWs.
- Стерилизовать чип путем полоскания его с 70% этанола и позволяет этанола высохнуть в течение 30 минут под ультрафиолетовым светом в биобезопасности ламинарного потока капот.
- Перенесите чип в стерильную микроцентрифуговую трубку и промойте излишки этанола с помощью полных культурных средств массовой информации.
- Добавьте 1 мл культурных средств массовой информации и sonicate чип в sonication ванну в течение 1-10 мин. Средства массовой информации должны стать облачно, как SiNWs выпущены в средствах массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время и мощность Sonication должны быть оптимизированы для различных звуковых или различных клеток, так как более короткие продолжительности и более низкие мощности будут приносить больше SiNWs. - Добавить подвеску SiNWs в 5 мл культурных средств массовой информации и семян его на 100 мм ткани культуры блюдо с MFs. Разрешить SiNWs интернализировать в течение 4 ч и промыть избыток SiNWs от 5x со средствами массовой информации. Разрешить частично интернализированных SiNWs для завершения интернализации, позволяя им сидеть еще 1 ч перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные типы клеток могут нуждаться в различных концентрациях SiNWs и/или времени интернализации. - Подготовка раствора коллагенового покрытия путем разбавления раствора коллагенового бульона (3 мг/мл) стерильной уксусной кислотой 20 мМ при соотношении 1:50. Добавьте раствор покрытия 0,5 мл в стеклянное дно 35 мм и дайте ему посидеть 1 ч при 37 градусах Цельсия. Снимите раствор и промойте блюдо стерильным PBS.
- Урожай клеточно-SiNWs гибридов путем лечения клеток с 3 мл трипсина в течение 2 мин при 37 градусов по Цельсию. Добавьте 10 мл культурных средств массовой информации и энергично промойте гибриды трубами. Центрифуга клетки мягко на 200 х г в течение 5 минут, чтобы избежать повреждения клеток с интернализированными SiNWs. Удалите излишки мультимедиа, приостановите клетки с 1 мл мультимедиа и посеять их на коллаген обработанные стеклянные нижней блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гибриды могут быть посеяны в одиночку, для исследования внутриклеточных или межклеточных связи или с CMs для расследования гетеро-клеточных связи в пробирке. - Выполните окончательную проверку интернализации SiNW путем маркировки цитозола клеток (calcein-AM, 4 МКМ) и мембраны (мембранный маркер, 2 МКМ) в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия и визуализации клетки с помощью конфокальные микроскопии. Поскольку SiNWs являются высоко отражающими, отраженный свет может быть использован вместо флуоресценции, чтобы визуализировать их.
2. Подготовка клеток к внутриклеточным и межклеточным исследованиям
- Подготовка раствора коллагенового покрытия, как в 1.12
- Для внутриклеточной электрической стимуляции, гибриды культуры с низкой плотностью посева. Используйте стандартный гемоцитометр для подсчета ячеек из раздела 1.11. и семена 50000 клеток на 35 мм стеклянное дно блюдо в культуре средств массовой информации. Для межклеточных исследований используйте более высокую плотность клеток (500 000 клеток на блюдо). Для межклеточной связи между CMs и MFs, совместно культуры гибридов со свежеисцеленными CMs.
- Разрешить клеткам прикрепляться на ночь перед выполнением экспериментов оптической стимуляции. Для межклеточных исследований, позволяют 48 ч при 37 градусов по Цельсию для клеток, чтобы выразить межклеточный разрыв соединений до проведения эксперимента.
- Подготовка кальция чувствительный раствор красителя (может храниться в -20 градусов по Цельсию), добавив 50 МКЛ DMSO до 50 мкг Fluo-4 AM. Приготовьте окрашивающий раствор, разбавляя 1 мл красителя в 1 мл DMEM.
- Аспирировать культурную среду из клеток и добавить 1 мл окрашивания раствора. Разрешить краситель интернализировать в клетки в течение 20-30 мин при 37 градусов по Цельсию. Аспирировать краситель и промыть дважды стерильным PBS.
- Наконец, добавьте 1 мл предварительно разогретого фенол-красного свободного DMEM Media и позвольте внутриклеточному флуо-4 пройти деэстерификацию в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
- Передача клеток в микроскоп для визуализации и стимуляции.
3. Оптическая визуализация и стимуляция
- Предварительно разогреть увлажненные микроинцубаторы до 37 градусов по Цельсию и пузырь воздуха-CO2 смеси (95:5).
- Используйте микроскоп с коллимированной лазерной линией, соединенной в световой путь для визуализации кальция и оптической стимуляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование конфокального микроскопа является наиболее простым вариантом из-за его возможности стимуляции точки. Тем не менее, эта процедура может быть сделано с помощью любого стандартного флуоресцентного микроскопа путем соединения коллимированного лазерного луча в бесконечность пространства светового пути с помощью пучка сплиттера. Любая цель микроскопа разработана таким образом, что коллимированный лазер, пройаваемый через него, будет направлен на дифракционное ограниченное лазерное пятно на фокусной плоскости. Длина волны лазера должна быть близка к возбуждающей свету, поэтому она будет отражена дихроическим зеркалом и пройдена фильтром возбуждения. - Визуализуйте SiNWs и определите место стимуляции с помощью микроскопии яркого поля, передаваемого света или светоотражающего света. Затем перенастройка пути света в режим флуоресценции, сохраняя при этом точку стимуляции в заранее определенном месте SiNW.
- Проверка оптимальной мощности стимуляции и длины импульса для каждого размера SiNW и типа клеток, чтобы свести к минимуму фототермальное повреждение стимулируемых клеток. Для типичного протокола стимуляции выполните 2-10 с базовой записи внутриклеточной активности кальция. Затем нанесите один лазерный импульс мощностью 1-10 мВт и продолжительностью 1-10 мс (соответствующий 30-300 кВт/мм2),чтобы стимулировать SiNW, и записывают полученную волну кальция еще на 2-10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно оптимизировать оптическую мощность и длину импульса для каждого размера SiNW и клеток. Это необходимо, чтобы свести к минимуму фототермальное повреждение стимулируемых клеток. - Передача записанных фильмов оптической стимуляции, при необходимости, для дальнейшего анализа.
4. Обработка видео
- Визуализуйте изменения флуо-4 флуоресценции с помощьюмакроса 17 dF over F, доступного для ImageJ18,который вычисляет изменение флуоресценции для каждого пикселя и нормализуется средним значением базового уровня покоя. Преобразование вывода (формат плавающей точки) в 8 бит для дальнейшей обработки.
- Обработать фильм dF/F с помощьюселективного медианного фильтра, доступного в ImageJ. Определите параметры для удаления пикселей, где их значение более чем на 10 выше медианного значения в радиусе 2 пикселей, и замените это значение пикселя медианой.
- Рассчитайте оптический поток в каждом кадре с помощью алгоритма Лукаса-Канада, реализованного в арсенале инструментов Matlab Computer Vision. Выходом этой функции было векторное поле, содержащее x- и y-компоненты оптического потока в каждой точке каждого изображения (код доступен в дополнительном файле 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Средний оптический поток внутри клетки, lt;'gt;, соответствует развитию потока кальция внутри клетки. Дифференциал оптического потока, «Lt;»gt; обеспечивает точку времени, в которой была активирована сигнализация кальция, путем определения того, где сигнал был максимизироват. Кроме того, величина йлт; на самом максимуме коррелирует со скоростью, с которой фронт волны кальция прогрессирует через клетку. - Рассчитайте межклеточную скорость передачи кальция в соответствии со следующим уравнением.
vCa2 "r ij / ( tmax,j tmax,i ),
где tmax,j и tmax, i - это время активации ячеек j и i, соответственно, и rij - это расстояние между центроидами клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность этой методологии обеспечить прямой доступ к внутриклеточному цитозолу зависит от спонтанной интернализации SiNW в клетки. Хотя SiNWs будет проходить спонтанную интернализации вомногих типах клеток 15, некоторые клетки, такие как кардиомиоциты и нейроны, потребуется SiNWs для лечения, чтобы ихинтернализации 19. В этом протоколе мы описываем процесс интернализации р-и-н SiNWs с диаметром 200-300 нм и длиной 1-3 мкм в сердечных MFs. Рисунок 1A демонстрирует, как SiNWs появились под передаваемой световой микроскопией. Используя стандартную фазовую контрастную оптику, стеченные клетки были легко очевидны. Тем не менее, SiNWs были едва заметны, что делает их местоположение невозможно определить. Таким образом, мы использовали микроскопию темного поля, где видны только отражающие объекты, а фон темный. В этом контрасте, однако, клетки не могут быть видны, так как они не являются отражающими. Чтобы показать расположение SiNW в клетках, мы накладываем изображения вместе, так что перинуклеарное расположение SiNWs внутри клеток очевидно. Хотя колокализация SiNWs и клеток очевидна, все еще важно проверить, что SiNWs действительно интернализированы внутри клеток, а не опираясь на плазменную мембрану. С этой целью мы использовали конфокальную микроскопию(рисунок 1B), где цитозол был окрашен кальцином-AM (зеленый) и плазменной мембраны с мембранным маркером (красный). Затем было очевидно внутриклеточное расположение SINWs. Обратите внимание, что этот шаг чрезвычайно важен для проверки внутриклеточного расположения SiNWs, особенно при использовании нового типа ячейки (или линии). Однако после того, как интернализация установлена для окрашенных клеток, другие образцы должны быть использованы для процедуры стимуляции. Хотя это не в рамках этой демонстрации, важно также отметить, что в тех случаях, когда SiNWs не интернализированы, биоэлектрические процессы все еще могут быть рассмотрены аналогичным, внеклеточнымспособом 16. После того, как клетки гибридизированы с SiNWs, они могут быть использованы для выполнения биоэлектрических исследований.
Здесь мы демонстрируем использование этой методологии для сравнения гомо-клеточной MF-MF электрической связи с гетеро-клеточной связи MFs с CMs. После того, как клетки были гибридизированы с SiNWs, гибриды были посеяны с CMs и культурных. Важно ограничить время культуры так, чтобы размножающиеся MFs не перенаселены культурой. На рисунке 2 показан репрезентативный пример такого эксперимента. Со-культурные клетки были загружены с кальцием чувствительных красителя (Fluo-4) и клетки были изображены под вращающимся диском конфокального микроскопа. Перед применением любого лазерного импульса, яркое изображение было получено, чтобы определить местоположение SiNW, которые будут стимулироваться. Затем было записано короткое базовое видео, так что спонтанно избиение CMs и отдыха MFs могут быть определены(Дополнительное видео 1 и дополнительное видео 2). В этом эксперименте идентифицированный SiNW стимулировался с помощью однотомного лазерного импульса (640 нм, 1 мс, 4 мВт). Клетки постоянно изображения до и после стимуляции, чтобы визуализировать динамику кальция на оптической стимуляции. Как клетки в культуре значительно отличаются посвоей яркости( Дополнительное видео 1 ), живые видео были обработаны в dF / F видео с синим до красного псевдоцвета (Дополнительное видео 2), так что кальций сигналы будут яснее. В этом методе, каждый пиксель сравнивается с его собственным базовым состоянием отдыха, прежде чем стимуляция была применена. Репрезентативные изображения на рисунке 2C демонстрируют распространение кальция в co-культуре MFs-CMs и могут быть дополнительно проанализированы для изучения межклеточной электрической связи между различными клетками, а также внутриклеточной динамики кальция.
Рисунок 3A демонстрирует способ представления потока кальция всего поля зрения в одном изображении. Анализируя видео dF/F, мы показываем время возбуждения различных клеток, которое определялось точкой, в которой изменение среднего оптического потока достигает своего максимума. Таким образом, можно увидеть, как поток кальция распространяется от клетки к клетке. Специально построенный скрипт MATLAB(Дополнительный файл 1) был написан и использован для расчета оптического потока и для определения времени активации в каждой области ячейки(рисунок 3B). Скорость межклеточного распространения может быть определена путем измерения расстояния между центроидами каждой клетки и деления на разницу во времени в их активации. Аналогичный анализ может быть проведен, который заменяет расстояние числом переходов; для наших целей метрика расстояния более точно представляет скорость передачи, поскольку она также объясняет время, проведенное во внутриклеточном распространении, которое не является незначительным. Рисунок 3C демонстрирует, как определялись внутриклеточные скорости: для каждой клетки была нарисована линия в направлении распространения кальция, а кимограф был создан путем построения профиля времени интенсивности вдоль этой линии. В кимографе мы вписываем линию к передней части волны активации, так что наклон линии представляет обратную скорость внутриклеточного распространения. Рисунок 3D обобщает различные скорости (межклеточные и внутриклеточные) для различных клеток в совместной культуре. Все данные, представленные на этом графике, были получены на основе единого видео одного репрезентативного поля зрения, представленного здесь.
Рисунок 1: SiNWs интернализированы в MFs. (A)Фазовое контрастное изображение MFs, обработанных SiNWs, показывает стеченные клетки (слева). На изображении Darkfield показаны SiNWs, рассеянные в поле зрения (средний), в то время как назимирование двух изображений (справа) показывает перинуклеарное расположение SiNWs в пределах MFs. Шкала баров составляет 20 мкм.(B) Представитель конфокального изображения (слева, шкала бар составляет 10 мкм) и 3 различных n-z поперечных сечений, что соответствует 3 пунктирной линии (справа, шкала баров 5 мкм) показывают внутреннюю часть MF и SiNW, которые явно внутри цитозола. Цитозол зеленый (Calcein-AM), мембрана красная (клеточная маска), и SiNWs белый (отражение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Распространение кальция в совместной культуре MF-CM. (A)Иллюстрация типичного эксперимента стимуляции. MFs с интернализированными SiNWs стимулируются лазерным импульсом, в то время как поток кальция контролируется чувствительным к кальцию красителем. (B)Яркое полевое изображение клеток показывает интернализированный SiNW внутри одного из MFs (слева) и репрезентативное изображение флуоресценции красителя кальция (справа). Стимулируемый SiNW выделяется розовой наконечником стрелы. (C) Со-культура MFs и CMs была загружена с кальцием чувствительных красителя и SiNW стимулировали с лазерным импульсом (640 нм, 1 мс, 4 мВт). Поток кальция контролировался интенсивностью Fluo-4 (верхние изображения), и из него было получено видео dF/F (нижние изображения). Алгоритм dF/F делает визуализацию потока кальция яснее, так как он сравнивает интенсивность каждого пикселя со своим собственным базовым уровнем, показывая тем самым изменение, а не фактическую интенсивность. Шкала баров составляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ PF dF / F видео с рисунка 2. (A) распространение кальция может быть визуализировано с помощью оптического картографического изображения, где цветовые коды для времени пиксель был взволнован (имеется в виду увеличение концентрации кальция и Флуо-4 относительной интенсивности). Оптическое отображение может быть сделано для различных временных рамок, т.е. короткие (1,1 с, верхнее изображение) или больше (5,5 с, нижнее изображение) продолжительности. Шкала баров составляет 20 мкм.(B) Репрезентативные примеры для расчета скорости передачи клеток-клеток. Обе ячейки MFs здесь, но те же вычисления могут быть выполнены с передачей MF-CM. На графиках видны следы среднего оптического потока (среднего) и дифференциала (внизу) для каждой ячейки. Передача клеток-клеток может быть рассчитана с использованием Tmax для обеих клеток, а также их центроидов, как описано в тексте. Красные звездочки обозначают два СМ с ограниченным соединением MF-CM и, следовательно, отсутствием реакции на оптическую стимуляцию. Шкала баров составляет 20 мкм. (C) внутриклеточная скорость потока кальция MFs была получена из склона кимографа, генерируемого нарезкой цветных линий. Кимографы представляют интенсивность вдоль линии (x оси) и времени (у оси), так что более крутые склоны соответствуют более высоким скоростям. Шкала баров составляет 20 мкм.(D) MFs-MFs и MFs-CMs межклеточных скоростей, а также МФ "внутриклеточных скоростей могут быть получены из B и C соответственно и построен для сравнения (p-value'lt;0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительное видео 1: Эффект гибридной оптической стимуляции MF-SiNW от Fluo-4. Скорость CMs иллюстрируется до и после стимуляции для сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Справа нажмите, чтобы загрузить.)
Дополнительное видео 2: Влияние гибридной оптической стимуляции MF-SiNW с помощью видео dF/F, полученного из видео Fluo-4. Скорость CMs иллюстрируется до и после стимуляции для сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Справа нажмите, чтобы загрузить.)
Дополнительная цифра Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали здесь простой способ выполнения внутриклеточной электрической стимуляции клеток. В этой демонстрации, мы использовали MFs, которые были prehybridized с SiNWs, а затем совместно с CMs. В целом, большинство размножающихся клеток имеют тенденцию к интернализации SiNWs, что позволяет использовать эту методологию со многими другими типами клеток. Более того, пока мы демонстрировали внутриклеточную стимуляцию клеток, те же принципы можно использовать для выполнения внеклеточной стимуляции клеток. Это может быть сделано путем блокирования эндосомныхкаскадов 15 клеток, которые будут спонтанно усвоить их, или с помощью клеток, которые не усвояют SiNWs. Например, хотя CMs было установлено, интернализировать некоторыенаноструктуры 20,21, они не спонтанно интернализировать SiNWs15. Используемые здесь SiNWs были синтезированы с помощью химического парового осаждения (CVD). Обратитесь к дополнительным ресурсам, касающимся подробной процедуры синтеза SiNWs, которые можно найти в другомместе 16. После получения SiNWs, их обработка и использование просты, и не требуют каких-либо сложных или дорогостоящее оборудование, которое не легко доступны в стандартной био-медицинской лаборатории. SiNWs можно легко увидеть с помощью стандартной микроскопии темного поля(рисунок 1), что делает его легким для пользователя, чтобы следить за процессом интернализации и определить соответствующую концентрацию SINW и продолжительность лечения, что необходимо для успешной интернализации. Также настоятельно рекомендуется определить точное окончательное местоположение SiNWs после завершения шага интернализации. Это может быть сделано с помощью коммерчески доступных красителей, используемых для живых мертвых анализов (таких, как Calcein-AM, используется здесь) и конфокальные микроскопии (Рисунок 1B). Этот шаг важен, когда впервые используется другая линия ячеек, и взаимодействие ячейки с SiNW неясно. Различные клетки могут интернализировать SiNW при различных условиях, т.е. времени, концентрации и распределения размеров. Однако, после того, как процесс интернализации характеризуется для данной клетки, эта процедура проверки может быть пропущена при выполнении механистических биоэлектрических исследований.
После того, как клетки гибридизированы с SiNWs, они могут быть собраны стандартными методами культуры тканей и использованы для биоэлектрических исследований. В этом протоколе, мы использовали MFs-SiNWs гибриды для изучения того, как MFs электрически пара с другими MFs, или CMs in vitro. Тем не менее, важно отметить, что эта процедура может быть использована для выполнения анализов in vivo, а также. Например, в предыдущем исследовании, проведенном в нашей лаборатории, мы использовали эту методологию, чтобы изучить, как MFs электрически пара CMs in vivo и сравнить это с их соединением in vitro14. Поскольку этот процесс требует дополнительных технических возможностей, он не описан в этом протоколе, но подробности можно найти в нашем предыдущем исследовании. Здесь мы покажем, как гибридные клетки могут быть использованы, чтобы узнать, как кальций размножается внутри- и межклеточно в рамках совместной культуры (Рисунок 2A). Для начала эксперимента, расположение SiNW определяется для стимуляции тока. Хотя SiNWs едва видны с помощью фазового контраста, важно отметить, что стандартное яркое поле (без фазы или контраста темного поля) также позволит их визуализации (Рисунок 2B), без необходимости флуоресцентной маркировки или специализированных методов микроскопии. После выявления SiNW интерес, можно применить оптический импульс для электрического стимулирования клетки. Перед тем, как стимуляция применяется, базовая запись клеток показывает спонтанную электрическую активность в четырех различных группах СМ, которые, как представляется, несинхронизированы в их электрической активности (Дополнительное видео 1 И Дополнительное видео 2). Кроме того, 8 различных MFs без спонтанной электрической активности можно увидеть. Репрезентативные красители кальция и изображения dF/F показывают распространение кальция по всей культуре при оптической стимуляции (Рисунок 2CИ Дополнительное видео 1 И Дополнительное видео 2). Эти живые видео могут быть дополнительно проанализированы, чтобы узнать электрическое соединение различных клеток в поле зрения (Рисунок 3). Во-первых, оптическое отображение видео (Рисунок 3A) показывает последовательность клеток, которые стимулируются оптическим импульсом. Диапазоны времени справа относительно первого кадра после применения оптической стимуляции. Поскольку реакция CMs на стимуляцию намного быстрее, чем реакция MFs, мы выполнили оптическое отображение дважды, с различными сроками. Первый был выполнен, чтобы показать быстрый ответ CMs, так что цветовой диапазон охватывает 1,1 с после стимуляции. Это показывает порядок, в котором различные CMs и первые MFs рады стимуляции. Однако, поскольку есть MFs, которые находятся дальше вниз по течению пути распространения, их возбуждение сроки не отображаются в этом отображении. Таким образом, тот же анализ проводился в течение более длительного периода времени, что дает меньше информации о первоначальном ответе, но ясно демонстрирует время задержки и более медленную реакцию MFs, которые находятся ниже по течению от места возбуждения. Используя наш алгоритм, разработанный на заказ, мы смогли обеспечить воспроизводимый количественный анализ максимального времени потока кальция, который мы использовали в качестве эталона, наряду с расстоянием клетки от стимуляции, чтобы определить скорость межклеточного распространения этой клетки. Это было выполнено как на CMs, так и на MFs, так что явная разница между пассивным (MF-MF) и усиленным (MF-CM) распространение может быть измерена. Кроме того, можно четко показать, что электрическая активность двух СМ (красных звездочек в Рисунок 3B) не зависят от оптической стимуляции. Это можно объяснить тем фактом, что не все клетки в равной степени связаны друг с другом в рамках культуры. Этот метод позволяет пользователю определить, какие клетки в поле зрения действительно связаны с стимулировали клетки, а какие нет. Кроме того, мы смогли определить направление распространения в каждой ячейке и установить параллельную линию, которая использовалась для получения кимографа, описывающего распространение внутри этой клетки. Это было использовано для определения внутриклеточной скорости потока кальция, в соответствии с наклоном кимографа (Рисунок 3C). Когда были составлены все внутриклеточные и межклеточные скорости, стало ясно, что реакция CMs была значительно быстрее, чем реакция MFs на оптическую стимуляцию. Одновременно были обнаружены внутриклеточные скорости MFs немного быстрее, но сопоставимы со скоростью межклеточного распространения MF-MF. Это наблюдение показывает, что в отличие от усиленных электрических соединений между MFs к CMs, межклеточная электрическая связь между MFs является пассивной, и на основе диффузии кальция через внутриклеточный объем, а затем межклеточный разрыв-соединения22,23 или туннелирование нанотрубок24, действуя как узкое место, которое замедляет скорость распространения. Способность SiNWs превести оптическую стимуляцию к биоэлектрическому допросу может быть отнесена к фотоанодичной и фотокатодической реакции на p-n соединении SiNWs, или к фототермальной реакции из-за низкой теплоемкости SiNWs13. Хотя другие наномасштабные частицы могут привести к оптической стимуляции25, они, как правило, инкапсулированы в эндосомный конверт26, ограничивая их способность напрямую взаимодействовать с внутриклеточными органеллами для местного допроса. Важно понимать, что высокая оптическая плотность стимуляции может привести к повреждению клеток из-за фототермального эффекта. Таким образом, важно оптимизировать мощность и длину импульса, чтобы избежать такого эффекта. Однако, для чувствительных клеток, можно изучить, как кальций распространяется между другими клетками в культуре, даже если местные тепловые повреждения применяются к стимулировали клетки.
Другим ключевым аспектом этой методологии анализа является то, что все данные, показанные на рисунке 3D, были собраны из одного видео одного поля зрения в рамках этой культуры. Несмотря на использование одной области зрения, собранные данные по-прежнему являются достаточно сильными для получения статистической значимости, что свидетельствует о прочности и эффективности этой методологии. Для анализа и изучения более деликатных и тонких эффектов гораздо больший набор данных может быть легко создан путем стимулирования других клеток в рамках той же культуры. Для стеклянного дна блюдо с эффективным диаметром 10 мм, можно найти более 2000 полей зрения для анализа. Как простая точка лазерной стимуляции должна быть установлена, каждый эксперимент стимуляции должно занять менее 1 минуты для выполнения. Это позволит проводить многие механистические исследования таким образом, чтобы они были недоступны с использованием традиционных методов, таких как патч-зажим, или микроэлектродный массив с предопределенными положениями электродов. Кроме того, наномасштабный размер SiNWs, используемых в настоящем, позволяет стимуляции с чрезвычайно высоким пространственным разрешением. Что касается временного разрешения, то оно будет определяться микроскопом, используемым для визуализации/моделирования. В этом контексте, использование изображений приведет к низкому временному разрешению, это может быть улучшено с помощью более чувствительных к времени методов электрофизиологии, таких как патч зажим или микро-электродов массивов. Хотя SiNWs считаются биоабсорбируемыми в долгосрочной перспективе, мы никогда не замечали заметной деградации в течение 7 дней, что позволит использовать его для большинства исследований in vitro.
В целом, мы использовали простую и прямую технику для выполнения в пробирке биоэлектрического исследования сердечных клеток. Мы показываем, как мы можем изучать различные способы различных клеток связаны друг с другом и описал воспроизводимый способ количественной оценки распространения кальция и скорости. Техника адаптируется к другим типам ячеек, а также к настройкам in vivo и ex vivo. Он основан на стандартной микроскопии флуоресценции и соединенном лазере, которые широко доступны для стандартных биомедицинских лабораторий, и нет необходимости в специализированном оборудовании. Техника может быть легко освоен и может позволить сбор больших наборов данных в минимальное время, по сравнению с доступными методами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Управлением научных исследований ВВС (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
