प्रोटीन के उच्च क्रम संरचनात्मक विश्लेषण करने के लिए लेजर-मुक्त हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल फ्लैश ऑक्सीकरण प्रोटीन पदचिह्निंग करने के लिए इनलाइन कट्टरपंथी डोसिमेट्री और प्लाज्मा प्रकाश स्रोत का उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह विधि प्रोटीन अध्ययन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण की प्रजनन क्षमता को सरल और बेहतर बनाने के लिए खतरनाक यूवी लेजर की जगह ले।
Abstract
हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) एक उभरती हुई और आशाजनक उच्च क्रम संरचनात्मक विश्लेषण तकनीक है जो प्रोटीन संरचना, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, या प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन में परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान करती है। एचआरपीएफ हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स(▪ओह) का उपयोग करता है ताकि प्रोटीन की विलायक सुलभ सतह को अपरिवर्तनीय रूप से लेबल किया जा सके। एचआरपीएफ प्रदर्शन की अंतर्निहित जटिलता, लागत और खतरनाक प्रकृति ने बायोफार्मा में व्यापक आधारित गोद लेने को काफी हद तक सीमित कर दिया है। इन कारकों में शामिल हैं: 1) जटिल, खतरनाक और महंगे लेजर का उपयोग जो पर्याप्त सुरक्षा सावधानियों की मांग करते हैं; और 2) एचआरपीएफ की अपरिवर्तनीयता ▪ओह की पृष्ठभूमि मैला ढोने के कारण है कि तुलनात्मक अध्ययन सीमा । यह प्रकाशन लेजर-मुक्त एचआरपीएफ सिस्टम के संचालन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह लेजर-मुक्त एचआरपीएफ सिस्टम इन-लाइन रेडिकल डोसिमेट्री के साथ उच्च ऊर्जा, उच्च दबाव प्लाज्मा प्रकाश स्रोत फ्लैश ऑक्सीकरण तकनीक का उपयोग करता है। प्लाज्मा प्रकाश स्रोत सुरक्षित है, उपयोग करने में आसान है, और लेजर आधारित एचआरपीएफ सिस्टम की तुलना में हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स पैदा करने में अधिक कुशल है, और इन-लाइन कट्टरपंथी डोसिमेटर अध्ययन की पुनरुत्पादन क्षमता को बढ़ाता है। संयुक्त, लेजर मुक्त HRPF प्रणाली पते और उल्लेख कमियों और लेजर आधारित तकनीकों की सीमाओं surmounts ।
Introduction
प्रोटीन संरचना और संबद्ध उच्च क्रम संरचना (एचओएस) उचित जैविक कार्य और गुमराह व्यवहार1के प्रमुख निर्धारक हैं। यही बात बायोफार्मास्युटिकल्स पर भी लागू होती है, जिनकी संरचना और कार्यात्मक गतिविधि उनके उत्पादन और पर्यावरण के विभिन्न पहलुओं पर निर्भर करती है। एचओएएस में बायोफार्मा परिवर्तन को प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाओं (एडीआर) से जोड़ा गया है जो अवांछनीय फार्माकोलॉजी और रोगी इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रिया2,3के लिए जिम्मेदार है। एडीआर की उपस्थिति ने बायोफार्मा उद्योग को जैव चिकित्सा की सुरक्षा और प्रभावकारिता में प्रोटीन एचओएस की महत्वपूर्ण भूमिका के लिए सतर्क कर दिया है, और उन्होंने नए और बेहतर एचओएस एनालिटिक्स 4 की आवश्यकतास्थापितकी है।
हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) प्रोटीन एचओएएस में बदलाव को ट्रैक करने के लिए एक आशाजनक तकनीक है। एचआरपीएफ में प्रोटीन के बाहरी हिस्से की अपरिवर्तनीय लेबलिंग शामिल है जिसमें ▪ओह के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के साथप्रोटीन5,6, 7की सॉल्वेंट सुलभ सतह की पहचान करने के लिए पीछा कियाजाताहै । एचआरपीएफ का सफलतापूर्वक उपयोग प्रोटीन एचओएस और इसके कार्य 8,9में दोषों का पता लगाने के लिए किया गया है , जिसमें मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) 10 ,11,12,13के होस की विशेषता है, जो लिगांड 14 के बाध्यकारी केडी और15,16,17,18,19से अधिक का निर्धारण करता है । एचआरपीएफ के लिए ओह ▪उत्पन्न करने के लिए एक आम तरीका फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण ऑफ प्रोटीन (एफओपी) है, जो एच 2ओ2के फोटोलिसिस से ▪ओह का उत्पादन करने के लिए उच्च ऊर्जा, तेज यूवी लेजर को रोजगार देता है। अधिकांश भाग के लिए, FPOP खतरनाक गैस (KrF) को नियोजित करने वाले महंगे एक्सिमर लेजर का उपयोग करता है जो श्वसन और आंख की चोट20से बचने के लिए पर्याप्त सुरक्षा उपायों की मांग करता है। साँस लेने के खतरों से बचने के लिए, दूसरों आवृत्ति चार गुना नियोडिमियम yttrium एल्यूमीनियम गार्नेट (Nd: YAG) लेजर21,जो विषाक्त गैस के उपयोग को समाप्त करता है, लेकिन अभी भी महंगा कर रहे हैं, महत्वपूर्ण परिचालन विशेषज्ञता की आवश्यकता है, और व्यापक आवारा प्रकाश नियंत्रण की मांग करने के लिए आंख की चोट से उपयोगकर्ताओं की रक्षा का इस्तेमाल किया है ।
हालांकि एचआरपीएफ का उपयोग करके पर्याप्त जानकारी प्राप्त की जा सकती है, लेकिन बायोफार्मा में व्यापक दत्तक ग्रहण पूरा नहीं किया गया है। सीमित एचआरपीएफ अपनाने के लिए दो बाधाओं में शामिल हैं: 1) खतरनाक और महंगे लेजर का उपयोग जो पर्याप्त सुरक्षा सावधानियों की मांग करते हैं20; और 2) एचआरपीएफ की अपरिवर्तनीयता ▪ओह की पृष्ठभूमि मैला ढोने के कारण है कि सीमा तुलनात्मक अध्ययन22. लेजर उपयोग को हटाना, एक उच्च गति, उच्च ऊर्जा प्लाज्मा फ्लैश फोटोलिसिस इकाई को सुरक्षित रूप से फेसियल तरीके से एफओपीओपी करने के लिए विकसित किया गया था। एचआरपीएफ प्रयोगों की अपरिवर्तनीयता में सुधार करने के लिए, वास्तविक समय कट्टरपंथी दोसिमेत्री को लागू किया जाता है।
एचआरपीएफ का अभ्यास ओएच22 ▪की पृष्ठभूमि में मैला ढोने के लिए जिम्मेदार अप्रतिदक्षिणता से सीमित रहा है । जबकि ▪ओह प्रोटीन स्थलाकृति के उत्कृष्ट जांच कर रहे हैं, वे भी कई तैयारी में पाया घटकों के साथ प्रतिक्रिया, यह आवश्यक एक लक्ष्य प्रोटीन ऑक्सीकरण के लिए उपलब्ध कट्टरपंथी की प्रभावी एकाग्रता को मापने के लिए कर रही है । बफर तैयारी, हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता, लिगांड गुण, या फोटोलिसिस में भिन्नता के परिणामस्वरूप नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच ऑक्सीकरण मतभेद हो सकते हैं जो एचओएस अंतर अध्ययनों में अस्पष्टता पैदा करते हैं। वास्तविक समय कट्टरपंथी डोसिमेट्री के अलावा ओह लोड ▪ प्रभाव के समायोजन में सक्षम बनाता हैऔर इसलिए एक HRPF प्रयोग के दौरान आत्मविश्वास और प्रजनन क्षमता बढ़ जाती है । एफओपी में कट्टरपंथी दोसिमेट्री के उपयोग का वर्णन23 , 24,25अन्य जगहों पर किया गया है और हाल ही में26के एक प्रकाशन में इस पर विस्तार से चर्चा की गई है । यहां, हम एक उपन्यास फ्लैश फोटोलिसिस सिस्टम और रीयल-टाइम डोसिमेट्री के उपयोग का वर्णन करते हैं ताकि घोड़े-मायोग्लोबिन (एंब) को लेबल किया जा सके, एक एक्सीमर लेजर का उपयोग करते समय प्राप्त एफओपी प्रयोग में पेप्टाइड ऑक्सीकरण के स्तर की तुलना करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
किसी भी एचआरपीएफ प्रयोग के दौरान प्रोटीन की उचित लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए गए हैं । सबसे पहले, एक उपयुक्त प्रवाह दर और स्रोत फ्लैश दर का चयन किया जाता है ताकि नमूने के प्रत्ये…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (R43GM125420 और R44GM125420) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
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