Huella De Proteína De Radicales Hidroxilo Libre De Láser Para Realizar Análisis Estructurales De Orden Superior De Proteínas
Summary
Este protocolo presenta un método para utilizar dosimetría radical en línea y una fuente de luz plasmática para realizar la huella de proteínas de oxidación flash. Este método reemplaza el peligroso láser UV para simplificar y mejorar la reproducibilidad de la oxidación fotoquímica rápida de los estudios de proteínas.
Abstract
La huella de proteína radical hidroxilo (HRPF) es una técnica de análisis estructural de orden superior emergente y prometedora que proporciona información sobre los cambios en la estructura de la proteína, las interacciones proteína-proteína o las interacciones proteína-ligando. HRPF utiliza radicales hidroxilo(▪OH) para etiquetar irreversiblemente la superficie accesible del disolvente de una proteína. La complejidad inherente, el costo y la naturaleza peligrosa de la realización de HRPF han limitado sustancialmente la adopción de base amplia en la biofarmacia. Estos factores incluyen: 1) el uso de láseres complicados, peligrosos y costosos que exigen precauciones de seguridad sustanciales; y 2) la irreproducibilidad de HRPF causada por el barrido del fondo de ▪OH que limitan estudios comparativos. Esta publicación proporciona un protocolo para el funcionamiento de un sistema HRPF libre de láser. Este sistema HRPF libre de láser utiliza una tecnología de oxidación flash de fuente de luz de plasma de alta energía y alta presión con dosimetría radical en línea. La fuente de luz plasmática es más segura, más fácil de usar y más eficiente en la generación de radicales hidroxilo que los sistemas HRPF basados en láser, y el dosímetro radical en línea aumenta la reproducibilidad de los estudios. Combinado, el sistema HRPF sin láser aborda y supera las deficiencias y limitaciones mencionadas de las técnicas basadas en láser.
Introduction
La conformación de las proteínas y la estructura de orden superior (HOS) asociada son los principales determinantes de la función biológica adecuada y el comportamiento aberrante1. Lo mismo se aplica a los productos biofarmacéuticos, cuya estructura y actividad funcional depende de diversos aspectos de su producción y entorno. El cambio biofarmacéutico en el SCA se ha relacionado con reacciones adversas a fármacos (ADR) atribuidas a la farmacología indeseable y a la respuesta inmunológica del paciente2,3. La aparición de los ADR ha alertado a la industria biofarmacéutica sobre el papel crítico que juega la proteína HOS en la seguridad y eficacia de la bioterapéutica, y han establecido la necesidad de nuevos y mejorados análisis de HOS4.
La huella de proteína radical hidroxilo (HRPF) es una técnica prometedora para rastrear el cambio en la proteína HOS. Hrpf implica el etiquetado irreversible del exterior de una proteína con ▪OH seguido de espectrometría de masas (MS) análisis para identificar la superficie accesible solvente de la proteína5,6,7. Hrpf se ha utilizado con éxito para detectar defectos en la proteína HOS y su función8,9,caracterizar el HOS de anticuerpos monoclonales (mAb)10,11,12,13,determinar la unión Kd de un ligando14,y mucho más15,16,17,18,19. Un método común para generar el ▪OH para HRPF es la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP), que emplea láseres UV rápidos y de alta energía para producir ▪OH a partir de la fotólisis deH2O2. En su mayor parte, FPOP utiliza costosos láseres excímeros que emplean gas peligroso (KrF) que exige protecciones sustanciales para evitar lesiones respiratorias y oculares20. Para evitar los peligros de inhalación, otros han utilizado láseres de granate de aluminio de neodimio cuadruplicadodefrecuencia (Nd: YAG), que elimina el uso de gases tóxicos pero siguen siendo costosos, requieren una experiencia operativa significativa y exigen amplios controles de luz extraviada para proteger a los usuarios de lesiones oculares.
Aunque se puede obtener amplia información utilizando HRPF, no se ha cumplido una amplia adopción en la biofarmacéutica. Dos barreras para la adopción limitada de HRPF incluyen: 1) el uso de láseres peligrosos y costosos que exigen precauciones de seguridad sustanciales20; y 2) la irreproducibilidad de la FCR causada por el barrido de fondo de ▪OH que limitan los estudios comparativos22. Para suplantar el uso del láser, se desarrolló una unidad de fotólisis de flash de plasma de alta velocidad y alta energía para realizar FPOP de forma segura de una manera fácil. Para mejorar la irreproducibilidad de los experimentos de HRPF, se implementa la dosimetría radical en tiempo real.
La práctica de HRPF ha sido limitada por la irreproducibilidad atribuida al barrido del fondo de ▪OH22. Mientras que ▪OH son sondas excelentes de la topografía de la proteína, también reaccionan con muchos componentes encontrados en preparaciones, haciéndole necesario medir la concentración eficaz de radical disponible para oxidar una proteína de la blanco. Las variaciones en la preparación del tampón, la concentración de peróxido de hidrógeno, las propiedades del ligando o la fotólisis pueden resultar en diferencias de oxidación entre los grupos de control y experimentales que crean ambigüedad en los estudios diferenciales de HOS. La adición de dosimetría radical en tiempo real permite el ajuste del efecto ▪carga de OH y, por lo tanto, aumenta la confianza y la reproducibilidad durante un experimento de HRPF. El uso de la dosimetría radical en FPOP se ha descrito en otra parte23,24,25,y se discute más detalladamente en una publicación reciente26. Aquí, se describe el uso de un nuevo sistema de fotólisis flash y dosimetría en tiempo real para etiquetar la apo-mioglobina equina (aMb), comparando los niveles de oxidación de péptidos en un experimento FPOP a la de obtenido cuando se utiliza un láser excímero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos para asegurar el etiquetado adecuado de las proteínas durante cualquier experimento hrpf. En primer lugar, se selecciona un caudal adecuado y un tipo de inflamación de la fuente para asegurarse de que cada bolo de la muestra se irradia una vez. Esto asegura que la proteína se expone a un solo bolo de ▪oh recién formado. Una vez que una proteína se oxida, la estructura de la proteína de orden superior puede ser alterada. Para estar seguro de que la estructura de la proteína n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R43GM125420 y R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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